Download - Induksi Beta Galaktosidase
Laporan Biokimia
INDUKSI BETA GALAKTOSIDASE
Nama : Ansori Muchtar
NIM : 10510071
Kelompok : 05
Tanggal Praktikum : 04 April 2013
Tanggal Laporan : 11 April 2013
Asisten: Raden Prima Hari Febrian
Laboratorium Biokimia
Program Studi Kimia
Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Teknologi Bandung
2013
INDUKSI BETA GALAKTOSIDASE
I. Tujuan
Menentukan aktivitas beta oksdase dari E. Coli menggunakan teknik
spektrofotometri.
II. Teori Dasar
Pengendalian metabolisme pada dasarnya adalah pengendalian
aktivitas atau sintesis enzim-enzim kunci pada jalur metabolisme. Salah
satu contoh klasik pengendalian sintesis enzim adalah lac operon. Operon
adalah beberapa gen struktur yang diekspresikan oleh satu promoter yang
sama. Operon dibagi menjadi beberapa macam, salah satunya adalah lac-
operon. Lac-operon adalah operon yang dibutuhkan pada metabolisme
laktosa pada bakteri E.Coli.
Pada percobaan ini, kultur E.coli ditumbuhkan dulu dalam media
(NB) yang berisi berbagai gula yang berbeda-beda. Gula-gula tersebut
dijadikan sumber energi bakteri selama inkubasi semalaman. Sebagai
substrat, tidak digunakan laktosa, melainkan ONPG (orthonitrophenyl-β-
D- galaktosides), suatu senyawa β-galaktosida. Setelah ONPG dipotong
oleh enzim β-galaktosidase, akan dihasilkan ONP (orthonitrophenol) yang
berwarna kuning (λmaks = 420 nm). Dengan demikian, penentuan efek
induksi gula pada sintesis β-galaktosidase dapat ditentukan dengan
metode spektrofotometri.
III. Data Pengamatan
Adsorban t inkubasi (min) 0 10 20 30 40 OD
Medium 1 0.062 0.16
4
0.084 0.175 0.04
8
0.691
Medium 2 0.073 0.23
5
0.096 0.104 0.02
3
0.562
Medium 3 0.077 0.08
6
0.068 0.062 0.09
6
0.597
V =1.060 mL
Media 1: NB
Media 2: NB+laktosa
Media 3: NB+laktosa+glukosa
IV. Pengolahan Data
0 5 10 15 20 25 30 35 40 450
0.10.20.3
kurva waktu terhadap ad-sorban
medium 1medium 2medium 3
waktu (menit)
adso
rban
Aktivitas enz ℑ=A420
t inkubasi ×V kultur ×OD600
untuk t = 10 menit maka,
Aktivitas enzim= 0.164
10 menit ×1.060 ×10−3 L ×0.691=22.3909 menit−1 L−1
sehingga aktivitas enzim dari medium dan waktu inkubasi lain adalah
sebagai berikut:
Mediu
m
t inkubasi 0 10 menit 20 menit 30 menit 40 menit
1 0 22.3903 5.734102 7.96403 1.638315
2 0 39.44806 8.057477 5.819289 0.965219
3 0 13.58996 5.372776 3.265805 3.792548
0 5 10 15 20 25 30 35 40 450
10
20
30
kurva aktivitas enzim terhadap waktu
medium 1medium 2medium 3
waktu (menit)
akti
vita
s en
zim
V. Pembahasan
Pada percobaan ini dilakukan pengukuran aktivitas beta
galaktosidase dengan metoda spektrofotometri. Enzim β-galaktosidase
adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis β-galaktosida seperti
laktosa menjadi galaktosa dan glukosa. Enzim β-galaktosidase bekerja
dengan cara memotong ikatan β-glikosidik antara galaktosa dan suatu
komponen organik lain. Penamaan enzim β-galaktosidase ditentukan juga
oleh substrat yang akan dihidrolisis. Jika substrat yang dihidrolisis adalah
laktosa menjadi galaktosa dan glukosa enzim β-galaktosidase tersebut
adalah laktase.
