Tinjauan Pustaka

Metabolisme oksidatif dan potensi genotoksik dari fitoestrogen isoflavon utamaSabine E. Kulling, Leane Lehmann, Manfred Metzler*Institut Kimia dan Toksikologi Pangan, Universitas Karlsruhe, P.O. Box 6980, D-76128 Karlsruhe, Jerman

AbstrakIsoflavon dari kacang kedelai (daidzein, genistein, dan glisitein) dimetabolisme secara ekstensif di mikrosom hati tikus menjadi sejenis metabolit katekol. metabolit hidroksilasi dari daidzein dan genistein juga telah didemonstrasikan dalam inkubasi dengan mikrosom hati manusia dan urin manusia setelah mengonsumsi makanan-makanan berbahan kacang kedelai. walaupun metabolisme mikrosomal dari formononetin dan biochanin A didominasi oleh demetilasi ke daidzein dan genistein, secara berturut-turut, katekol dari induk isoflavon dan produk demetilasi juga dibentuk. Demikian, metabolisme oksidatif tampak umum di antara isoflavon dan dapat melibatkan aktivitas biologisnya. (genistein bukan daidzein) menghambat aktivitas klastogenik dalam sel mamalia yang dikultur, peran metabolisme oksidatif untuk genotoksisitas dari isoflavon merupakan suatu hal yang menarik.

2002 Elsevier Science B.V. Hak Cipta dilindungi Undang-undang.Kata kunci: Tinjauan Pustaka: fitoestrogen isoflavon

Daftar Isi1. Pendahuluan2. Metodologi3. Metabolisme mikrosomal dari berbagai jenis isoflavon3.1. Daidzein3.2. Genistein3.3. Formononetin, biochanin A, dan glisitein3.4. Equol4. Metabolit oksidatif isoflavon dalam urin manusia5. Potensi genotoksik dari isoflavon6. Kesimpulan7. Nomenklatur8. Ucapan terimakasih9. Daftar Pustaka

Korespondensi: Telepon +49-721-608-2132; fax: +49-721-608-7255Email: manfred.metzler@chemie.uni-karlsruhe.de (M.Metzler)1Alamat: Institut Fisiologi Nutrisi, Pusat Penelitian Federal untuk Nutrisi, Haid-und-Neu-Str. 9. D-76131, Karlsruhe, Jerman.

1. Pendahuluan

Fitoestrogen merupakan bagian dari keluarga isoflavon yang terdapat dalam beberapa tanaman yang digunakan sebagai asupan nutrisi manusia dan hewan. zat ini berlimpah pada kacang kedelai, tetapi juga terdapat dalam konsentrasi yang cukup besar dalam beberapa jenis kacang, taoge, dan legum. makanan hewan seperti semanggi atau alfalfa sangat kaya dengan isoflavon. Gambar 1 menggambarkan struktur sebagian besar isoflavon. pola-pola zat ini berbeda-beda di antara tanaman-tanaman tersebut, contohnya kacang kedelai mengandung lebih banyak daidzein (DAI) dan genistein (GEN) bersamaan dengan sejumlah kecil glisitein (GLY), sedangkan semanggi merah kaya akan formononetin (FOR) dan biochanin A (BCA).Pada tanaman, isoflavon paling banyak berbentuk 7--D-glikosida dari glukosa dan 6-malonilglukosa. Saat dicerna, aglikon dilepaskan secara efektif dari bentuk glikosidanya dan digunakan sebagian untuk mereduksi metabolisme oleh bakteri usus2,4. Sebagai contoh, metabolit bakteri tipikal dari DAI adalah dihidro-DAI, O-desmetilangolensin dan equol (Gambar 1). Metabolit bakteri dan isoflavon yang terlepas dari biotransformasi bakteri diabsorbsi di usus, dimana glukoronidasi luas terjadi dalam enterosit sebelum dilepaskan ke dalam sirkulasi dan dibawa ke hati5. konjugasi dengan asam glukoronida dan sulfat diekskresikan ke urin dan empedu. Metabolit empedu diketahui melewati sirkulasi enterohepatik5.Baru-baru ini, telah dilaporkan bahwa isoflavon, dengan tambahan metabolisme reduktif dan konjugatif cenderung pada biotransformasi oksidatif pada tikus dan juga pada manusia6,7. Makalah-makalah terbaru mempresentasikan penelitian mengenai hal ini dan menampilkan data-data terbaru mengenai metabolisme oksidatif pada beberapa fitoestrogen isoflavon yang lain. Dalam pandangan dengan sudut pandang yang lebih luas terhadap senyawa-senyawa ini dan fakta bahwa secara struktur berhubungan dengan agen estrogenik, contohnya estrogen endogen 17-estradiol (E2) dan estrogen sintetik dietil-stilbestrol (DES) diasosiasikan dengan kanker pada manusia dan binatang8,9. Potensi fitoestrogen untuk menyebabkan kerusakan genetis merupakan suatu hal yang menarik. Oleh karena itu, catatan singkat mengenai hasil dari penelitian genotoksik dari isoflavon ini dipaparkan.

