LAPORAN

PENELITIAN PENGEMBANGAN IPTEKS (PPI)

UJI AKTIVITAS PENGOBATAN SALEP DAUN KEPEL

(Stelechocarpus burahol Blume Hook.f. & Thomson )

TERHADAP LUKA BAKAR TIKUS

Tim Pengusul

Ketua Peneliti (apt. Vera Ladeska.,M.Farm /1013127301)

Anggota Peneliti (apt. Lusi Putri Dwita., M.Si /0321028801 )

Nomor Surat Kontrak Penelitian : 280/F.03.07/2020

Nilai Kontrak : Rp.14.000.000

PROGRAM STUDI PROFESI APOTEKER

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA

TAHUN 2020

i

ii

NIDN.03.250672.01 NIDN. 0020116601

iii

URAT KONTRAK PENELITIAN

iv

ABSTRAK

Tanaman kepel (Stelechocarpus burahol [Blume] Hook.f & Thomson) merupakan flora asli

Indonesia bermanfaat sebagai antibakteri, antioksidan, antifungi dan juga sebagai antiseptik luka.

Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan uji aktivitas penyembuhan luka terbuka terhadap

perasan buah kepel. Perasan buah dengan konsentrasi 60% mampu mempercepat proses

penyembuhan luka terbuka dengan persentase penyembuhan luka sebesar 59,84%. Adanya

aktivitas antibakteri dan antioksidan pada daun kepel yang mampu membantu proses

penyembuhan luka serta senyawa kimia yang terkandung seperti flavonoid dan tanin, maka

penting dilakukan penelitian lanjutan terhadap ekstrak etanol 70% daun kepel sebagai penyembuh

luka bakar. Penelitian bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak etanol 70% daun kepel dalam

formula sediaan salep dengan target sebagai penyembuh luka bakar. Pengujian dilakukan dengan

pemodelan tikus luka bakar dengan pengukuran 4 parameter secara histologi yaitu jumlah

makrofag, kepadatan fibroblast, kecepatan re-epitelisasi dan pengukuran luas luka bakar.

Sebanyak 30 ekor tikus jantan dibagi menjadi 5 kelompok, kontrol positif (Burnazin®), kontrol

negatif (basis salep), salep ekstrak daun kepel konsentrasi 3,25%, 6,5% dan 13%. Pengukuran

parameter jumlah makrofag, kepadatan fibroblast dan kecepatan re-epitelisasi dilakukan pada hari

ke-3, 7, 14. Pengamatan histologi menunjukkan peningkatan jumlah makrofag, jumlah fibroblast

dan ketebalan re-epitelisasi serta penurunan luas luka bakar pada kelompok salep ekstrak daun

kepel secara signifikan dibandingkan kontrol negatif, dan pada konsentrasi 13% ekstrak etanol

70% daun kepel menunjukkan hasil sebanding dengan silversulfadiazin.

Kata kunci: Fibroblas, luka bakar, makrofag,re-epitelisasi, Stelechocarpus burahol

v

DAFTAR ISI

Hal

HALAMAN SAMPUL i

HALAMAN PENGESAHAN ii

SURAT KONTRAK PENELITIAN iii

ABSTRAK v

DAFTAR ISI vi

DAFTAR TABEL vii

DAFTAR GAMBAR viii

DAFTAR LAMPIRAN ix

BAB 1. PENDAHULUAN 1

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA 3

BAB 3. METODE PENELITIAN 5

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN 9

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN 21

BAB 6 LUARAN YANG DICAPAI 22

BAB 7 RENCANA TINDAK LANJUT DAN

PROYEKSI HILIRISASI

23

DAFTAR PUSTAKA 24

LAMPIRAN 27

vi

DAFTAR TABEL

1. Tahap perlakuan hewan uji 7

2. Hasil Ekstraksi daun kepel 9

3. Hasil uji organoleptis serbuk dan ekstrak etanol 70% daun kepel 10

4. Hasil rendemen dan susut pengeringan ekstrak etanol 70% daun

kepel

11

5. Hasil penapisan ekstrak etanol 70% daun kepel 11

6. Hasil rerata jumlah makrofag 13

7. Hasil rata-rata kepadatan fibroblas 16

vii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Penurunan jumlah makrofag 13

Gambar 2. Histologi luka hari ke-3 14

Gambar 3. Garfik rata-rata kepadatan fibroblas 17

viii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Bukti Penerimaan Artikel Luaran Wajib 30

Lampiran 2. Bukti Submit Luaran Tambahan 42

1

BAB 1. PENDAHULUAN

Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya hayati.

Keanekaragaman hayati yang tumbuh di hutan Indonesia merupakan aset nasional

yang tidak terhingga nilainya bagi kepentingan manusia. Salah satu manfaat

keanekaragaman hayati adalah pemanfaatannya sebagai obat contoh tanaman

kepel. Tanaman kepel (Stelechocarpus burahol [Blume] Hook.f & Thomson)

adalah flora asli dari Indonesia yang merupakan identitas provinsi daerah

Istimewa Yogyakarta yang biasa dijumpai di keraton-keraton yang ada di Pulau

Jawa (Haryjanto 2012).

Luka bakar adalah suatu bentuk kerusakan atau kehilangan jaringan yang

disebabkan oleh kontak dengan sumber yang memiliki suhu tinggi seperti api, air

panas, bahan kimia, listrik dan radiasi (Moenadjat 2009). Parahnya luka bakar

ditentukan oleh dua faktor yaitu luas bagian tubuh yang terbakar dan kedalaman

luka bakar yang dibedakan menjadi derajat pertama, derajat kedua, dan derajat

ketiga (Corwin 2009). Luka bakar derajat ketiga ini adalah luka bakar ketebalan

penuh, melibatkan kematian epidermis, dermis, dan appendiks kulit. Begitu

kompleksnya proses penyembuhan luka bakar sehingga membutuhkan banyak

biaya untuk menstabilkan kondisi umum tubuh, perawatan luka itu sendiri

maupun untuk mencegah dan mengobati komplikasinya karena sampai saat ini

perawatan luka bakar masih mahal dan komplikasinya menyebabkan morbiditas

dan mortilitas. Diperlukan adanya solusi obat baru untuk membantu masalah ini

secara efektif, aman, murah, dan terjangkau. Salah satu alternatifnya adalah

dengan penggunaan obat tradisional.

Berdasarkan penelitian Sunarni dkk. (2007) daun kepel memiliki

kemampuan sebagai antioksidan. Penelitian lain juga menyatakan bahwa perasan

buah kepel dengan konsentrasi 60% memiliki aktivitas penyembuhan luka terbuka

pada tikus dengan persentasi penyembuhan sebesar 59,84% (Pribadi dkk. 2014) .

Berdasarkan aktivitas daun kepel sebagai antioksidan dan antibakteri, serta

perasan buah kepel sebagai penyembuhan luka terbuka, maka dapat

dimungkinkan bahwa pengujian pada ektrak etanol 70% daun kepel memiliki

2

aktivitas mempercepat proses penyembuhan luka bakar. Untuk membuktikan

khasiat ini dan berdasarkan data penelitian sebelumnya, maka peneliti

berkeinginan untuk melanjutkan khasiatnya terhadap luka bakar.

Penelitian ini akan dilakukan pada tikus yang diinduksi luka bakar derajat

tiga dengan pengukuran 4 parameter luka bakar yaitu jumlah makrofag,

kepadatan fibroblast, kecepatan re-epitelisasi dan pengukuran penurunan luas luka

bakar. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan aplikasi Image Raster 3.0.

Banyaknya parameter yang diukur untuk menunjang data yang bisa membuktikan

daun kepel berkhasiat sebagai pengobatan luka bakar. Diharapkan hasil penelitian

dapat menambah khasanah khasiat tanaman asli Indonesia dan bermanfaat dalam

penyembuhan luka bakar.

3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumberdaya hayati. Terdapat

sekitar 30000 spesies tumbuhan berbunga di hutan tropika Indonesia.

Keanekaragaman hayati yang tumbuh di hutan Indonesia merupakan aset nasional

yang tidak terhingga nilainya bagi kepentingan manusia. Manfaat

keanekaragaman hayati adalah kegunaannya sebagai obat (Hidayat 2011). Salah

satu tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai obat adalah tanaman dari famili

Annonaceae yaitu tanaman kepel (Ramadhan dkk. 2015). Tanaman kepel

(Stelechocarpus burahol [Blume] Hook.f & Thomson) adalah flora asli dari

Indonesia yang merupakan identitas provinsi daerah Istimewa Yogyakarta yang

biasa dijumpai di keraton-keraton yang ada di Pulau Jawa (Haryjanto 2012).

Secara tradisional buah kepel digunakan oleh masyarakat sebagai deodoran oral,

dan daun kepel digunakan sebagai asam urat (Anggraeni 2013).

Berdasarkan penelitian Sunarni dkk. (2007) daun kepel memiliki

kemampuan sebagai antioksidan penangkap radikal terhadap isolat flavonoid.

Penelitian lainya Hidayat (2011) mengenai fraksinasi golongan flavonoid dari

daun kepel yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus

epidermidis dengan hasil Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) yang diperoleh

sebesar 1.00 mg/ml dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) sebesar 2.00

mg/ml. Penelitian sebelumnya Pribadi dkk. (2014) juga menyatakan bahwa

perasan buah kepel dengan konsentrasi 60% memiliki aktivitas penyembuhan luka

terbuka pada tikus yang paling baik dengan presentasi penyembuhan sebesar

59,84%. Berdasarkan aktivitas daun kepel sebagai antioksidan dan antibakteri,

serta perasan buah kepel sebagai penyembuhan luka terbuka, maka dapat

dimungkinkan bahwa pengujian pada ektrak etanol 70% daun kepel memiliki

aktivitas mempercepat proses penyembuhan luka bakar.

Luka bakar adalah suatu bentuk kerusakan atau kehilangan jaringan yang

disebabkan oleh kontak dengan sumber yang memiliki suhu tinggi seperti api, air

panas, bahan kimia, listrik dan radiasi (Moenadjat 2009). Terdapat sekitar 265.000

kematian setiap tahun disebabkan oleh luka bakar. Kebanyakan kasus luka bakar

terjadi di negara-negara berkembang dengan pendapatan rendah hingga

4

menengah, dan setengah dari kasus terjadi di negara-negara Asia Tenggara,

termasuk Indonesia (WHO 2016). Pada tahun 2012 tercatat 25 kasus luka bakar

derajat dalam (23,8%) dirawat di Burn Unit RSUD Dr. Soetomo dari total 105

pasien luka bakar yang dirawat (Hidayat 2013).

Parahnya luka bakar ditentukan oleh dua faktor yaitu luas bagian tubuh

yang terbakar dan kedalaman luka bakar yang dibedakan menjadi derajat pertama,

derajat kedua, dan derajat ketiga (Corwin 2009). Luka bakar derajat ketiga ini

adalah luka bakar ketebalan penuh, melibatkan kematian epidermis, dermis, dan

appendiks kulit. Luka bakar ini sangat berbahaya dan pasien sebaiknya dirawat

inap bila memungkinkan (Ledbetter 2010).

Proses penyembuhan luka dibagi menjadi beberapa fase yang saling

berkaitan mulai dari fase inflamasi, fase proliferasi sampai fase maturasi

(Novriansyah 2008). Proses penyembuhan luka bakar mempunyai persamaan

dalam fase penyembuhan luka pada umumnya, perbedaanya adalah durasi setiap

fasenya (Tiwari 2012). Fase inflamasi terjadi sejak terjadinya luka sampai sekitar

hari kelima, dan makrofag merupakan sel predominan pada hari ke-3 pasca luka

(Franklin 2007). Jumlah makrofag tinggi pada fase inflamasi dan akan lebih

rendah jumlahnya pada fase selanjutnya sampai luka menutup (Mutiara dkk.

2015). Tingginya jumlah makrofag pada fase inflamasi dapat memfagositosis sel-

sel yang mati lebih cepat dan semakin banyak growth factor yang dilepas, maka

proses penyembuhan luka bakar menjadi lebih cepat (Puspitasari 2015).

5

BAB 3. METODE PENELITIAN

3.1 Determinasi dan Pengambilan Bahan Uji

Bahan yang digunakan adalah bagian daun dari tanaman kepel

(Stelechocarpus burahol [Blume] Hook.f. & Thomson) yang diperoleh dari Balai

Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITTRO). Determinasi tanaman

dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi,

LIPI, Cibinong, untuk mengidentifikasi jenis dan memastikan kebenaran tanaman

tersebut.

3.2. Persiapan Hewan Uji

Tikus yang digunakan sebagai hewan uji diaklimatisasi terlebih dahulu

selama 7 hari dalam kandang hewan Fakultas Farmasi UHAMKA. Selama

aklimatisasi tikus diberikan makan dan minum setiap hari. Hewan percobaan yang

digunakan sebanyak 30 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) jantan Sprague

Dawley dengan berat 150-200 g. Tikus dibagi menjadi 5 kelompok dengan jumlah

masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor.

