BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Teknik kultur jaringan pada tumbuhan sangat penting untuk perbanyak jenis unggul tanaman, sudah banyak teknik kultur dilakukan dalam penelitian totipotensi dan peran hormon dalam organogenesis pada tanman (Mineo,1990). Kontaminasi pada tanaman pada kultur jaringan berasala dari sumber yang berbeda, seperti bakteri dan jamur, yang mengurangi produktivitas dan mencegah berhasilnya perbanyakan sel. Beberapa metode untuk menghindari kontaminasi dari jamur dan bakteri dapat digunakan antibiotik, fungisida dan inaktivasi dengan menggunakan panas dan cahaya (Colgecen, 2009). Agar tidak terjadi kontaminasi sehingga dilakukan sterilisasi. Sterilisasi tersebut meliputi sterilisasi lingkungan, sterilisasi alat-alat dan media, dan sterilisasi bahan tanaman yang akan dikulturkan. 1.2 Permasalahan Permasalahan dari praktikum ini adalah bagaimana untuk mengetahui prosedur dan sterilisasi alat dan media kultur dengan baik dan benar. 1.3 Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui prosedur sterilisasi alat dan media kultur dengan baik dan benar. 1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Kultur Jaringan Kultur jaringan adalah membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya (Hendaryono,1994). Manfaat kultur jaringan diantaranya untuk mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat serta mempunyai sifat fisiologi dan morfologi seperti induk. Kultur jarinagn juga mempunyai manfaat yang besar di bidang farmasi, karena dari usaha ini dapat menghasilkan metabolit sekunder untuk upaya pembuatan obat-obatan. Kultur jarinagn juga dapat memberikan masukan dan informasi yang sangat bermanfaat di bidang fisiologi tanaman (Hendaryono, 1994). 2.2. Teknik Kultur Jaringan Teknik kultur jaringan sebenarnya sangat sederhana, yaitu suatu sel atau irisan jaringan tanaman yang disebut eksplan secara aseptik diletakkan dan dipelihara dalam media padat atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril. Dengan demikian sebagian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami poliferasi dan membentuk kalus. Apabila kalus terbentuk akan dipindahkan kedalam medium diferensiasi yang cocok, maka akan terbentuk tanaman kecil yang lengkap disebut planlet (Hendaryono, 1994). Saat ini teknik kultur jaringan telah semakin luas penggunaannya, antara lain: 2

a) b) c)

d)

e)

Meristem culture :budidaya jaringan dengan menggunakan eksplan muda atau meristem. Polen culture :budidaya jaringan dengan menggunakan eksplan dari polen atau benang sari. Protoplast culture :budidaya jaringan dengan menggunakan eksplan dari protoplas ( sel hidup yang telah dihilangkan dinding selnya). Chloroplast culture :budidaya jaringan dengan menggunakan kloroplas untuk keperluan fusi protoplas (memperbaiki sifat tanaman dengan membuat varietas baru). Somatic cross :menyilangkan dua macam protoplas menjadi satu, kemudian dibudidayakan sampai menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat baru (Hendaryono, 1994).

2.3 Kontaminasi Kontaminasi pada bahan tanaman yang dikulturkan dapat terjadi karena adanya infeksi secara eksternal maupun internal. Usaha pencegahan kontaminasi eksternal dilakukan dengan sterilisasi permukaan bahan tanaman. Infeksi internal tidak dapat dihilangkan dengan sterilisasi permukaan (Widiastoety, 2001). Sumber kontaminasi dapat berasal dari eksplan tumbuhan, organisme kecil yang masuk ke dalam media, alat yang tidak steril dan lingkungan kerja yang kotor. Sehingga harus dilakukan: sterilisasi lingkungan kerja, alat-alat, mediadan bahan tanaman (Susilowati,2001). 2.4 sterilisasi peralatan dan media Ada lima metode sterilisasi, yakni : 3

a). Sterilisasi basah metode ini dilakukan dengan cara perebusan. Botolbotol kultur dan peralatan lain yang akan digunakan direbus dengan air hingga mendidih selam dua jam. Air yang akan digunakan untuk kultur juga dapat disterilkan dengan cara ini. b). Sterilisasi dengan autoklaf dan oven sterilisasi dengan autoclave pada dasarnya menggunakan uap air panas bertekanan, sedangkan sterilisasi menggunakan oven (hot air sterilizer) menggunakan udara panas. Sterilisasi model ini umumnya dingunakan untuk mensterilkan alat-alat dan botol kultur yang terbuat dari gelas.