Gambar 1. Struktur kimia dari fitoestrogen isoflavon dan equol isoflavon

2. Metodologi

Metode yang digunakan untuk penghasilan, pemisahan, dan identifikasi dari metabolit isoflavon dideskripsikan secara detail dalam publikasi terdahulu6,7. Secara singkat, isoflavon diinkubasi dengan mikrosom, disiapkan dari hati tikus Wistar jantan yang diterapi-aroclor atau hati manusia. Metabolit mikrosomal diekstraksi dengan etilasetat dan dianalisis oleh HPLC dengan detektor pengatur dioda (DAD) dan dengan analyzer massa kutub-empat seri HP 1100 dilengkapi dengan kamar ionisasi electro-spray dalam tekanan atmosfir. GC-MS dibawa keluar oleh sistem GCQ Finnigan, dihubungkan dengan detektor massa pemerangkap-ion. Sampel urin dari sukarelawan yang mengonsumsi diet kedelai diekstraksi dari fase padat dan ekstraknya dihidrolisis dengan beta-glukoronidase / aril sulfatase. Isoflavon dekonjugasi dan metabolit oksidatifnya dimurnikan dengan ekstraksi fase padat dan dianalisis sebagaimana dijelaskan di atas untuk metabolit mikrosomal. Untuk tes genotoksisitas dalam laboratorium kami, sel mamalia dikultur dan berbagai jenis titik-akhir dipelajari sebagaimana dilaporkan secara detail akhir-akhir ini10,12.

3. Metabolisme mikrosomal dari berbagai jenis isoflavon

Metabolisme in vitro dari DAI, GEN, FOR, BCA, GLY dan equol diteliti dengan mikrosom yang disiapkan dari hati tikus dan manusia. Metabolit mikrosom digunakan untuk menguraikan struktur kimiawi senyawa-senyawa tersebut dan sebagai senyawa rujukan untuk identifikasi dalam metabolit in vivo pada urin manusia.

3.1. DaidzeinAnalisis dengan HPLC-MS dan GC-MS dari ekstrak yang diperoleh dari tikus Wistar jantan yang diterapi aroclor mengungkapkan formasi empat monohidroksilasi, empat dihidroksilasi, dan satu trihidroksilasi dari metabolit DAI. Struktur kimiawi dari semua metaboit dapat diidentifikasi secara samar (Gambar 2), seperti yang dilaporkan secara detail6. Produk mayornya yaitu 6-HO-DAI, 8-HO-DAI, 5,6-diHO-DAI; 3,6-diHO-DAI dan 3HO-DAI dan 2-HO-Dai, dimana 3,8-diHO-DAI; 6,8-diHO-DAI dan 3,5,6-triHO-DAI terdapat dalam jumlah yang lebih sedikit. Maka, dengan pengecualian 2-HO-DAI, metabolit monohidroksilasi yang diidentifikasi menunjukkan katekol yang timbul dari hidroksilasi aromatik dari Dai pada posisi 3, 6 dan 8. Hidroksilasi berikutnya, lagi-lagi pada posisi yang rawan (Gambar 2). Beberapa metabolit mono dan dihidroksilasi diinkubasi dengan katekol-O-metiltransferase (COMT)/ S-adenosil-L-metionin dan menaikkan metileter secara berurutan, sehingga hal ini mengonfirmasi struktur katekol dari metabolit DAI7. Produk monohidroksilasi aromatik 6-HO-DAI, 8-HO-DAI, dan 3-HO-Dai juga dibentuk dalam inkubasi DAI dengan mikrosom hepatik manusia, bersama dengan sedikit 3,6-diHO-DAI dan 3,8-diHO-DAI7.

Gambar 2. Jalur oksidatif dalam metabolisme DAI

3.2. Genistein

Inkubasi GEN dengan mikrosom hati tikus yang diinduksi aroclor meningkatkan meabolit menjadi empat monohidroksilasi dan dua dihidroksilasi, strukturnya digambarkan pada Gambar 3. Metabolit predominannya 6-HO-GEN, 8-HO-GEN, dan 3HO-GEN6. Seperti yang dijelaskan di atas pada DAI, semua produk hidroksilasi aromatik dari GEN menunjukkan katekol. Dengan mikrosom hepatik manusia, metabolit utama yang terbentuk adalah 3-HO-GEN, 8-HO-GEN dan 6-HO-Gen7.