3.3 Pembuatan Ekstrak Etanol 70% Daun Kepel

Pembuatan ekstrak etanol 70% daun kepel dengan maserasi 1,2 kg serbuk

simplisia daun kepel dengan etanol 70%. Pada 6 jam pertama dilakukan

pengadukan secara perlahan. Selanjutnya didiamkan selama 18 jam, wadah

diletakkan ditempat yang sejuk dan terlindung dari cahaya. Kemudian hasil

maserasi disaring, ampasnya dimaserasi kembali dengan etanol 70% dan

diperlakukan dengan cara yang sama, remaserasi dilakukan sebanyak tiga kali.

Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dilanjutkan

dengan waterbath dengan suhu 40ºC hingga diperoleh ekstrak kental.

3.4. Uji Karakteristik dan Penapisan Fitokimia

a. Uji Organoleptis

Pemeriksaan organoleptik meliputi pemeriksaan bentuk, warna, bau, dan

rasa terhadap ekstrak etanol 70% daun kepel (Depkes 2008).

b. Penetapan Susut Pengeringan.

6

Tara botol timbang dangkal bersumbat kaca yang telah dikeringkan pada

suhu 105 °C selama 30 menit. Timbang 2 gram ekstrak kental dalam wadah yang

sudah ditara. Ratakan zat uji sampai setinggi lebih kurang 5 mm perlahan-lahan

dengan menggoyang. Buka sumbat dan biarkan sumbat ini di dalam oven,

keringkan di dalam oven pada suhu 105 °C selama 30 menit atau hingga bobot

tetap, pada waktu oven dibuka botol segera ditutup dan biarkan dalam desikator

sampai sampai suhunya mencapai suhu kamar sebelum ditimbang. Timbang pada

selang waktu 1 jam sampai perbedaan antara dua penimbangan berturut-turut

tidak lebih dari 0,25% (Depkes 2008).

c. Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol 70% daun kepel

meliputi adanya fenol (FeCl3), flavonoid ( Shinoda dan ammonia), tanin (gelatin

dan FeCl3), saponin ( test busa), alkaloid ( Mayer, Bouchardat, Dragendorff) ,

steroid/terpenoid (Liebermann Burchard) (Hanani 2014)

3.5. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Etanol 70% Daun Kepel

Berdasarkan hasil orientasi daun kepel dengan konsentrasi 13%

menunjukkan aktivitas penyembuhan yang paling baik. Maka dari itu dibuat

variasi dengan menurunkan konsentrasi uji sebagai berikut:

Konsentrasi Uji I : 1 x 13% = 13%

Konsentrasi Uji II : ½ x 13% = 6,5%

Konsentrasi Uji III : ¼ x 13% = 3,25%

3.6. Pembuatan luka bakar derajat III dan perlakuan terhadap hewan uji

Tikus diaklimatisasi selama 1 minggu dan dicukur rambutnya di daerah

punggung bagian atas. Kemudian sisa rambut dibersihkan menggunakan Veet®.

Tikus dianestesi menggunakan ketamin dengan dosis 40,08 mg/kg BB secara IM.

Plat logam khusus dengan diameter 1,5 cm x 1,5 cm dipanaskan sampai 100ᵒC

kemudian logam panas ditempelkan ke daerah punggung bagian atas tikus selama

30 detik. Sesudah pembuatan luka, tikus diberikan analgetik secara oral. Ekstrak

daun kepel konsentrasi 3,25%, 6,5%, 13%, burnazin®, dan basis salep diberikan

dengan mengoleskan secara merata pada daerah luka pada masing-masing

perlakuan sebanyak 2 kali sehari setiap pagi dan sore (Nazrun 2005).

7

Table 1. Tahap Perlakuan Pada Hewan Uji

Hari Kelompok

I

(salep3.25%)

II

(salep 6.5%)

III

(salep 13%)

IV

(negatif)

V

(positif)

1-7 Aklimatisasi

8 Pembuatan luka bakar derajat III dengan diameter 1,5 cm dengan anestesi

ketamin secara IM

9 – 22 Dioleskan sediaan uji secara topikal dan ditutup dengan kassa steril 2 kali

sehari ( pagi dan sore) dan pengukuran luas permukaan luka bakar

11, 15,

22 Pengamatan histopatologi dan pengambilan jaringan

3.7. Pengambilan Sampel Histologi

Spesimen biopsi kulit atau jaringan diambil yaitu pada hari ke 3, 7 dan 14.

Setiap pengambilan meliputi daerah luka dengan mengambil bagian dari otot dan

jaringan lemak subkutanius masing-masing hewan, agar pada saat pengamatan

bagian-bagian kulit terlihat jelas. Jaringan diambil menggunakan pisau bedah

yang telah dibersihkan menggunakan etanol. Sebelum dilakukan pengambilan

sampel dilakukan anestesi terhadap hewan uji menggunakan ketamine injeksi.

Spesimen difiksasi dengan larutan Buffer Neutral Formalin 10 %.

3.8. Pembuatan Preparat Histopatologi

Jaringan difiksasi dengan menggunakan larutan Buffer Neutral Formalin

atau BNF 10% dibiarkan pada suhu kamar selama minimal 24 jam.Jaringan

dipotong-potong dan dimasukkan ke dalam wadah spesimen yang terbuat dari

plastik. Dilakukan proses dehidrasi dengan konsentrasi alkohol bertingkat yaitu

alkohol 70%, 80%, 90% alkohol absolut I, alkohol absolut II, masing-masing 2

jam. Kemudian dilakukan penjernihan (clearing) untuk menghilangkan sisa

alkohol dengan menggunakan xylol. Lalu dilakukan proses pencetakan atau

parafinisasi menggunakan parafin sehingga tercetak di blok-blok parafin,

disimpan pada lemari es. Blok-blok parafin kemudian di potong tipis setebal 6-8

µm dengan menggunakan mikrotom. Hasil potongan diapungkan dalam air hangat

bersuhu 60°C (waterbath) untuk meregangkan agar jaringan tidak berlipat.

Sediaan kemudian diangkat dan diletakkan pada gelas objek untuk dilakukan

pewarnaan Hematoxyllin dan Eosin (HE). Prosedur pewarnaan Hematoxyllin-

8

Eosin (HE) dilakukan dengan cara deparafinasi, sediaan preparat pada objek

direndam dalam xylol I dan xylol II selama masing-masing 2 menit. Kemudian

redehidrasi dengan perendaman secara berturut dalam alkohol absolut, alkohol

95% dan alkohol 80% masing-masing selama dua menit lalu dicuci dengan air

mengalir. Pewarnaan dengan Hematoksilin dilakukan selama 8 menit, selanjutnya

dibilas dengan air mengalir, serta diwarnai dengan Eosin selama 2-3 menit.

Sediaan yang diwarnai eosin dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Sediaan

kemudian dilakukan dehidrasi lanjutan, dimasukkan ke dalam alkohol 95% dan

alkohol absolut masing-masing sebanyak 10 kali celupan, lalu ke dalam alkohol

absolut II selama 2 menit. Selanjutnya ke dalam xylol I selama 1 menit dan xylol

II selama 2 menit. Sediaan kemudian diteteskan dengan etilen dan ditutup dengan

gelas penutup dan selanjutnya diperiksa di bawah mikroskop (Mustaba 2012).

9

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman Kepel

Determinasi merupakan tahap awal dalam penelitian untuk mengetahui

identitas dan memastikan kebenaran jenis dari tanaman yang akan diteliti.

Determinasi tanaman dilakukan di “Herbarium Bogoriense” Pusat Penelitian

Biologi - LIPI Cibinong, Bogor menyatakan bahwa tanaman yang digunakan

dalam penelitian ini adalah Stelechocarpus burahol (Blume) Hook.f. & Thomson

dengan nama daerah kepel dan suku Annonaceae.

B. Hasil Ekstraksi Daun Kepel

Hasil ekstrak daun kepel yang diperoleh dilihat pada tabel di bawah ini.

Tabel 2. Hasil Ekstraksi Daun Kepel

Jenis Hasil

Daun segar 7 kg

Daun kering 2,1 kg

Serbuk daun kepel 1,2 kg

Ekstrak kental etanol 70% daun kepel 134,96 g

Daun kepel yang digunakan dalam penelitian ini yaitu daun segar. Daun

kepel sebanyak 7 kg yang diperoleh dari BALITTRO dibersihkan dengan cara

dicuci dengan air mengalir sampai bersih agar terpisah dari kotorannya, kemudian

dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dan terlindung cahaya matahari

langsung. Pengeringan yang dilakukan bertujuan untuk mengurangi kadar air yang

terkandung dalam simplisia sehingga dapat mencegah timbulnya bakteri dan

jamur yang dapat menurunkan kualitas simplisia. Simplisia daun kepel kering

diperoleh sebesar 2,1 kg, kemudian dibuat serbuk dengan menggunakan blender

dan diayak dengan ayakan no mesh 40. Penyerbukan dilakukan untuk

memperkecil ukuran partikel simplisia. Ukuran partikel yang kecil akan

memperbesar luas permukaan simplisia sehingga pelarut yang digunakan mudah

10

masuk kedalam pori-pori simplisia dan senyawa aktif yang tertarik lebih

maksimal dan memudahkan proses ekstraksi.

Diperoleh berat serbuk kering sebesar 1,2 kg kemudian diekstraksi dengan

metode maserasi. Metode maserasi dipilih karena sederhana baik secara

pengerjaan maupun peralatan. Selain itu metode ini baik digunakan pada senyawa

yang mudah terurai pada metode penyarian yang menggunakan pemanasan.

Maserat yang didapat kemudian dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary

evaporator pada suhu 50ºC sampai didapatkan ekstrak kental yang mudah

dituang. Tujuan dari pemekatan adalah untuk mengurangi kadar air dan

mengurangi sisa pelarut. Pemekatan dilanjutkan kembali menggunakan waterbath

dengan suhu 50°C untuk mendapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental daun kepel

yang diperoleh sebesar 134,96 g.

C. Hasil Karakteristik Ekstrak Etanol 70% Daun Kepel

Untuk mengetahui karakteristik ekstrak etanol 70% daun kepel dilakukan

uji organoleptis, penetapan susut pengeringan dan rendemen ekstrak etanol 70%

daun kepel.

Tabel 3. Hasil Uji Organoleptis Serbuk dan Ekstrak Etanol 70% Daun Kepel

Jenis

Bentuk Bau Rasa Warna

Serbuk simplisia

daun kepel Serbuk halus Khas Khas Hijau

Ekstrak etanol 70%

daun kepel Ekstrak kental Khas Pahit Hijau kehitaman

Selain identifikasi serbuk dan ekstrak daun kepel, ekstrak etanol 70% daun

kepel juga dihitung rendemen yang diperoleh serta dilakukan penetapan susut

pengeringan. Berikut hasil rendemen ekstrak dan susut pengeringan:

11

Tabel 4. Hasil Rendemen dan Susut Pengeringan Ekstrak Etanol 70% Daun

Kepel

Jenis Uji Hasil

Rendemen Ekstrak 11,25%

Susut Pengeringan 8,9226%

Hasil rendemen ekstrak etanol 70% daun kepel sebesar 11,25%.

Rendemen dihitung untuk mengetahui persentase zat aktif yang didapat setelah

dilakukan proses ekstraksi. Sedangkan hasil penetapan susut pengeringan yang

diperoleh sebesar 8,9226% yang dilakukan untuk mengetahui jumlah senyawa

yang hilang selama proses pengeringan.

D. Hasil Uji Penapisan Fitokimia

Hasil penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan kimia

yang terdapat pada ekstrak etanol 70% daun kepel yang meliputi uji flavonoid,

alkaloid, saponin, tanin, steroid, dan triterpenoid. Hasil penapisan fitokimia dapat

dilihat pada tabel.

Tabel 5. Hasil Penapisan Ekstrak Etanol 70% Daun Kepel

Senyawa Hasil Uji

Flavonoid ++

Alkaloid -

Saponin ++

Tanin +

Steroid dan Terpenoid -

Ket: +++ = Sangat kuat

++ = Kuat

+ = Lemah

- = Tidak ada

12

Hasil penapisan fitokimia ekstrak etanol 70% daun kepel menunjukkan

hasil positif pada pengujian flavonoid, saponin dan tanin. Sedangkan pada

pengujian alkaloid, steroid dan terpenoid menunjukkan hasil yang negatif.

Hasil Evaluasi Sediaan Salep Ekstrak Etanol 70% Daun Kepel

Evaluasi yang dilakukan terhadap sediaan salep meliputi uji terhadap

bentuk, bau, warna, dan homogenitas. Semua kelompok konsentrasi salep 3,25%,

6,5%, dan 13% ekstrak etanol 70% daun kepel terdistribusi homogen. Warna

kuning berasal dari vaselin flavum sebagai basis salep sedangkan perubahan

warna salep yang semakin pekat disebabkan oleh penambahan konsentrasi

ekstrak , dengan bau khas dari ekstrak daun kepel. Sediaan uji dibuat dalam

bentuk salep karena mudah dioleskan dan mempercepat proses penghantaran

senyawa aktif. Pemilihan vaselin flavum sebagai basis salep karena bersifat

hidrokarbon sehingga tidak mudah hilang jika terkena air sehingga dapat

memperpanjang kontak antara bahan obat dan kulit (Sentat 2015).