Bagian dari Autoklaf : 1.Tombol pengatur waktu mundur (timer) 2. Katup pengeluaran uap. 3. Pengukur tekanan 4

4. Klep pengaman 5. Tombol on-off 6. Termometer 7. Lempeng sumber panas 8. Aquades (H2O) 9. Sekrup pengaman 10. Batas penambah air. (Anonim,2009).

gambar lamina air flow c). Sterilisasi dengan penyaringan metode ini dilakukan untuk cairan/larutan yang tidak tahan terhadap suhu tinggi, misalnya, vitamin sehingga dilakukan penyaringan dengan sebuah saringan steril. d). Sterilisasi dengan sinar ultra violet sinar ultra violet dengan panjang gelombanh 2000 sampai 3000A dapat membunuh mikroorganisme dengan menghancurkan struktur proteinnya. Metode ini banyak digunakan untuk menyeterilkan ruang kerja dan air. e). Sterilisasi kimia 5

bahan-bahan yang biasa digunakan untuk sterilisasi ini adalah HCl, HgCl2, alkohol, formalin, phenol, chlorin dan sebagainya. (Isnansetyo,1995). 2.5 sterilisasi bahan tanaman Jaringan tumbuhan tidak aseptik, sehingga dilakukan prosedur khusus untuk mensterilisasinya, umumnya digunakan adalah etil alkohol atau chlorox dengan surfaktan penambahan konsentrasi dan waktu paparan yang ditentukan secara empiris (Mineo,1990). Problem terbesar yang dihadapi pada tissue culturist adalah kontaminasi mikroba pada kultur (baik bakteri maupun jamur). Dua cara dapat dilakukan untuk mengurangi kontaminasi kultur (Colgecen,2009).

6

BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah autoklaf ,Lamina Air Flow, botol kultur, pinset, pipet, yellow paper, cawan petri. 3.2 Cara Kerja Botol kultur, pinset, pipet, cawan petri -pinset, pipet, dan cawan petri dibungkus terlebih dahulu dengan yellow paper -dimasukkan botol kultur kedalam autoklaf lalu diikuti dengan peralatan yang sudah dibungkus -dihidupkan autoklaf dengan prosedur yang sudah ditentukan Hasil

7

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Metodologi Sterilisasi Alat Metode sterilisasi yang dilakukan dalam kultur jaringan dapat dilakukan dengan cara mekanik, kimiawi dan fisik sebagaimana berikut. Macam-macam Sterilisasi Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi. a) Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik. b) Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. Pemanasan - Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll. - Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll. - Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

8

- Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol (Barker,1998).

c)

4.2 Teknik-teknik Sterilisasi Alat, Medium dan Eksplan Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi. -Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut -Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. -Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol (Barker,1990). 4.2.1 Teknik sterilisasi alat Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130-170C selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada 9

suhu 170C (Anonim, 2009). Oleh karena itu dalam percobaan yag dilakukan pembungkusnya menggunakan yellow paper. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang terbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121C dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit (Anonim, 2009). 4.2.2 Sterilisasi Medium Botol-botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan alumunium foil, kemudian disterilkan. Sterilisasi medium lebih sedikit waktunya dari pada sterilisasi alat-alt yakni 15 menit, tetapi suhu dan tekanannya sama (Hendaryono, 1994). 4.2.3 Sterilisasi Eksplan Sterilisais eksplan dapat dilakukan dengan dua cara, secara mekanik dan kimia Sterilisasi Eksplan Secara Mekanis 10