β-galaktosidase merupakan suatu enzim induktif yaitu enzim yang
tidak selalu diproduksi namun perlu ada suatu senyawa penginduksi
(hormon ataupun substrat). Substrat penginduksi β-galaktosidase tidak
lain adalah laktosa. Enzim merupakan suatu protein yang diproduksi oleh
gen melalui regulasi tertentu. Suatu unit terkoordinasi yang terlibat dalam
ekspresi gen disebut dengan operon. Salah satu operon yang dikenal
adalah lac operon (lactose operon).
Lac operon terdiri dari 2 bagian besar, yaitu gen regulator dan gen struktural.
Tiga gen struktural pada lac operon:
lacZ: mengkode β-galaktosidase
lacY: mengkode β-galaktosidase permease, protein transpor yang terikat pada
membran dan memompa laktosa ke dalam sel
lacA: mengkode β-galaktosidase transasetilase, enzim yang mentransfer
gugus asetil dari asetil-CoA kepada β-galaktosidase
Pada katabolisme laktosa hanyaanya lacZ dan lacY yang diperlukan.
Pada penentuan aktivitas dari beta galaktosa dilakukan dengan substrat
pengganti yaitu ONPG. Hal ini dilakukan karena laktosa yang dihasilkan
tidak berwarna dalam artian tidak menyerap pada sinar tampak sehingga
tidak dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Oleh karena
itu digunakan ONPG yang dapat dihidrolisa dengan enzim yang sama
menghasilkan larutan berwarna ONP, sehingga pengukuran dapat
dilakukan pada panjang gelombang 420 nm. Reaksi ONPG dengan beta
galaktosidase adalah sebagai berikut:
Enzim yang digunakan di isolasi dari bakteri Escherecia Coli. Dinding dari
bakteri dilisis menggunakan SDS dan alkohol teknis sehingga enzim dapat
keluar melalui dinding sel. Kerja dari enzim sangat optimum pada suhu
tubuh akan tetapi kondisi lingkungan pada praktikum tidak sesuai dengan
suhu tubuh sehingga dilakukan modifikasi lingkungan dengan cara
penambahan buffer Z dan diinkubasi pada suhu 37 derajat celcius. Selain
itu faktor lain yang mempengaruhi kerja enzim adalah pH. Enzim tertentu
memiliki pH optimum tertentu pula perubahn pH yang sangat drastis dapat
mempengaruhi kerja enzim. Pada percobaan ini kerja enzim dihentikan
dengan penambahan natrium karbonat sehingga pH berubah drastis
menjadi sangat basa. Selain itu untuk menghentikan kerja enzim juga
media dimasukkan ke penangas es sehingga suhu menjadi turun mendekati
nol dan kinetika reaksi enzim menjadi berkurang.
Adanya tambahan glukosa mengubah regulasi lac operon menjadi
suatu mekanisme regulasi yang dikenal dengan catabolite repression.
Dalam kata lain, kehadiran glukosa menghambat ekspresi gen struktural
yang dibutuhkan dalam metabolisme laktosa. Regulasi ini dimediasi oleh
cAMP sebagai protein koaktivator dan aktivator CAP dan CRP sebagai
reseptor. Glukosa dalam jumlah kecil meningkatkan jumlah cAMP yang
terikat pada CRP sehingga meningkatkan ekspresi dari lac operon yang
berujung pada ekspresi gen struktural dengan adanya laktosa. Sebaliknya
glukosa dalam jumlah besar menghambat produksi dari cAMP sehingga
tidak ada yang terikat pada CRP akibatnya ekspresi lac operon pun
terhambat yang juga akan menghambat pembentukan β-galaktosidase.
Alasan inilah yang mengakibatkan hasil dari praktikum aktivitas enzim
pada medium NB + Laktosa> NB saja> NB + Glukosa + Laktosa.
VI. Kesimpulan
Urutan besar aktifitas enzim β-galaktosidase E.coli dari paling besar
berturut-turut adalah yang ditumbuhkan pada medium NB + Laktosa, NB
saja, NB + Glukosa + Laktosa.
VII. Daftar Pustaka
Nelson, L. D., Cox, M. M., 2004, Lehninger Principles of
Biochemistry, 4th ed, W. H. Freeman, hal 1081-1088
Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L., Stryer, Lubert. “Biochemistry”, 6 th ed.
2006. W. H. Freeman and Company. (page 892-901)