Jumlah makrofag diperoleh dari preparat histologi dengan pewarnaan

Hematoxyllin-Eosin melalui perhitungan 10 lapang pandang pada daerah luka

menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Sediaan uji yang

diberikan pada tikus adalah ekstrak etanol 70% daun kepel dengan konsentrasi

3,25%, 6,5%, 13%, Burnazin®)

sebagai kontrol positif dan vaselin flavum sebagai

kontrol negatif. Burnazin®)

sebagai kontrol positif karena merupakan gold

standard dalam perawatan luka bakar topikal yang mempunyi zat aktif yaitu

Silver Sulfadiazine (SSD). SSD menghambat replikasi DNA dan merusak dinding

sel bakteri. Kandungan perak dalam SSD juga berfungsi sebagai antibakteri yang

membuat luka bersih dari mikroba sehingga regenerasi jaringan menjadi tidak

terganggu (Atiyeh 2007; Almeida dkk. 2000).

Data perhitungan jumlah makrofag pada tikus terhadap waktu

penyembuhan luka diolah secara statistik. Hasil tabel ANOVA terhadap jumlah

makrofag pada hari ke-3, 7, dan 14 menunjukan adanya perbedaan yang bermakna

pada setiap kelompok (p<0,05). Untuk mengetahui perbedaan bermakna antar

kelompok dilanjutkan dengan uji Tukey.

13

Pengamatan hari ke 3 menunjukan jumlah sel makrofag pada kelompok

konsentrasi uji 13% sebanding dengan kelompok kontrol positif, dan menunjukan

perbedaan bermakna dengan kelompok kontrol negative (gambar 1). Hal ini

karena makrofag menjadi sel predominan pada hari ke 3 pasca luka.

Gambar 1. Penurunan Jumlah Makrofag

Makrofag adalah sel yang efektif untuk proses fagositosis, makrofag

memfagositosis organisme patogen, benda asing dan sel-sel yang tidak berguna

lagi. Makrofag yang berada di jaringan berasal dari sel monosit darah yang

bermigrasi ke jaringan ikat. Apabila terjadi peradangan, jumlah monosit yang

bermigrasi ke jaringan ikat mengalami peningkatan sehingga makrofag akan

teraktivasi (Franklin 2007; Dwintanandi dkk. 2016).

Tabel 6. Hasil Rerata Jumlah Makrofag

Kelompok Hari ke-3 Hari ke -7 Hari ke-14

Kontrol Positif 139,3±8,944

104,725±5,998

94,975±6,602

Kontrol Negatif 109,875±7,221

119,95±7,083 112,3±4,231

3,25% 116,421±5,549b

114,900±5,780b

106,37±3,398b

6,5% 124,175±7,322b

109,925±4,332b

99,875±4,678b

13% 134,3±6,710a,b

107,025±4,0343a,b

97,025±3,927a,b

1800

2300

2800

0 2 4 6 8 10 12 14 16

JUM

LAH

MA

KR

OFA

G

HARI 6.50% 3.25% 13% negatif positif

14

Keterangan: a sebanding dengan kontrol positif (p>0,05)

b berbedaan bermakna dengan kontrol negatif (p<0,05)

Fase inflamasi dimulai segera setelah terjadinya luka dan umumnya

sampai hari ke-5 setelah luka. Tujuan utama fase ini adalah menghilangkan

jaringan mati dan mencegah infeksi oleh agen mikrobial patogen. Neutrofil

berperan penting untuk memfagositosis benda-benda asing seperti bakteri. Bakteri

yang tidak terfagositosis oleh neutrofil akan difagositosis oleh makrofag yang

mempunyai daya fagositosis lebih hebat dibandingkan neutrofil. Makrofag akan

menjadi sel predominan setelah hari ketiga pasca luka. Makrofag akan

memfagositosis bakteri pada daerah luka, akan meningkat jumlahnya pada fase

inflamasi dan akan menurun jumlahnya pada fase proliferasi (Gurtner 2007;

Febram dkk. 2010).

Konsentrasi 3,25% Konsentrasi 6,5% Konsentrasi 13%

Gambar 2. Histologi luka Hari ke-3 dengan Pewarnaan Hematoxylin-

Eosin pada Perbesaran 400x

Kontrol Positif Kontrol Negatif

M

M

M

M M

M

M

M M

M

15

Hasil analisis dengan Uji Tukey pada pengamatan hari ke 7 dan 14

menunjukan jumlah makrofag pada kelompok konsentrasi 13% sebanding dengan

kelompok kontrol positif dan kelompok konsentrasi 6,5%, dan menunjukan

perbedaan bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan konsentrasi 3,25%.

Pada pengamatan hari ke 7 jumlah makrofag semua kelompok uji lebih rendah

dibandingkan dengan jumlah makrofag pada hari ke 3, kecuali pada kelompok

kontrol negatif jumlah sel makrofag lebih tinggi dibandingkan hari ke 3. Hal ini

menunjukan bahwa proses inflamasi pada kelompok kontrol negatif masih terus

berjalan pada fase proliferasi. Kelompok konsentrasi uji 13% dan kelompok uji

lainya jumlahnya lebih rendah dari hari ke 3 yang artinya salep ekstrak etanol

70% daun kepel telah bekerja sebagai anti-inflamasi sehingga proses inflamasi

tidak terus berjalan.

Tingginya jumlah makrofag pada kelompok kontrol negatif menunjukan

terjadinya inflamasi yang berkepanjangan, karena pada luka bakar memiliki

pertumbuhan mikroorganisme lebih banyak. Tidak adanya bahan aktif pada

kelompok kontrol negatif sangat memungkinkan masih adanya mikroba dan

kerusakan jaringan yang harus difagositosis oleh sel makrofag pada daerah luka

(Sura dkk. 2013). Maka proses penyembuhan luka pada kelompok kontrol negatif

akan berkepanjangan, sehingga terjadi penundaan fase proliferasi. Pada kelompok

konsentrasi uji 13% dan kelompok konsentrasi uji lainya jumlah sel makrofag

lebih rendah menandakan bahwa fase inflamasi berakhir dan digantikan dengan

fase proliferasi.

Pada fase proliferasi makrofag juga dibutuhkan untuk menghasilkan

growth factor seperti fibroplatic growth factor, transforming growth factor-beta

(TGF-β), DGF yang untuk merangsang migrasi fibroblas ke daerah luka.

Makrofag mensekresi faktor pertumbuhan dan sitokin yang akan berperan dalam

proses proliferasi. Fungsi makrofag pada fase proliferasi adalah mengaktivasi

fibroblas dan meningkatkan migrasi fibroblas yang berperan dalam pembentukan

jaringan dan memproduksi kolagen (Mulia 2012; Hesketh et al. 2017).

16

Pemberian salep ekstrak etanol 70% daun kepel dapat mempercepat fase

inflamasi pada luka bakar. Hal ini diduga berhubungan dengan senyawa metabolit

sekunder yang terdapat dalam ekstrak daun kepel yang berperan dalam

penyembuhan luka seperti flavonoid, saponin dan tannin yang berfungsi sebagai

antioksidan dan antimikroba yang mempengaruhi penyembuhan luka (Saroja dkk.

2012). Kandungan tannin dan saponin mempunyai kemampuan sebagai pembersih

atau antiseptik. Saponin dapat memicu vascular endothelial growth factor

(VEGF) dan meningkatkan jumlah makrofag bermigrasi ke area luka sehingga

meningkatkan produksi sitokin yang akan mengaktifkan fibroblas di jaringan luka

(Reddy dkk. 2011). Kandungan flavonoid sebagai antioksidan, antimikroba, dan

antiinflamasi pada luka bakar. Jadi dapat dikatakan salep ekstrak daun kepel 70%

dapat membantu mempercepat penyembuhan luka bakar dilihat dari tingginya

jumlah makrofag pada fase inflamasi.

Kepadatan fibroblast mengalami puncak pada hari ke-7, di mana jumlah

fibroblas tertinggi diperoleh kontrol positif, kemudian diikuti oleh konsentrasi

13%, 6,5%, 3,25% dan kontrol negatif (Tabel 7).

Tabel 7. Hasil Rata-Rata Kepadatan Fibroblas Ekstrak Daun Kepel

Kelompok

Jumlah Fibroblas Hari Ke

3 7 14

Kontrol Negatif 29,5 ± 2,8191 49,55 ± 3,1030 50,9 ± 4,9139

Salep EDK

Konsentrasi 3,25% 45,95 ± 3,2602

a 63,2 ± 4,1688

a 43 ± 3,9603

a

Salep EDK

Konsentrasi 6,5% 49,75 ± 4,2534

a 67,35 ± 4,3922

a 38,95 ± 3,5388

a

Salep EDK

Konsentrasi 13% 51,2 ± 3,6685

a 70,18 ± 4,1372

ab 37,02 ± 3,0842

ab

Kontrol Positif 58,65 ± 4,577a 73,15 ± 4,577

a 34,87 ± 3,4674

a

a Menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan kontrol Negatif (p<0,05)

b Menunjukkan sebanding dengan kontrol Positif (p>0,05)

EDK = Ekstrak Daun Kepel

17

0

10

20

30

40

50

60

70

80

3 7 14

Jumlah Fibroblas

Hari Pengamatan

negatif

3.25%

6.50%

13%

positif

Hasil analisis uji Tukey pada pengamatan hari ke-3 menunjukkan rata-rata

kepadatan fibroblas pada semua kelompok zat uji berbeda bermakna dengan

kontrol negatif. Pada gambar 3 dapat dilihat kepadatan fibroblas pada semua

kelompok zat uji masih berjumlah sedikit karena fibroblas belum berperan dalam

fase inflamasi. Fibroblas berperan pada dua fase yaitu fase proliferasi dan fase

maturasi (Prabakti 2005).

Gambar 3. Grafik Rata-Rata Kepadatan Fibroblas

Fibroblas berperan pada dua fase yaitu fase proliferasi dan fase maturasi

(Prabakti 2005). Pengamatan hari ke-7 menunjukkan rata-rata kepadatan fibroblas

pada konsentrasi 13% tidak terdapat perbedaan yang bermakna dengan kontrol

positif dan konsentrasi 6,5%. Perbedaan yang bermakna hanya terjadi antara

kontrol negatif dan konsentrasi 3,25%. Meningkatnya jumlah sel fibroblas akan

meningkatkan jumlah serat kolagen yang akan mempercepat proses penyembuhan

luka. Proliferasi fibroblas dipengaruhi oleh beberapa growth factor yang

dihasilkan oleh makrofag seperti Platelet Derived Growth Factor (PDGF),

Fibroblast Growth Factor (bFGF), Transforming Growth Factor (TGF-β) dan sel

radang, Interleukin-1 (IL-1), Tumor Necrosis Factor (TNF) (Robbins 2007).

Pengamatan hari ke-14 menunjukkan rata-rata kepadatan fibroblas pada

konsentrasi 13% tidak terdapat perbedaan yang bermakna dengan kontrol positif

18

dan konsentrasi 6,5%. Pada hari ke-14 ini menunjukkan bahwa proliferasi dari

fibroblas menentukan hasil akhir penyembuhan luka. Fibroblas akan

memproduksi matriks ekstraselular yang kemudian akan digantikan oleh kolagen.

Fibroblas akan segera menghilang segera setelah matriks kolagen mengisi kavitas

luka dan pembentukan neovaskular akan menurun melalui proses apoptosis

(Gurtner 2007).

Peningkatan jumlah fibroblas diduga karena efek kandungan senyawa aktif

yang berasal dari ekstrak etanol daun kepel. Hasil ekstraksi etanol 70% daun kepel

mengandung beberapa kandungan senyawa aktif yaitu flavonoid, saponin, dan

tanin. Kandungan tersebut dapat membantu proses penyembuhan luka dengan

mekanisme yang berbeda-beda. Kandungan flavonoid berfungsi sebagai

antioksidan, antimikroba, dan juga anti inflamasi pada luka bakar (Harborne 2000

dan Park et al. 2010). Flavonoid dapat membantu penyembuhan luka dengan

meningkatkan pembentukan kolagen dan meningkatkan jumlah fibroblas (Ambiga

2007). Kandungan saponin dan tanin berperan dalam regenerasi jaringan dalam

proses penyembuhan luka (Reddy 2011). Saponin dapat memicu Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF) dan meningkatkan jumlah makrofag

bermigrasi ke area luka sehingga meningkatkan produksi sitokin yang akan

mengaktifkan fibroblas di jaringan luka (Kimura 2006). Kandungan tanin berguna

sebagai astringen atau menghentikan pendarahan, mempercepat penyembuhan

luka, dan regenerasi jaringan baru (Reddy 2011 dan Nafiu 2011). Selain itu,

kandungan tanin dapat mempercepat penyembuhan luka dengan meningkatkan

penutupan luka serta meningkatkan pembuluh darah kapiler juga fibroblas (Sheikh

2011).