-

-

-

Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging , yaitu dengan membakar eksplan tersebut diatas lampu spirtus sebanyak tiga kali. Eksplan keras yang distrilkan deng cara ini antara lain: tebu, biji salak, bung, bunga anggrek, dan sebagainya. Sedangkan eksplan yang berdaging antara lain: wortel, umbi, bawang putih, dan sebagainya (Hendaryono, 1994). Sterilisasi Eksplan Secara Kmia Sterilisasi secara kimia digunakan untuk eksplan yang lunak (jaringan muda) seperti daun, tangkai daun, anther, dan sebagainya. Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi antara lain : Sodium hipoklorit : nama dagangnya adalah clorox dan bayclin. Konsentrasi steril tergantung dari kelunakan eksplan, dapat 5%-10%, dan waktunya antara antara 5-10 menit. Pembuatan larutan clorox yaitu dengan menuangkan clorox dan aquades dengan perbandingan 1:4 (misalnya 25 ml clorox dan 100 ml aquades steril), kemudian ditambahkan dengan tween-20 sebanyak 1 tetes dan dicampur Merkuri khlorit : nama dagangnya adalah sublimat 0,05%. Penggunaan bahan kimia ini harus hati-hati karena bersifat racun. Cara perlakuan sterilisasi dengan sublimat sama dengan serilisasi dengan clorox. Hanya waktunya lebih pendek karena sublimat bersifat keras. Bila sterilisasi terlalu lama dapat menyebabkan kerusakan pada eksplan sehingga eksplan tersebut tidak akan tumbuh menjadi kalus. Alkohol 70% : jamur biasanya mati dengan alkohol 70%, sedangkan dengan alkohol 95% masih tetap hidup. Oleh karena itu alkohol 95% perlu diencerkan menjadi 70%. 11

Caranya yaitu dengan menuangkan alkohol 95% sebanyak 25 ml kedalam gelas ukur, kemudian tambahkan aquades sebanyak sebanyak 7o ml, sehingga akhirnya menjadi 95 ml. (Hendaryono, 1994). 4.3 Tahap-tahap Sterilisasi a) Sterilisasi lingkungan kerja Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). Waktu sterilisasi bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan lampu UV, sehingga sterilisasinya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 95% sebelum mulai bekerja. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap dengan Nahypoklorit 2% (merek komersial seperti Sunclin, Bayclin atau pembersih lantai lain yang mengandung disinfektan) atau alkohol 95%. Lantai ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang sama (Hendaryono, 1994). b) Sterilisasi alat-alat dan media Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam 12

oven pada suhu 130-170C selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170C (Anonim, 2009). Peralatan dan media disterilkan dengan autoklafdengan suhu 121C selama 15 menit (Mineo,1990), tetapi lamanya waktu tergantung dengan volume media yang disterilkan dan prosedur dari lat itu sendiri. C) sterilisasi bahan tanam Sterilisais eksplan dapat dilakukan dengan dua cara, secara mekanik dan kimia (Hendaryono, 1994). 4.4. Cara Kerja Alat Pada Kultur Jaringan 4.4.1 Autoklaf Prinsip kerja autoklaf adalah penggunaan uap air jenuh pada tekanan di atas tekanan atmosfer dan digunakan untuk memanaskan isi autoklaf. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 121C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 121C atau 249,8F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 121C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian 13

tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121C dan tekanan 15 psi selama 15 menit (Barker,1988). Cara menggunakan autoklaf tergantung dari petunjuk autoklaf, karena pada bebrapa alat mempunyai perbedaan penggunaannya, tetapi untuk prinsipnya sama. Pada autoklaf yang berada di laboratorium botani Biologi FMIPA ITS adalah model YX-2800, prosedur penggunaannya adalah : 1.masukkan air kedalam alat (1,5 lt) 2. masukkan bahan atau alat yang akan disterilkan kedalam wadah sekitar 60% dari kapasitasnya (JANGAN TERLALU PENUH) 3. Tutup alat dan putar kuncinya secara diagonal 4. hubungkan alat dengan sumber listrik dan kedua katup dibuka kearah atas 5. tekan tombol pre-heat maka lampu indikator akan menyala, yang menandakan alat mulai bekerja 6. ketika muncul percik air dari kedua katup, segera tutup keduanya, hal ini menandakan proses pemanasan mulai terjadi dan jarum penunjuk tekanan mulai bergerak. 7. matikan tombol pre-heat ketika katup safety mengeluarkan uap air. 8. putar timer sesuai waktu yang diperlukan dan tambahkan 10 menit. 9. tekan tombol timing, yang menandakan proses sterilisasi dimulai , dan lampu akan menyala. 10. putar tombol kontrol tekanan uap kearah naik-turun untuk menjaga supaya tekanan uap tetap stabil (max.0,14 Mpa) 14

11. ketika waktu yang ditentuka sudah habis , alat akan mati, lampu akan meredupdan muncul suara alarm, hal inimenandakan proses sterilisasi selesai.