Kelompok yang diberikan salep ekstrak etanol daun kepel konsentrasi 13%

menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok yang

diberikan konsentrasi uji lain dengan nilai rata-rata ketebalan re-epitelisasi

13,65µm ± 0,77. Pada hari ke-7 dan hari ke-14 dari ketiga kelompok yang

diberikan salep ekstrak etanol daun kepel, hanya salep ekstrak etanol daun kepel

konsentrasi 13% yang sebanding dengan kontrol positif. Fase proliferasi luka

dimulai pada hari ke4 hingga hari ke-14, di mana terjadi proliferasi sel epitel

19

untuk menutup luka yang dapat dipengaruhi oleh adanya ujung bebas dari lapisan

epidermis yang telah robek dan beberapa faktor pertumbuhan lain, proliferasi sel

epitel terjadi dengan adanya aktivitas mitosis sel-sel epitel yang berada di dekat

tepi luka, kemudian sel-sel epitel yang sudah matang bergerak dari tepi luka

menuju dermis, sehingga sel epitel bermigrasi dan menyatu di bagian tengah luka

(Handayani 2006).

Pembentukkan re-epitelisasi pada luka bakar yang diberikan salep ekstrak

daun kepel ditingkatkan oleh adanya zat aktif yang terkandung didalamnya, antara

lain saponin, flavonoid dan tanin. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan

oleh Sunarni (2007) daun tanaman kepel mengandung senyawa flavonoid yang

digunakan sebagai antioksidan. Dalam hal ini antioksidan dapat membantu dalam

proses penyembuhan luka yang berperan untuk mengatur kadar ROS (Reactive

Oxygen Species) dalam tubuh, maka apabila kadar ROS meningkat akan

menyebabkan stress oksidatif sehingga kadar antioksidan berkurang dan tidak

dapat melindungi jaringan normal selain itu tidak mampu mengontrol kerusakan,

dengan ini diperlukan antioksidan eksogen dari daun kepel. Selain itu flavonoid

juga dapat membantu proses inflamasi yang berlangsung lebih singkat sehingga

proses reepitelisasi pada penyembuhan jaringan akan terjadi lebih cepat (Sunilson

et al. 2011). Kandungan saponin yang dimiliki pada bagian tanaman dapat

membantu merangsang pembentukan sel epitel yang baru dan mendukung proses

reepitelisasi sehingga mempercepat proses penyembuhan luka (Prasetyo dkk

2010). Kelompok pemberian saponin ini dapat meningkatkan kecepatan migrasi

sel-sel keratinosit pada proses re-epitelisasi lebih tinggi dibandingkan dengan

kelompok kontrol positif, sehingga dapat disimpulkan bahwa saponin tidak hanya

meningkatkan proliferasi sel epidermal namun juga mempercepat proses migrasi

keratinosit yang berperan penting dalam proses re-epitelisasi (Kim YS et al.

2011). Kandungan senyawa tanin berguna sebagai astringen, mempercepat

penyembuhan luka dan regenerasi jaringan baru (Reddy 2011).

Berdasarkan persentase penyembuhan luka didapatkan bahwa konsentrasi

13% mulai dari hari ke 2 sudah menunjukkan adanya perbedaan bermakna

terhadap kontrol negatif. Sedangkan untuk konsentrasi 6,5% dimulai pada hari ke

20

7 dan konsentrasi 3,25% dimulai pada hari ke 10. Pada hari ke 14 persentase

kontriksi luka pada kelompok uji yang diberikan salep ekstrak daun kepel pada

konsentrasi 13% sebesar 92,32% dan kelompok positif sebesar 95,31%. Hal ini

membuktikan bahwa salep ekstrak daun kepel dengan konsentrasi 13% yang

paling cepat menyembuhkan luka bakar dengan persentase yang sebanding

dengan kelompok positif (Burnazin®).

Proses penyembuhan luka mencakup beberapa fase yaitu fase inflamasi,

fase proliferasi dan fase maturasi. Diawali dengan fase inflamasi terjadi segera

setelah luka dan berakhir 3–4 hari di mana terjadi permeabilitas membran sel

sehingga pada fase ini akan terdapat peradangan, kemerahan, nyeri disertai

dengan adanya bula. Sel pertama yang membantu dalam proses penyembuhan

luka adalah neutrofil yaitu sel darah putih yang berfungsi mempertahankan tubuh

terhadap infeksi bakteri. Pada fase inflamasi ini terjadi peristiwa hemostasis

(penghentian perdarahan), dibantu oleh benang-benang fibrin yang saling

bertautan sehingga sel-sel darah merah beserta plasma (platelet) akan terjaring dan

membentuk scab (keropeng). Pencegahan agar luka tidak terkontaminasi

dilakukan oleh makrofag (sel darah putih) yang bekerja membersihkan luka dari

partikel mikroskopik yang tidak diinginkan seperti bakteri dan sel-sel mati.

Tahap awal fase proliferasi dibantu oleh fibroblas yaitu sel yang

menghasilkan kolagen. Pada fase ini kolagen akan bekerja menghubungkan

jaringan-jaringan pada luka bakar untuk membantu mengembalikan kekuatan

jaringan kulit dan mempercepat penyembuhan luka bakar. Proses terlepasnya

keropeng ini bersamaan dengan proses keringnya luka. Hal ini menandakan sudah

terjadinya pertumbuhan sel-sel baru pada kulit sehingga membantu mempercepat

lepasnya keropeng dan merapatnya tepi luka (Aponno et al. 2014). Tahap terakhir

pada proses penyembuhan luka bakar adalah fase maturasi (remodeling), terjadi

pada saat terlepasnya keropeng dan terlihat jaringan kulit yang baru. Pada fase ini

sel yang masih berperan aktif adalah fibroblas dan kolagen yang akan membantu

memberikan elastisitas, kelenturan, dan kelembaban kulit (Sentat 2015).

21

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Ekstrak etanol 70% daun kepel konsentrasi 13% dalam bentuk sediaan

salep memiliki aktivitas penyembuhan luka bakar yang sebanding dengan

kelompok positif (Silver sulfadiazin).

5.2 Saran

Disarankan melakukan penelitian lanjutan terhadap senyawa aktif

terpurifikasi dari daun kepel yang berkhasiat sebagai penyembuh luka bakar.

22

BAB 6 LUARAN YANG DICAPAI

Jurnal

IDENTITAS JURNAL

1 Nama Jurnal Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research

(JPPRes)

2 Website Jurnal https://jppres.com/jppres/

3 Status Makalah Review

4 Jenis Jurnal Jurnal International

4 Tanggal Submit 5 Oktober 2020

5 Bukti Screenshot submit Ada di lampiran

IDENTITAS SEMINAR

1 Nama Seminar ICNSSE

2 Website Jurnal http://conference.uhamka.ac.id/lic

3 Status Makalah Submitted

4 Jenis Prosiding Prosiding International

4 Tanggal Submit 30 November 2020

5 Bukti Screenshot submit Ada di lampiran

IDENTITAS HAK KEKAYAAN INTELEKTUAL

1 Nama Karya -

2 Jenis HKI -

3 Status HKI -

4 No Pendaftaran -

23

BAB VII RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI HILIRISASI

Hasil Penelitian Penelitian ini dilakukan bertujuan untuk mengetahui

aktivitas Ekstrak etanol 70% daun kepel

(Stelechocarpus burahol [Blume] Hook.f. &

Thomson) terhadap pengobatan dan penyembuhan

luka bakar tikus. Dari 4 parameter histologi yang

diukur didapat data yang mengarah kepada

penyembuhan luka bakar tikus. Jumlah makrofag

dari semua kelompok perlakuan pada hari ke 3 (fase

inflamasi) lebih tinggi dibandingkan kontrol negatif,

dan jumlah makrofag lebih rendah pada fase

proliferasi. Konsentrasi 13% memiliki aktivitas

terhadap kepadatan fibroblas dalam mempercepat

penyembuhan luka bakar dan menunjukkan ketebalan

re-epitelisasi yang secara statistik sebanding dengan

Burnazin® (silver sulfadiazine 1%). Salep kepel juga

memberikan efek terhadap penurunan luas luka

bakar. Dari ketiga konsentrasi uji, salep ekstrak daun

kepel dengan konsentrasi 13% paling cepat dalam

penyembuhan luka bakar dengan persentase

kesembuhan pada hari ke 14 sebesar 92,32%. Jangka

pendek hasil penelitian diharapkan dapat

memberikan informasi kepada masyarakat bahwa

Ekstrak etanol 70% daun kepel (Stelechocarpus

burahol [Blume] Hook.f. & Thomson) dapat

digunakan sebagai obat luka bakar.

Rencana Tindak Lanjut Perlu dilakukan penelitian lanjutan terhadap bahan

baku ekstrak yang lebih terpurifikasi dengan

melakukan berbagai metode pemisahan. Ekstrak

terpurifikasi ini diharapkan dapat memberikan efek

yang lebih optimal karena senyawa-senyawa

penganggu/pengotor sudah dihilangkan dan penting

juga untuk mengetahui senyawa aktif yang paling

berperan dalam proses penyembuhan luka bakar.

Selanjutnya ekstrak terpurifikasi ini distandarisasi

dengan melakukan sejumlah pengujian parameter

spesifik dan non spesifik seperti pengukuran cemaran

mikroba, cemaran logam berat, penetapan kadar

senyawa zat aktif dll. Sehingga syarat ekstrak untuk

pemenuhan unsur keamanan dan kualitas bahan baku

obat tradisional bisa terpenuhi.

24

DAFTAR PUSTAKA

Almeida A, Noronha C. 2000. Local Burn Treatment-Topical Antimicrobial

Agents. Annuals of Burns and Fire Disasters, 13 (4), pp. 216-219.

Anggraeni RA. 2013. Uji Aktivitas Antihiperurisemia Ekstrak n-Heksan, Etil

Asetat dan Etanol 70% Daun [Stelechocarpus burahol (BI.) Hook.F. &

Th.] Pada Mencit Putih Jantan Hiperurisemia. Skirpsi. Fakultas Farmasi

Universitas Jember, Jember.

Ambiga, Narayanan, Gowri D, Sukumar, and Madhavan. 2007. Evaluation of

Wound Healing Activity of Flavonoids from Ipo-moea carnea Jacq.

Ancient Science of Life. XXVI: 45-51.

Atiyeh B, Michael C, Shady WH. 2007. Effect of Silver on Burn Wound Infection

Control and Healing: Review of Literatur Burns. 33. Hlm:139-148

Corwin EJ. 2009. Buku Saku Patofisiologi. Edisi 3. EGC. Jakarta. Hlm:127

Dwintanandi C, Yanuar IN, Suka DR. 2016. Pengaruh Ekstrak Kulit Manggis

(Garcinia mangostana Linn.) terhadap Jumlah Makrofag Pada Infmasi

Pulpa. Jurnal Kedokteran Gigi. Vol:2. Hlm:151-157.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (2008). Farmakope Herbal Indonesia

Edisi I. Jakarta: Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Hlm.

171-174.

Franklin H. 2007. Cutaneous Wound Healing. The New England Journal Of

Medicine. Vol. 341(10). Hlm:738-746

Gurtner GC. 2007. Wound healing, normal and abnormal. In: Thorne CH, Beasly

RW, Aston SJ, Bartlett SP, Gurtner GC, Spear SL. 2007. Grabb and

Smith’s plastic surgery. Edisi 6. Philadelphia: Lippincott Williams and

Wilkins. USA. hlm:15-22

Haryjanto L. 2012. Konservasi Kepel (Stelechocarpus burahol (Blume) Hook.f &

Thomson): Jenis Yang Telah Langka. Mitra Hutan Tanaman. Volume

7(1). Hlm. 11-17

Hidayat A. 2011. Fraksionasi Golongan Flavonoid dari Daun Kepel

(Stelechocarpus burahol) yang Berpotensi Sebagai Antibakteri. Skripsi.

Fakultas MIPA IPB, Bogor. Hlm 1

Hidayat TSN. 2013. Peran Topikal Ekstrak Gel Aloe Vera Pada Penyembuhan

Luka Bakar Derajat Dalam Pada Tikus. Skripsi. Fakultas Kedokteran

Universitas Airlangga. Surabaya. Hlm. 1

Hanani E. (2015). Analisis Fitokimia. EGC, Jakarta. Hlm. 10-13, 69, 86, 125, 154,

239.

Harborne JB. (1987). Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisa

Tumbuhan Terbitan Kedua. ITB Pers, Bandung.

Harborne JB and Williams CA. 2000. Advanc-es in Flavonoid Research Since

1992. Phytocemistry. 481-504.

25

Kimura Y, Sumiyoshi M, Kawahira K, and Sakanaka M. 2006. Effects of Ginseng

Saponins Isolated from Red Ginseng Roots on Burn Wound Healing in

Mice. British Journal of Pharmacology. 148: 860-870.

Ledbetter K. 2010. Panduan HELP untuk Kontraktur Akibat Luka Bakar di

Negara Berkembang. Global Help. Hlm. 8

Moenadjat Y. 2009. Luka Bakar Masalah dan Tatalaksana. Edisi 4. FKUI.

Jakarta. Hal:5-9

Mulia VD, Soemamo T. 2012. Overekspresi HSP70 oleh Makrofag karena

Induksi Low-Level Leser Pada Luka Bakar. Majalah Patologi. Vol:21(1).

Hlm: 26-31.

Mutiara G, Nurdiana, Yuliana WU. 2015. Efektifitas Hidrogel Binahong

(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) terhadap Penurunan Jumlah Makrofag

pada Penyembuhan Luka Fase Proliferasi Tikus Putih (Rattus norvegicus)

Galur Wistar Kondisi Hiperglikemia. Majalah Kesehatan FKUB. Volume

2(1). Hlm. 29-40

Mustaba R, Dkk. 2012. Studi Histopatologi Lambung pada Tikus Putih yang

Diberi Madu sebagai Pencegah Ulkus Lambung yang Diinduksi Aspirin.

Indonesia Medicus Veterinus 2012 1(4). Bali. Hlm 471-482.

Nazrun A, Dkk. 2005. The Effect of Carica papaya Linn. Latex on the Healing of

Burn Wounds in Rats. Journal Sains Kesihatan Malaysia 3 (2). Hlm 39-

47.

Novriansyah R. 2008. Perbedaan Kepadatan Kolagen Disekitar Luka Insisi Tikus

Wistar yang Dibalut Kasa Konvensional dan Penutup Oklusif Hidrokoloid

selama 2 dab 14 hari. Skripsi. Magister Ilmu Biodemik dan Program

Pendidikan Dokter Spesialis Ilmu Bedah Universitas Diponogoro,

Semarang. Hlm. 2

Pribadi P, Elmawati L, Rohmayanti. 2014. Pemanfaatan Perasan Buah Kepel

(Stelechocarpus burahol (Blume) Hook.f & Thomson) Sebagai Antiseptik

Luka. Pharmaciana. Volume 4(2). Hlm. 177-183

Puspitasari L. 2015. Pengaruh Ekstrak dan Serbuk Mentimun (Cucumis sativus)

Terhadap Jumlah Makrofak Pada Penyembuhan Luka Bakar Derajat II B

pada Tikus Wistar. Skripsi. Fakultas Kedokteran Universitas Jember,

Jember. Hlm. 4

Prabakti Y. 2005. Perbedaan Jumlah Fibroblas di Sekitar Luka Insisi Pada Tikus

yang Diberi Infiltrasi Penghilang Rasa Nyeri Levobupivakain dan yang

Tidak Diberi Levobupivakain. Karya Tulis Ilmiah Strata Dua. Semarang:

Universitas Diponegoro Semarang.

Robbins. 2007. Buku Ajar Patologi Edisi 7 Volume 1. Jakarta: EGC.

Ramadhan BC, Aziz SA, Ghulamahdi M. 2015. Potensi Kadar Bioaktif yang

Terdapat Pada Daun Kepel (Stelechocarpus burahol). Bul.Litro volume: 26

(2). Hlm. 99-108

Reddy BK, Gowda S, dan Arora AK. 2011. Study of Wound Healing Activity of

Aqueous and Alcoholic Bark Extracts of Acacia catechu on Rats. RGUHS

Jour-nal of Pharmaceutical Sciences. Vol:1(3): 220-225.

26

Saroja M, Santhi R dan Annapoorani S. 2012. Wound Healing Activity of

Flavonoid Fraction of Cynodon dactylon in Swiss Albino Mice.

International Research Journal of Pharmacy. Vol:3(2): 230-231.

Sentat T, Rizki. 2015. Uji Aktivitas Ektsrak Etanol Daun Alpukat (Persea

americana Mill.) Terhadap Penyembuhan Luka Bakar Pada Punggung

Mencit Putih Jantan. Dalam: Jurnal Ilmiah Manuntung. Hlm:100-106

Sunarni T, Suwidjiyo P, Ratna A. 2007. Flavonoid Antioksidan Penangkap

Radikal dari Daun Kepel (Stelechocarpus burahol (Blume) Hook.f &

Thomson). Majalah Farmasi Indonesia. Volume 18(3). Hlm. 111-116.

Sheikh AA, Sayyed Z, Siddiqui AR, Pratapwar AS, and Sheakh SS. 2011. Wound

Healing Activity of Sesbania grandiflora Linn Flower Ethanolic Extract

Using Ex-cision and Incision Wound Model in Wistar Rats. International

Journal of PharmTech Research. 3(2): 895-898.

Tiwari VK. 2012. Burn Wound: How It Differs From Other Wounds?. Indian J

Plast Surg. Vol. 45. Hlm:364-373.

World Healty Organization. Global Burns review 2016: WHO.

http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/91355/1/9789241564656_eng.pdf.

diakses tanggal 8 Mei 2017.

27

A. BUKI LUARAN WAJIB

28

Efficacy of Kepel (Stelechocarpus burahol [Blume]

Hook.f. & Th) Leaves’ Ethanol Extract Ointment in the

Healing Process of Burn Wound on Rats

Vera Ladeska 1*, Lusi Putri Dwita1, Fadilla Oktaviany1, Ovimia Fathonah Putri1, Yuni Salamah1

Faradita Amelia1

1Faculty of Pharmacy and Sciences, University of Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka Jl. Delima II/IV Klender, Jakarta 13460, Indonesia

*E-mail address: vera_ladeska@ uhamka.ac.id.

Author Institutional e-mail (mandatory) Other e-mail

(gmail, yahoo, etc.)

Vera ladeska vera_ladeska@uhamka.ac.id v_ladeska@yahoo.com

Lusi Putri Dwita lusi_putridwita@uhamka.ac.id lusiputridwita@gmail.com

Fadilla Oktafiany - fadillaoff@gmail.com

Ovimia Fathonah Putri - ovimiafathonahputri@gmail.com

Yuni salamah - yunisaaaa@gmail.com

Faradita amelia - faraditamelia@gmail.com

29

Contribution Details

Contribution Vera Lusi Fadilla Ovimia Yuni Faradita

Concepts or Ideas x

Design x x

Definition of intellectual content x x

Literature search x x x x x x

Experimental studies x x x x x x

Data acquisition x x x x x x

Data analysis x x x x x x

Statistical analysis x x x x x x

Manuscript preparation x

Manuscript editing x

Manuscript review x x

ABSTRACT

Context: One of the benefits of kepel plant is as a wound antiseptic. Research continued on burns in rats with extract formulas in the form of ointments. The process of healing burns by observing the histopathological parameters. Aims: To determine the activity of Stelechocarpus burahol ethanol extract ointment on the number of macrophages, fibroblast density, reepithelialization , and burn wound surface in rats. Methods: The number of macrophages and fibroblast density were measured by observing the cells in 10 fields of view under a 400x microscope magnification. The thickness of the re-epithelialization was measured using the Image Raster 3.0 application. The measurement of the burn area used the Macbiophotonic Image J program. Results: Histological observations showed a increase in the number of macrophages, fibroblasts, re-epithelialization and a decrease burn area in the extract ointment group significantly compare to the negative control, and at a concentration of 13% showed comparable results with silver sulfadiazine. It can be concluded that kepel leaf ointment extract can accelerate the healing of burn wound with the best results at a concentration of 13%.

Conclusions: Kepel (Stelechocarpus burahol ) leaves ethanol extract ointment at a concentration of 13 % accelerates the healing of burns by observed macrophages, fibroblast density, re-epithelialization and burn area. Keywords: Stelechocarpus burahol, burn, macrophages, fibroblast, re-epithelialization , area of the burn

INTRODUCTION

Indonesia is a country with rich biological resources. Indonesia’s forest biodiversity is a national asset which have priceless benefits to human beings. One of those benefits is its use as medicine, i.e. kepel plant. Kepel (Stelechocarpus burahol [Blume] Hook.f. & Th) is a native Indonesian plant which is the symbol of Special Region of Yogyakarta and can be found in the palaces in the region (Haryjanto, 2012).

Burn wound is a form of tissue damage or tissue loss caused by exposure to heat sources i.e. fire, hot water, chemical substances, electricity, and radiation (Moenadjat, 2009). The severity of the wound is determined by two factors, first is the width of the surface area exposed, and second is the depth of the burn, which categorized into first-degree burn, second-degree burn, and third-degree burn (Corwin, 2009). Third-degree burn is a full depth burn involving the epidermis, dermis, and appendix part of the skin. The healing process of burn is

30

very complex, thus stabilizing the general condition, the healing care, and also preventing and treating the complications is considered costly, especially since the complications could lead to morbidity and mortality. There’s a need to resolve the problems effectively, safely, and reasonably affordable. One of the alternatives is by using traditional medicine.

Based on a research by Sunarni et al., (2007), kepel leaves have antioxidant ability. Another research also stated that kepel leaves’s juice with 60% concentration showed healing process activity in open wound on rats with 59.84% of healing percentage (Pribadi et al, 2014). Based on the kepel leaves’ antioxidant and antibacterial activity, and also including the kepel juice’s role in the healing process of open wound, there’s a possibility that the 70% kepel leaves’ ethanol extract could have the ability to boost the healing process of burn wound. This research aim is to proof the efficacy of kepel leaves in healing burn wounds.

This research is carried out on rats which have been induced with third-degree burn and will be observed by measuring four parameters, the number of macrophages, fibroblast density, reepithelialization speed, and the decrease of burn wound surface area. The measurement will be done by using Image Raster 3.0 application. This parameters measurement will support the data that will prove the efficacy of kepel leaves on burn wound medication. It is hoped that the result of this study could increase the knowledge on the efficacy of native Indonesian plants and useful in the burn wound healing process.

MATERIAL AND METHODS

Materials Materials used in this research are kepel leaves obtained from The Research

Center for Spices and Medicinal Plants (BALITTRO), Vaseline, Silver Sulfadiazine (Burnazin®), Ketamine injection. All chemical used in this study were analytical grade.

Preparation of Extract

The kepel leaves could be determine in “Herbarium Bogoriense”, Botanical

field, Biology Research Center, Indonesian Institute of Sciences (LIPI), Cibinong

with register No. 1592/IPH.1.01/If.07/VI/2017 . Kepel leaves ( 7 kg) was washed

with running water and dried under the sun. The sample was grinded and sieved

with a 40 mesh sieve. Then extracted (1.2 kg) with 8 L ethanol 70% by

maceration. The maceration process was repeated twice for residue at same

duration (48 hours). The macerat was evaporated in vacuum rotary evaporator

and continued with 40ºC waterbath until it attains the form of thick extract. This

extract labelled as KLEE ( Kepel Leaves’ Ethanol Extract)

31

Preparation of Test Animals

Rats that was used as test animal was acclimatized and given food and

drink daily. There were 30 Sprague Dawley male white rats (Rattus norvegicus)

weighed 150-200 g. The research procedure has been approved by the Health

Research Ethics Commission University of Muhammadiyah Prof.DR.Hamka

with ethical approval letter number : 02/17.10/017

Determination of Extract Characteristics

Organoleptic observations of KLEE include of shape, color, odor, and taste. Determination of Loss on Drying is done by using gravimetric, where 2g of thick extract is weighed in a calibrated and dried it at 105 °C in an oven for 30 minutes until constant weight (Depkes, 2008). Preliminary phytochemical screening was carried out for KLEE by testing several secondary metabolites. This extract were being tested for its alkaloids content using Dragendorff, Mayer and Bouchardat reagents, flavonoid test (Shinoda and ammonia test), tannin test (test with gelatin and FeCl3), saponin test (foam test) and steroid and terpenoid test (Liebermann Burchard test) (Hanani, 2014).

Preparation of KLEE ointment

KLEE ointment with a concentration of 3.25% ; 6.5% ; 13% (w/w) is made by weighing 0.325; 0.65; 1.3 g of KLEE then add vaselin flavum until 10 g and crushed until homogeneous. Generating Third-Degree Burn and Treatment of Test Animals

The rats are anesthetized by using ketamine injection at a dose of 40.08 mg/kgBB intramuscular. A special metal plate with 1.5 cm x 1.5 cm in diameter is heated until it reached 100ᵒC, which then would be paste for 30 seconds on the back part of the rat that was shaved previously. After the wound was generated, the rat is given analgetic medication orally. There are 6 test groups namely KLEE with concentration of 3.25%, 6.5%, and 13%, Burnazin® (positive control), and vaselin flavum (negative control ) is then spread evenly on the wound surface twice daily (morning and afternoon) for each treatment for 14 days (Nazrun, 2005). Dosing and treatment of test animals can be seen in table 1.