Autoklaf di lab botani BIOLOGI ITS

4.4.2 Lamina Air Flow Laminar Air Flow adalah suatu alat yang digunakan dalam pekerjaan persiapan bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke botol yang lain dalam kultur jaringan. Prinsip kerja Laminar Air Flow adalah dengan mengalirkan arus udara yang laminair ke dalam almari penabur melalui saringan yang besar dengan ukuran mesh 0,22-0,24 mikron. Bakteri dan jamur ditahan oleh saringan ini, sehingga udara yang masuk ke dalam Laminar Air Flow sudah steril dan membuat ruang menjadi steril pula (Hendaryono, 1994). Cara sterilisasi tahapannya adalah : disemprot semua bagian dalam ruang kerja dengan alkohol termasuk meja dan dinding-dindingnya, serta dimasukkan juga peralatan yang akan digunakan seperti bunsen, pipet lalu bagian luar ditutup dengan kain gelap pada dinding-dindingnya, kemudian ditekan tombol UV, biarkan selama 1 jam. Setelah 1 jam 15

berlalu, tombol fan danl lamp dinyalakn terlebih dahulu selama 15 menit baru kemudian dimatikan tombol sinar UV.

16

BAB V KESIMPULAN Kesimpulan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui prosedur sterilisasi alat dan media kultur dapat dengan berbagai cara yaitu Sterilisasi basah, Sterilisasi dengan autoklaf dan oven, (pada dasarnya menggunakan uap air panas bertekanan, sedangkan sterilisasi menggunakan oven menggunakan udara panas), Sterilisasi dengan penyaringan, Sterilisasi kimia. Pada percobaan ini dilakukan sterilisasi botol kultur dan peralatan lain, seperti pinset, petridisch, dan pipet dimasukkan dalam autoklaf suhu 121C selama 40 menit. Sterilisasi yang lain yaitu sterilisasi Lamina Air Flow, yaitu dengan disemprot alkohol disemua bagian kemudian bagian luar ditutup dengan kain gelap lalu disinari dengan UV.

17

DAFTAR PUSTAKA Anonim.2009.Media Kultur Jaringan.. http://www.fp.unud.ac.id/biotek/kultur-jaringantanaman/12-media-kultur-jaringan.html. diakses tanggal 18 April 2012 pukul 20.00 WIB Barker, Kathy. 1998. At The Bench, A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York Colgecen.Hatice et al.2009. Inl uence of dif erent sterilization methods on callus initiation and production of pigmented callus in Arnebia densil ora Ledeb. Turk J Biol 513-520: Turkey. Hendaryono, Daisy P Sriyanti. 1994. Teknik kultur jaringan. Kanisius: Yogyakarta Isnansetyo,Alim dan Kurniastuty.1995. TEKNIK KULTUR PHYTOPLANKTON DAN ZOOPLANKTON.Kanisius:Yogyakarta Mineo, Lorraine.1990.Plant Tissue Culture Techniques. Pages 151-174, in Tested studies for laboratory teaching Volume 11., LAFAYETTE College Easton : Pennsylvania. Susilowati, Ari dan Shati Listyawati.2001. Keanekaragaman Jenis Mikroorganisme Sumber Kontaminasi Kultur In vitro di Sub-Lab. Biologi Laboratorium MIPA Pusat UNS.BIODIVERSITAS ISSN: 1412-033X Volume 2 (110-114) Widiastoety, D. dan A.Santi. 2001. Pengaruh Air Kelapa terhadap Pembentukan Proticorm Like Bodies 18

(PLBs) dari Anggrek Vanda dalam Medium Cair. Jurnal Hortikultura Volume 4 No. 2

19