Table 1. Dosing and Treatment of Test Animals

Days to

Groups

I

II

III

IV

V

1 Shearing rats

2 Rats were burnt with a special metal plate at 100°C for 5 seconds

32

3-16 Rats were given KLEE

ointment with a concentration

of 3.25%

Rats were given KLEE

ointment with a

concentration of 6.5%

Rats were given KLEE

ointment with a

concentration of 13%

Rats were given vaselin

flavum (negative control)

Rats were given

Burnazin® (positive control)

3,7,14 Wound tissue was taken on day 3,7,14 after burns were induced for histological

observations

Histology Sample Preparations Skin tissue samples are taken from the biopsy of the burn wound and the

subcutaneous fat tissue. The sample is taken on the third, seventh, and 14th day after giving the test sample. Before samples are taken, the testing animal is anesthetized by using ketamine injection. The specimen is then fixated by using Buffer Neutral Formalin 10% solution.

Histopathology Sample Preparations The tissue is fixated by using Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% solution

and left at room temperature for 24 hours. The tissue is then cut to pieces and placed in a specimen container made from plastic. Subsequently, it will go through dehydration process done with a graded alcohol concentration, which is 70%, 80%, 90%, for 2 hours each. Later, the clearing process is done by using xylol to eliminate alcohol traces. After that, the molding process is done by using paraffin blocks and stored in the fridge. These paraffin blocks are then sliced thinly around 6-8 µm by using microtom. Afterwards, these pieces are floated on 60°C warm water (waterbath) to stretch the tissue and avoid creasing. These specimens are then lifted and placed on object glass to do the Hematoxyllin and Eosin (HE) staining and later observed under the microscope (Mustaba, 2012). Data Analysis

Obtained data in form of numbers of macrophages, numbers of fibroblast, and collagen density is statistically analyzed by using the one-way ANOVA test with 95% confidence (α = 0,05). Tukey test is then used to observe whether there is significant difference.

RESULTS (AND DISCUSSION)

Kepel leaves’ ethanol extract (KLEE) is obtained through maceration method by using ethanol 70% as the solvent. The maserat is then evaporated by using vacuum rotary evaporator at 50ᵒC until the thick extract is obtained. This 70% kepel leaves’ ethanol extract characteristics are semi solid, has a unique smell, bitter taste, and blackish green color. The phytochemical screening results showed that this extract contain flavonoid, saponin, and tannin. This extract yields 11.25% and the loss on drying is 8.92%. Organoleptic and homogeneity observations of the 70% kepel leaves’ ethanol extract ointment showed homogenous consistency with the color of the ointment darkens as the extract concentration increases.

33

The parameters observed from the histology samples are the numbers of macrophages, fibroblast density, and reepithelialization thickness by observing 10 field views. The width of the burn wound is measured by processing the image using the Macbiophotonic Image J program.

The burn wound model on rats as test animal is made by inducing third-degree burn which damage the tissue until the dermis. The prepared samples used are 70% kepel leaves’ ethanol extract at the concentration of 3.25%, 6.5%, 13%; Burnazin® as the positive control group and vaseline flavum as the negative control group. The reason Burnazin® was chosen as the positive control group is because it is the gold standard for burn wound topical treatment due to the Silver Sulfadiazine (SSD) as its active agent. SSD inhibits bacterial DNA replication and damages bacterial cell wall. The silver content in SSD also has antibacterial functions that help cleanse the wound thus avoids compromising the tissue regeneration (Atiyeh, 2007; Almeida et al., 2000). The sample preparation in the form of ointment with vaseline flavum base has a hydrocarbon characeristics which is not easily disolved in water, thus prolonged the contact between the medical ingredients and skin (Sentat, 2015).

Burn wound is a form of tissue damage or loss caused by exposure to heat sources, i.e. fire, hot water, chemical substances, electricity, and radiation (Moenadjat, 2009). Generally, the healing process is divided into 3 phases. The early phase or the inflammation phase is started immediately after the injury happened where it eliminates dead tissues and avoid infection. The second phase is the proliferation phase where the balance between the scar tissue formation and tissue regeneration occur. The third phase is the maturation phase that aimed at maximizing the structural strength and integrity of the wound (Gutneer, 2007). The healing process of burn wound has similarities with other wound healing process in general, yet had a different duration for each phase (Tiwari, 2012).

Macrophage cells calculation process is done by taking the image from a light microscope which then observed and counted by using Image Raster 3.0 application. The result of the ANOVA table on the number of macrophages on the third, seventh, and 14th day showed significant difference on every group (p<0.05). On the third day of observation, the number of macrophage cells on the 13% concentration group is higher than the 6.5%, 3.25%, and negative control group, with the lattest has the lowest number ( Table 2). This is due to the macrophages became the predominant cell at the third day after the wound occured. Macrophage is an effective cell for the phagocytosis process where the macrophage phagocytoses pathogens, foreign bodies, and other unnecessary cells. Macrophages in the tissue originates from the monocyte cells in the blood that migrated to the connective tissue. In cases that inflammation happened, the number of monocytes that migrated to the connective tissue will increase, thus the macrophages is activated (Franklin 2007; Dwintanandi et al., 2016).

On the seventh and 14th day of observation, the number of macrophages in the 13% concentration group is equivalent with the positive control group and the 6.5% concentration group, yet showed significant difference with the negative control group and the 3.25% concentration group (Table 2). This result shows that inflammation process in the negative control group is still in progress. The high

34

number of macrophages in the negative control group indicates a prolonged inflammation due to the growth of more microorganism in the burn wound. The absence of active ingredients in the negative control group might be the reason of the presence of microbes and the number of tissue damage that needs to be phagocytosed by the macrophage in the wound area (Sura et al. 2013). Thus, the wound healing process in the negative control group will be prolonged and lead to the delay of proliferation phase. In the 13% concentration group and also other consentration group, the number of macrophages is lower which indicates the end of inflammation process and mark the beginning of the proliferation process.

Table 2. The mean value of macrophage

Groups The third day The seventh day The 14th day

Positive control 139.3±8.944 104.725±5.998 94.975±6.602

Negative control 109.875±7.221 119.95±7.083 112.3±4.231

KLEE oint 3,25% 116.421±5.549b 114.900±5.780b 106.37±3.398b

KLEE oint 6,5% 124.175±7.322b 109,925±4.332b 99.875±4.678b

KLEE oint 13% 134.3±6.710a,b 107.025±4.0343a,b 97.025±3.927a,b

Note : a not significantly different from positive control (p>0,05)

b significantly different from negative control (p<0,05)

During the proliferation phase, macrophage is also needed to produce growth factors such as fibroplatic growth factor, Transforming Growth Factor-Beta (TGF-β). Macrophages also activated fibroblasts and increase their migration which play a role in tissue formation process and produce collagens (Mulia 2012; Hesketh et al., 2017).

Administration of KLEE ointment could speed the inflammation phase on burn wound. It is supposed to be related to the presence of secondary metabolite compounds in the kepel leaves’ extract that helps the healing process such as flavonoids, saponin, dan tannin which functions as antioxidant and antimicrobial agent that affects the wound healing (Saroja, et al. 2012). Tannin and saponin also have the ability as an antiseptic agent. Saponin could trigger the Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and increase the number of macrophages that migrate towards the wound area thus increase the production of cytokine that activates fibroblast in the wound tissue (Reddy,et al., 2011).

Another wound healing parameter which is fibroblast density could be seen in Table 3. The third day observation showed the mean density of the fibroblast in all of the concentration groups have significant difference with the negative control group. Fig.1 showed that fibroblast density in all of the concentration groups still have a small number due to the fibroblast is yet to have a role in the inflammation process.

35

Figure 1. Histological picture on day 7 at 400x magnification under a light microscope ( Olympus) arrows indicate fibroblast : A) Negative Control Group; (B) KLEE oint 3.25%; (C)

KLEE oint 6.5%; (D) KLEE oint 13%, E) Positive Control Group. KLEE : Kepel Leaves’ Ethanol Extract

Fibroblast start to have a part in both proliferation and maturation phase (Prabakti, 2005). The seventh day of observation showed the mean density in the 13% concentration group does not have significant difference with the positive control and 6.5% concentration groups. Significant difference is only found between the negative control and 3.25% concentration groups. The increase number of fibroblast cell would trigger the increase number of collagen fibers which speed the process of wound healing. The 14th day observation showed the mean density of fibroblast in the 13% concentration group does not show significant difference with the positive control and 6.5% concentration groups. This shows that the proliferation of fibroblast determines the end result of wound healing. Fibroblast produces extracellular matrix which then will be replaced by collagen. Fibroblast will disappear immediately as the collagen matrix fill the wound cavity and the formation of neovascular will decrease through the apoptosis process (Gurtner, 2007).

A B C

D E

36

Table 3. The mean value of Fibroblast Density

Groups

The third day

The seventh day The 14th day

Positive control Negative control

58,65 ± 4,577a 29,5 ± 2,8191

73,15 ± 4,577a 49,55 ± 3,1030

34,87 ± 3,4674a 50,9 ± 4,9139

KLEE oint 3.25% 45,95 ± 3,2602a 63,2 ± 4,1688a 43 ± 3,9603a

KLEE oint 6.5% 49,75 ± 4,2534a 67,35 ± 4,3922a 38,95 ± 3,5388a

KLEE oint 13% 51,2 ± 3,6685a 70,18 ± 4,1372ab 37,02 ± 3,0842ab

Note : a significantly different from negative control (p<0,05)

b not significantly different from positive control (p>0,05)

Reepithelialization thickness as another wound healing parameter does not show any significant results during the third day of observation. On the seventh and 14th day of observation, the 13% concentration group has an equivalent value with the positive control group, where the mean value of the reepithelialization thickness is 13.65 µm ± 0.77 (Table 4). It could be interpreted that wound proliferation started on the fourth day until the 14th day, where the epithelial cell proliferation closed the wound that was affected by the epithelial cells’ mytosis activity in the wound edges, subsequently the mature epithelial cells will move from the wound edges to the dermis, thus epithelial cells migrated and attached together at the center part of the wound (Handayani, 2006).

Table 4. The mean value of the reepithelialization thickness

Groups The third day The seventh day The 14th day

Positive control

Negative control

15.86 ± 0.63

7.72 ± 0.55

21.67 ± 0.76

10.84 ± 0.60

30.67 ± 0.90

25.06 ± 0.94

KLEE oint 3,25% 10.78 ± 0.58b 15.79 ± 0.69b 26.10 ± 0.74b

KLEE oint 6,5% 12.72 ± 0.59b 18.22 ± 0.65b 28.95 ± 0.73b

KLEE oint 13 13.65 ± 0.77b 21.66 ± 0.73a 30.55 ± 0.90ab

Note: (a) = not significantly different from positive control (p > 0,05),

(b) = significantly different from negative control (p< 0,05)

37

Figure 2 it can be seen that the positive control group and KLEE ointment concentration of 13% showed thicker epithelial formation compared to all test groups. In the proliferation phase, the thickness of the epithelial layer continues to increase until the wound area closes completely. Epithelium layered in the epidermis which is composed of many layers of cells called keratinocytes. These cells are constantly renewed through the mitosis of cells in the basal layer which are gradually shifted to the epithelial surface (Kalangi, 2013).

Figure 2. Histological picture on day 14 at 100x magnification, observed under a light microscope (Olympus) arrow showing Re-

epithelialization: (A) KLEE oint 3.25%; (B) KLEE oint 6.5%; (C) KLEE oint 13%; (D) Negative Control Group E) Positive Control Group. KLEE : Kepel Leaves’ Ethanol Extract

The observation of the wound surface area is done by using Macbiophotonic Image J program. Based on the microscopic observation from the first day until the 14th day, it is showed that there’s a decrease in wound surface area. On the first day, the wound appears pale white and is still wet. On the third day, the wound in all test groups appears large and swollen, which indicates that the inflammation process is still in progress (Table 5). The inflammation process role is to prevent the entry of bacteria, eliminate dirts from the wound tissue and prepare the advanced healing process (Gurtner 2007). On the seventh day, the wound appears reddish brown on the positive control group while on the 6.5% and 13% concentration group showed the formation of scab and the wound began to shrink in size. On the 14th day, the wound has dried out and the scabs started to come off.The removal of scab indicates the growth of new cells thus speeds the process and help attaching the wound edges (Aponno et al. 2014).

38

Wound constriction percentage in the 13% concentration group is 92.32% and in positive control group is 95.31% on the 14th day of observation. This proves that the 13% kepel leaves’ ethanol extract oinment is the fastest in healing burn wound with a percentage that is proportional to the positive control group (Burnazin®).

Table 5. Average Percentage of Burns Healing

Days

to

Negative

Control

Positive Control

KLEE oint 3,25% KLEE oint 6,5% KLEE oint 13%

1 1.22±0.45 1.23±0.07 1.55±0.31 1.60±0.33 1.83±0.35

2 1.35±0.55 3.43±0.74* 2.32±0.69 3.57±1.02 3.18±0.55*

3 1.84±1.00 7.08±2.16* 3.62±1.46 50±1.60 6.52±2.93*

4 3.55±2.23 10.87±2.24* 7.40±4.07 8.50±1.77 10.11±3.12*

5 6.44±3.20 16.72±2.80* 11.16±6.24 12.44±3.86 15.50±5.93*

6 8.84±4.04 22.98±3.04* 13.52±6.41 15.89±3.58 20.33±6.02*

7 11.02±3.30 26.92±2.42* 17.50±5.50 21.09±5.81* 27.13±3.54*

8 13.06±3.40 35.84±8.54* 21.92±7.91 24.71±4.92* 31.03±3.10*

9 15.81±2.65 46.77±10.71* 26.27±7.36 29.75±5.80* 37.93±3.71*

10 18.25±2.54 57.46±7.06* 32.54±7.94* 40.33±3.58* 48.94±6.57*

11 20.04±2.20 67.41±6.85* 39.72±4.09* 46.64±6.48* 57.04±3.3*

12 22.67±1.85 84.00±5.70* 44.25±2.74* 51.70±5.47* 76.55±6.56*

13 25.09±1.51 92.25±3.00* 48±54±1.44* 56.30±4.12* 84.34±4.67*

14 26.72±1.77 95.31±2.72* 51.64±2.49* 61.70±4.34* 92.32±2.58*

Notes : * = significantly different from negative control (p< 0,05)

DISCUSSION

This section should deal with the interpretation, rather than recapitulation of results. It is important to discuss the new and significant observations in the light of previous work. Discuss also the weaknesses or pitfalls in the study. New hypotheses or recommendations can be put forth. Avoid unqualified statements and conclusions not completely supported by the data. Repetition of information given under Introduction and Results should be avoided.

39

CONCLUSION

Based on this research, it could be concluded that the 70% kepel leaves’ ethanol extract with 13% concentration shows burn wound healing acceleration activity with decreased number of macrophages and wound surface area and also the increase of fibroblast density and reepithelialization thickness.

CONFLICT OF INTEREST

The authors declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGMENT

Acknowledgement is conveyed to the Research Institute and the Faculty of Pharmacy of Prof. Dr. Hamka University whom funded this research. Extended acknowledgement also conveyed to the Pathology Anatomy Laboratorium of Faculty of Medicine of Indonesia University whom gave permission of accesing the laboratorium facility.

REFERENCES

Almeida A, Noronha C (2000) Local Burn Treatment-Topical Antimicrobial Agents. Annuals of Burns and Fire Disasters, 13 (4): 216-219.

Atiyeh B, Michael C, Shady WH (2007) Effect of Silver on Burn Wound Infection Control and Healing: Review of Literatur Burns. 33 :139-148

Corwin EJ (2009) Pathophysiology Pocket Book. 3rd edition EGC. Jakarta:127 Departemen Kesehatan Republik Indonesia (Health Department of RI). 2008.

Farmakope Herbal Indonesia Edisi I. Jakarta : 175. Dwintanandi C, Yanuar IN, Suka DR (2016) Effect of Mangosteen Skin Extract

(Garcinia mangostana Linn.) On macrophages . Journal of Dentistry. Vol:2:151-157.

Franklin H. (2007) Cutaneous Wound Healing. The New England Journal Of Medicine. Vol. 341(10):738-746

Gurtner GC ( 2007) Wound Healing, Normal and Abnormal. In: Thorne CH, Beasly RW, Aston SJ, Bartlett SP, Gurtner GC, Spear SL. 2007. Grabb and Smith’s plastic surgery. Edisi 6. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins. USA :15-22

Hanani E (2014) Phytochemical Analysis. EGC medical book publisher. Jakarta:10-13 Kalangi, S. J. R. (2013). Skin histophysiology. Biomedical Journal (JBM), 5(3):12–20.

Moenadjat Y (2009). Burns, Problems and Management. Edisi 4. Faculty of

Medicine, University of Indonesia . Jakarta:5-9 Mustaba R, Idabagus OW, I Ketutbrata (2012) Gastric Histopathology Study in

White Rats Given Honey as a Prevention of Aspirin-Induced Gastric Ulcers. Indonesia Medicus Veterinus 1(4). Bali: 471-482.

Nazrun A, Mohd Syukri, Ahamad A (2005) The Effect of Carica papaya Linn. Latex on the Healing of Burn Wounds in Rats. Journal Sains Kesihatan Malaysia 3 (2): 39-47

40

Pribadi P, Elmawati L, Rohmayanti (2014) Utilization of Kepel Fruit (Stelechocarpus burahol (Blume) Hook.f & Thomson) as a wound antiseptic. Pharmaciana. Vol 4(2): 177-183

Reddy BK, Gowda S, dan Arora AK (2011) Study of Wound Healing Activity of Aqueous and Alcoholic Bark Extracts of Acacia catechu on Rats. RGUHS Jour-nal of Pharmaceutical Sciences. Vol:1(3): 220-225.

Saroja M, Santhi R dan Annapoorani S (2012 )Wound Healing Activity of Flavonoid Fraction of Cynodon dactylon in Swiss Albino Mice. International Research Journal of Pharmacy. Vol:3(2): 230-231.

Sentat T, Rizki (2015) Ethanol Extract Activity Test of Avocado Leaves (Persea americana Mill.) Against Healing Burns on the Back of Male White Mice . Manuntung Scientific Journal:100-106.

Sura GM, Carabelly AN, Apriasari ML (2013) Application of 100% Haruan Extract (Channa striata) on back wounds of mice (Mus musculus) Against the Number of Neutrophils and Macrophages . PDGI Journal. Vol:62 (2) :41-44

Tiwari VK. (2012) Burn Wound: How It Differs From Other Wounds?. Indian J Plast Surg. Vol. 45:364-373.

World Healty Organization. Global Burns review (2016): WHO. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/91355/1/9789241564656_eng.pdf. accessed date 8 Mei 2017.

41

B. LUARAN TAMBAHAN (ORAL PRESENTER DAN PROSIDING

SEMINAR INTERNASIONAL)

42

Effect of Kepel (Stelechocarpus burahol [Blume]

Hook.f. & Th) Leaves’ Extract Ointment on

Macrophages and Fibroblasts in Rat Burns

Vera Ladeska 1*

, Lusi Putri Dwita1, Fadilla Oktaviany

1, Ovimia

Fathonah Putri1

1Faculty of Pharmacy and Sciences, University of Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka Jl. Delima

II/IV Klender, Jakarta 13460, Indonesia

*E-mail address: vera_ladeska@ uhamka.ac.id.

Abstract. Kepel (Stelechocarpus burahol [Blume] Hook.f & Thomson) is a native flora of Indonesia

useful as an antibacterial, antioxidant, antifungal and antiseptic. Antibacterial and antioxidant activity on

kepel leaf can the healing of wounds and the content of chemical compounds such as flavonoids and tannins,

as the background of this research as a healer for burns wound. This study aimed to determine the activity of

70% ethanol extract of kepel leaf which is formulated in the form of ointment to be more effective and

efficient. Testing is done by modeling burn rat with observations the number of macrophages, and fibroblast

density. The animals used for this study were 30 rats, divided into five groups concentrations 3.25%, 6.5%,

13% kepel leaf extract ointment, negative control (vaseline flavum) and positive control (silver sulfadiazine).

Observations were held on days 3, 7, and 14 histologically. Histological observations showed a decrease in

the number of macrophages and fibroblasts significantly compare to the negative control, and at a

concentration of 13% showed comparable results with silver sulfadiazine. It can be concluded that kepel leaf

ointment extract can accelerate the healing of burn wound with the best results at a concentration of 13%.

Keywords : Burn, fibroblast, macrophages, Stelechocarpus burahol

INTRODUCTION

Indonesia is a country with rich biological resources. Indonesia’s forest

biodiversity is a national asset which have priceless benefits to human beings.

One of those benefits is its use as medicine, i.e. kepel plant. Kepel

(Stelechocarpus burahol [Blume] Hook.f. & Th) is a native Indonesian plant

which is the symbol of Special Region of Yogyakarta and can be found in the

palaces in the region (Haryjanto, 2012).

Burn wound is a form of tissue damage or tissue loss caused by exposure to

heat sources i.e. fire, hot water, chemical substances, electricity, and radiation

(Moenadjat, 2009). The severity of the wound is determined by two factors, first

is the width of the surface area exposed, and second is the depth of the burn,

which categorized into first-degree burn, second-degree burn, and third-degree

burn (Corwin, 2009). Third-degree burn is a full depth burn involving the

43

epidermis, dermis, and appendix part of the skin. The healing process of burn is

very complex, thus stabilizing the general condition, the healing care, and also

preventing and treating the complications is considered costly, especially since the

complications could lead to morbidity and mortality. There’s a need to resolve the

problems effectively, safely, and reasonably affordable. One of the alternatives is

by using traditional medicine.

Based on a research by Sunarni et al., (2007), kepel leaves have antioxidant

ability. Another research also stated that kepel leaves’s juice with 60%

concentration showed healing process activity in open wound on rats with 59.84%

of healing percentage (Pribadi et al, 2014). Based on the kepel leaves’ antioxidant

and antibacterial activity, and also including the kepel juice’s role in the healing

process of open wound, there’s a possibility that the 70% kepel leaves’ ethanol

extract could have the ability to boost the healing process of burn wound. This

research aim is to proof the efficacy of kepel leaves in healing burn wounds.

This research is carried out on rats which have been induced with third-

degree burn and will be observed by measuring four parameters, the number of

macrophages and fibroblast density. The measurement will be done by using

Image Raster 3.0 application. This parameters measurement will support the data

that will prove the efficacy of kepel leaves on burn wound medication. It is hoped

that the result of this study could increase the knowledge on the efficacy of native

Indonesian plants and useful in the burn wound healing process.

MATERIALS AND METHODS

Materials

Materials used in this research are kepel leaves obtained from The Research

Center for Spices and Medicinal Plants (BALITTRO), Vaseline, Silver

Sulfadiazine (Burnazin®), Ketamine injection. All chemical used in this study

were analytical grade.

Preparation of Extract

The kepel leaves could be determine in “Herbarium Bogoriense”, Botanical

field, Biology Research Center, Indonesian Institute of Sciences (LIPI), Cibinong

with register No. 1592/IPH.1.01/If.07/VI/2017 . Kepel leaves ( 7 kg) was washed

with running water and dried under the sun. The sample was grinded and sieved

with a 40 mesh sieve. Then extracted (1.2 kg) with 8 L ethanol 70% by

maceration. The maceration process was repeated twice for residue at same

duration (48 hours). The macerat was evaporated in vacuum rotary evaporator and

continued with 40ºC waterbath until it attains the form of thick extract. This

extract labelled as KLEE ( Kepel Leaves’ Ethanol Extract)

44

Preparation of Test Animals

Rats that was used as test animal was acclimatized and given food and drink

daily. There were 30 Sprague Dawley male white rats (Rattus norvegicus)

weighed 150-200 g. The research procedure has been approved by the Health

Research Ethics Commission University of Muhammadiyah Prof.DR.Hamka

with ethical approval letter number : 02/17.10/017

Determination of Extract Characteristics

Organoleptic observations of KLEE include of shape, color, odor, and taste.

Determination of Loss on Drying is done by using gravimetric, where 2g of thick

extract is weighed in a calibrated and dried it at 105 °C in an oven for 30 minutes

until constant weight (Depkes, 2008). Preliminary phytochemical screening was

carried out for KLEE by testing several secondary metabolites. This extract were

being tested for its alkaloids content using Dragendorff, Mayer and Bouchardat

reagents, flavonoid test (Shinoda and ammonia test), tannin test (test with gelatin

and FeCl3), saponin test (foam test) and steroid and terpenoid test (Liebermann

Burchard test) (Hanani, 2014).

Preparation of KLEE ointment

KLEE ointment with a concentration of 3.25% ; 6.5% ; 13% (w/w) is made

by weighing 0.325; 0.65; 1.3 g of KLEE then add vaselin flavum until 10 g and

crushed until homogeneous.

Generating Third-Degree Burn and Treatment of Test Animals

The rats are anesthetized by using ketamine injection at a dose of 40.08

mg/kgBB intramuscular. A special metal plate with 1.5 cm x 1.5 cm in diameter is

heated until it reached 100ᵒC, which then would be paste for 30 seconds on the

back part of the rat that was shaved previously. After the wound was generated,

the rat is given analgetic medication orally. There are 6 test groups namely KLEE

with concentration of 3.25%, 6.5%, and 13%, Burnazin®

(positive control), and

vaselin flavum (negative control ) is then spread evenly on the wound surface

twice daily (morning and afternoon) for each treatment for 14 days (Nazrun,

2005). Dosing and treatment of test animals can be seen in table 1.

45

Table 1. Dosing and Treatment of Test Animals

Days to

Groups

I

II

III

IV

V

1 Shearing rats

2 Rats were burnt with a special metal plate at 100°C for 5 seconds

3-16 Rats were

given KLEE

ointment

with a

concentratio

n of 3.25%

Rats were

given

KLEE

ointment

with a

concentratio

n of 6.5%

Rats were

given

KLEE

ointment

with a

concentratio

n of 13%

Rats were

given

vaselin

flavum

(negative

control)

Rats were

given

Burnazin®

(positive

control)

3,7,14 Wound tissue was taken on day 3,7,14 after burns were induced for

histological observations

Histology Sample Preparations

Skin tissue samples are taken from the biopsy of the burn wound and the

subcutaneous fat tissue. The sample is taken on the third, seventh, and 14th

day

after giving the test sample. Before samples are taken, the testing animal is

anesthetized by using ketamine injection. The specimen is then fixated by using

Buffer Neutral Formalin 10% solution.

Histopathology Sample Preparations

The tissue is fixated by using Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% solution

and left at room temperature for 24 hours. The tissue is then cut to pieces and

placed in a specimen container made from plastic. Subsequently, it will go

through dehydration process done with a graded alcohol concentration, which is

70%, 80%, 90%, for 2 hours each. Later, the clearing process is done by using

xylol to eliminate alcohol traces. After that, the molding process is done by using

paraffin blocks and stored in the fridge. These paraffin blocks are then sliced

thinly around 6-8 µm by using microtom. Afterwards, these pieces are floated on

60°C warm water (waterbath) to stretch the tissue and avoid creasing. These

specimens are then lifted and placed on object glass to do the Hematoxyllin and

Eosin (HE) staining and later observed under the microscope (Mustaba, 2012).

Data Analysis

Obtained data in form of numbers of macrophages, numbers of fibroblast,

and collagen density is statistically analyzed by using the one-way ANOVA test

46

with 95% confidence (α = 0,05). Tukey test is then used to observe whether there

is significant difference.

RESULTS AND DISCUSSIONS

The burn wound model on rats as test animal is made by inducing third-

degree burn which damage the tissue until the dermis. The prepared samples used

are 70% kepel leaves’ ethanol extract at the concentration of 3.25%, 6.5%, 13%;

Burnazin® as the positive control group and vaseline flavum as the negative

control group. The reason Burnazin®

was chosen as the positive control group is

because it is the gold standard for burn wound topical treatment due to the Silver

Sulfadiazine (SSD) as its active agent. SSD inhibits bacterial DNA replication and

damages bacterial cell wall. The silver content in SSD also has antibacterial

functions that help cleanse the wound thus avoids compromising the tissue

regeneration (Atiyeh, 2007; Almeida et al., 2000). The sample preparation in the

form of ointment with vaseline flavum base has a hydrocarbon characeristics

which is not easily disolved in water, thus prolonged the contact between the

medical ingredients and skin (Sentat, 2015).

Burn wound is a form of tissue damage or loss caused by exposure to heat

sources, i.e. fire, hot water, chemical substances, electricity, and radiation

(Moenadjat, 2009). Generally, the healing process is divided into 3 phases. The

early phase or the inflammation phase is started immediately after the injury

happened where it eliminates dead tissues and avoid infection. The second phase

is the proliferation phase where the balance between the scar tissue formation and

tissue regeneration occur. The third phase is the maturation phase that aimed at

maximizing the structural strength and integrity of the wound (Gutneer, 2007).

The healing process of burn wound has similarities with other wound healing

process in general, yet had a different duration for each phase (Tiwari, 2012).

Macrophage cells calculation process is done by taking the image from a

light microscope which then observed and counted by using Image Raster 3.0

application. The result of the ANOVA table on the number of macrophages on the

third, seventh, and 14th

day showed significant difference on every group

(p<0.05). On the third day of observation, the number of macrophage cells on the

13% concentration group is higher than the 6.5%, 3.25%, and negative control

group, with the lattest has the lowest number ( Table 2). This is due to the

macrophages became the predominant cell at the third day after the wound

occured. Macrophage is an effective cell for the phagocytosis process where the

macrophage phagocytoses pathogens, foreign bodies, and other unnecessary cells.

Macrophages in the tissue originates from the monocyte cells in the blood that

migrated to the connective tissue. In cases that inflammation happened, the

number of monocytes that migrated to the connective tissue will increase, thus the

macrophages is activated (Franklin 2007; Dwintanandi et al., 2016).

47

On the seventh and 14th

day of observation, the number of macrophages in

the 13% concentration group is equivalent with the positive control group and the

6.5% concentration group, yet showed significant difference with the negative

control group and the 3.25% concentration group (Table 2). This result shows that

inflammation process in the negative control group is still in progress. The high

number of macrophages in the negative control group indicates a prolonged

inflammation due to the growth of more microorganism in the burn wound. The

absence of active ingredients in the negative control group might be the reason of

the presence of microbes and the number of tissue damage that needs to be

phagocytosed by the macrophage in the wound area (Sura et al. 2013). Thus, the

wound healing process in the negative control group will be prolonged and lead to

the delay of proliferation phase. In the 13% concentration group and also other

consentration group, the number of macrophages is lower which indicates the end

of inflammation process and mark the beginning of the proliferation process.

Table 2. The mean value of macrophage

Groups The third day The seventh day The 14th

day

Positive control 139.3±8.944

104.725±5.998

94.975±6.602

Negative control 109.875±7.221

119.95±7.083 112.3±4.231

KLEE oint 3,25% 116.421±5.549b

114.900±5.780b

106.37±3.398b

KLEE oint 6,5% 124.175±7.322b

109,925±4.332b

99.875±4.678b

KLEE oint 13% 134.3±6.710a,b

107.025±4.0343a,b

97.025±3.927a,b

Note : a not significantly different from positive control (p>0,05)

b

significantly different from negative control (p<0,05)

During the proliferation phase, macrophage is also needed to produce

growth factors such as fibroplatic growth factor, transforming growth factor-beta

(TGF-β), and DGF in which they stimulate the migration of fibroblast towards the

wound area. Macrophages also activated fibroblasts and increase their migration

which play a role in tissue formation process and produce collagens (Mulia 2012;

Hesketh et al., 2017).

Administration of KLEE ointment could speed the inflammation phase on

burn wound. It is supposed to be related to the presence of secondary metabolite

compounds in the kepel leaves’ extract that helps the healing process such as

flavonoids, saponin, dan tannin which functions as antioxidant and antimicrobial

48

agent that affects the wound healing (Saroja, et al. 2012). Tannin and saponin also

have the ability as an antiseptic agent. Saponin could trigger the vascular

endothelial growth factor (VEGF) and increase the number of macrophages that

migrate towards the wound area thus increase the production of cytokine that

activates fibroblast in the wound tissue (Reddy,et al., 2011).

Another wound healing parameter which is fibroblast density could be seen

in Table 3. The third day observation showed the mean density of the fibroblast in

all of the concentration groups have significant difference with the negative

control group. Fig.1 showed that fibroblast density in all of the concentration

groups still have a small number due to the fibroblast is yet to have a role in the

inflammation process.

Figure 1. Histological picture on day 7 at 400x magnification under a light

microscope ( Olympus) arrows

indicate fibroblast : A) Negative Control Group; (B) KLEE oint 3.25%;

(C) KLEE oint 6.5%; (D) KLEE oint 13%,

E) Positive Control Group. KLEE : Kepel Leaves’ Ethanol Extract

A B C

D E

49

Fibroblast start to have a part in both proliferation and maturation phase (Prabakti,

2005). The seventh day of observation showed the mean density in the 13%

concentration group does not have significant difference with the positive control

and 6.5% concentration groups. Significant difference is only found between the

negative control and 3.25% concentration groups. The increase number of

fibroblast cell would trigger the increase number of collagen fibers which speed

the process of wound healing. The 14th

day observation showed the mean density

of fibroblast in the 13% concentration group does not show significant difference

with the positive control and 6.5% concentration groups. This shows that the

proliferation of fibroblast determines the end result of wound healing. Fibroblast

produces extracellular matrix which then will be replaced by collagen. Fibroblast

will disappear immediately as the collagen matrix fill the wound cavity and the

formation of neovascular will decrease through the apoptosis process (Gurtner,

2007).

Table 3. The mean value of Fibroblast Density

Groups

The third day

The seventh day

The 14th

day

Positive control

Negative control

58,65 ± 4,577a

29,5 ± 2,8191

73,15 ± 4,577a

49,55 ± 3,1030

34,87 ± 3,4674a

50,9 ± 4,9139

KLEE oint 3.25% 45,95 ± 3,2602a 63,2 ± 4,1688

a 43 ± 3,9603

a

KLEE oint 6.5% 49,75 ± 4,2534a 67,35 ± 4,3922

a 38,95 ± 3,5388

a

KLEE oint 13% 51,2 ± 3,6685a 70,18 ± 4,1372

ab 37,02 ± 3,0842

ab

Note

: a significantly different from negative control (p<0,05)

b not significantly different from positive control (p>0,05)

CONCLUSIONS

Based on this research, it could be concluded that the 70% kepel leaves’

ethanol extract with 13% concentration shows burn wound healing acceleration

activity with decreased number of macrophages and the increase of fibroblast

density.

50

REFERENCES

1. Almeida A, Noronha C (2000) Local Burn Treatment-Topical

Antimicrobial Agents. Annuals of Burns and Fire Disasters, 13 (4): 216-

219.

2. Atiyeh B, Michael C, Shady WH (2007) Effect of Silver on Burn Wound

Infection Control and Healing: Review of Literatur Burns. 33 :139-148

3. Corwin EJ (2009) Pathophysiology pocket book. 3rd

edition EGC.

Jakarta:127

4. Departemen Kesehatan Republik Indonesia (Health Department of RI).

2008. Farmakope Herbal Indonesia Edisi I. Jakarta : 175.

5. Dwintanandi C, Yanuar IN, Suka DR (2016) Effect of Mangosteen Skin

Extract (Garcinia mangostana Linn.) On macrophages . Journal of

Dentistry. Vol:2:151-157.

6. Franklin H. (2007) Cutaneous Wound Healing. The New England Journal

Of Medicine. Vol. 341(10):738-746

7. Gurtner GC ( 2007) Wound healing, normal and abnormal. In: Thorne

CH, Beasly RW, Aston SJ, Bartlett SP, Gurtner GC, Spear SL. 2007.

Grabb and Smith’s plastic surgery. Edisi 6. Philadelphia: Lippincott

Williams and Wilkins. USA :15-22

8. Hanani E (2014) Analisis fitokimia. EGC medical book publisher.

Jakarta:10-13

9. Kalangi, S. J. R. (2013). Skin histophysiology. Biomedical Journal (JBM),

5(3):12–20.

10. Moenadjat Y (2009) Luka Bakar Masalah dan Tatalaksana. Edisi 4.

Faculty of Medicine, University of Indonesia . Jakarta:5-9

11. Mustaba R, Idabagus OW, I Ketutbrata (2012) Gastric Histopathology

Study in White Rats Given Honey as a Prevention of Aspirin-Induced

Gastric Ulcers. Indonesia Medicus Veterinus 1(4). Bali: 471-482.

12. Nazrun A, Mohd Syukri, Ahamad A (2005) The Effect of Carica papaya

Linn. Latex on the Healing of Burn Wounds in Rats. Journal Sains

Kesihatan Malaysia 3 (2): 39-47

13. Pribadi P, Elmawati L, Rohmayanti (2014) Utilization of Kepel Fruit

(Stelechocarpus burahol (Blume) Hook.f & Thomson) as a wound

antiseptic. Pharmaciana. Vol 4(2): 177-183

14. Reddy BK, Gowda S, dan Arora AK (2011) Study of Wound Healing

Activity of Aqueous and Alcoholic Bark Extracts of Acacia catechu on

Rats. RGUHS Jour-nal of Pharmaceutical Sciences. Vol:1(3): 220-225.

15. Saroja M, Santhi R dan Annapoorani S (2012 )Wound Healing Activity of

Flavonoid Fraction of Cynodon dactylon in Swiss Albino Mice.

International Research Journal of Pharmacy. Vol:3(2): 230-231.

16. Sentat T, Rizki (2015) Ethanol Extract Activity Test of Avocado Leaves

(Persea americana Mill.) Against Healing Burns on the Back of Male

White Mice . Manuntung Scientific Journal:100-106.

17. Sura GM, Carabelly AN, Apriasari ML (2013) Application of 100%

Haruan Extract (Channa striata) on back wounds of mice (Mus musculus)

51

Against the Number of Neutrophils and Macrophages . PDGI Journal.

Vol:62 (2) :41-44

18. Tiwari VK. (2012) Burn Wound: How It Differs From Other Wounds?.

Indian J Plast Surg. Vol. 45:364-373.

19. World Healty Organization. Global Burns review (2016): WHO.

http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/91355/1/9789241564656_eng.pdf.

accessed date 8 Mei 2017.

52