Gambar 3. Jalur oksidatif dalam metabolisme GEN

3.3. Formononetin, biochanin A, dan glisitein

Gambar 4. Profil HPLC dari metabolit mikrosomal FOR (diagram atas) dan BCA (diagram bawah)FOR dan BCA masing-masing mengandung 4-metileter dari DAI dan GEN (gambar 1). Dengan tambahan dari reaksi hidroksilasi aromatik, demetilasi oksidatif pada C-4 merupakan jalur metabolik yang masuk akal. Ketika FOR diinkubasi dengan mikrosom hati tikus yang diinkubasi aroclor, diobservasi bahwa metabolit utamanya adalah DAI, 6-HO-DAI dan 8-HO-DAI, dimana 3-HO-FOR, 6-HO-FOR dan 8-HO-FOR dibentuk dalam jumlah kecil (Gambar 4). Sehingga demetilasi oksidatif dari FOR menjadi DAI tampak menyerupai reaksi hidroksilasi langsung dari FOR (gambar 5). Dengan cara yang hampir sama, pola metabolit mikrosomal dari BCA terdiri dari sebagian besar GEN, bersama dengan beberapa 3-HO-GEN, 6-HO-GEN dan 8-HO-GEN (gambar 4). Jumlah 3-HO-BCA, 6-HO-BCA dan 8-HO-BCA relatif kecil (gambar 4), mengindikasikan lagi bahwa dihidrosilasi langsung dari BCA kurang diungkapkan dibanding demetilasi (gambar 5).

Gambar 5. Jalur oksidatif dalam metabolisme FOR dan BCA

Penelitian persiapan pada metabolisme mikrosomal dari GLY, yang merupakan 6-metoksi-DAI, mengesankan jalan metabolk yang berbeda. Dua metabolit utama yang terbentuk dari GLY adalah produk dari hidroksilasi aromatik, salah satunya diidentifikasi sebagai 8-HO-GLY,yang merupakan produk demetilasi oksidatif dari GLY, salah satunya 6-HO-DAI, hanya terdapat dalam jumlah kecil (Kulling et al, data tidak dipublikasikan). Maka dari itu, hidroksilasi aromatik langsung tampaknya lebih disukai daripad demetilasi dalam metabolisme oksidatif dari GLY. Hasil ini konsisten dengan observasi sebelumnya oleh Setchell et al13 yang menyatakan asupan suplemen makanan yang mengandung FOR dan BCA meningkatkan konsentrasi plasma dari DAI dan GEN, sedangkan pencernaan dari glisitin (GLY-7-D-Glukosida) meningkatkan kadar plasma dari GLY.

3.4. Equol

Ketika equol, salah satu metabolit bakterial dari DAI, diinkubasi dengan mikrosom hati tikus yang diinduksi aroclor, 7 produk monohidroksilasi dan 4 produk dihidrosilasi dideteksi oleh analisis HPLC-DAD dan HPLC-MS (Kulling et al, data tidak dipublikasikan). Metabolit utamanya adalah 3-HO-equol, dimana 6-HO-equol, 8-HO-equol, 2-HO-equol, 3-HO-equol dan 4-HO-equol dibentuk dalam jumlah lebih kecil. Penguraian struktur didasarkan terutama dari fragmentasi spektrometrik massa dari berbagai jenis metabolit pada HPLC-MS dan GC-S, dan pada senyawa rujukan yang digenerasi oleh reaksi equol dengan tirosinase/NADH, yang dikatalisasi oleh orto-hidroksiasi dari fenol ke katekol. Dua puncak HPLC diobservasi untuk 4 4-HO-equol, kemungkinan disebabkan oleh formasi diastereomer. Stereokimia dari produk hidroksilasi alifatik equol masih tidak diketahui. Metabolit hidroksilasi dari equol, sebagian besar 3-HO-equol dan 6-HO-equol bersamaan dengan sejumlah kecil 8-HO-equol dan 4-HO-equol juga diidentifikasi dalam inkubasi equol dengan mikrosom hepatik manusia (Kulling et al, data tidak dipublikasikan).

4. Metabolit isoflavon oksidatif pada urin manusiaUntuk meninvestigasi formasi metabolit oksidatif dari isoflavon kedelai DAI dan GEN in vivo, urin dari 3 sukarelawan wanita dan 3 sukarelawan pria dianalisis sebelum dan sesudah memakan makanan olahan kedelai. Rincian dari penelitian ini sudah dipublikasikan7. Asupan dari produk kedelai meningkatkan penanda konsentrasi urin dari GEN dan DAI, sedanagkan pada urin kontrol kadarnya sangat sedikit atau tidak ada. Tambahan pada isoflavon kedelai ini dan beberapa metabolit bakterialnya yang diketahui, seperti dhidro-Dai, dihidro-GEN dan equo, beberapa metabolit hidroksilasi dari DAI dan GEN secara jelas diidentifikasi pada ekstrak urin setelah hidrolisis konjugasi7. 3-HO-DAI, 6-HO-DAI, 8-HO-DAI, 3-HO-GEN dan 8-HO-GEN telah dapat diobservasi pada profil HPLC (Gambar 6), dimana 6-HO-GEN, 3,6-diHO-DAI, 3,8-diHO-DAI, 3,6-diHO-GEN dan 3,8-diHO-Gen hanya dideteksi oleh analisis GC-MS. Identifikasi semua metabolit ini berdasarkan kromatografi pada HPLC dan GC dengan metabolit mikrosomal berurutan, sebagaimana perbandingan pada spektrum massa dan UV metabolit ini.

Gambar 6. Profil karakteristik HPLC dari ekstrak urin manusia setelah ingesti produk kedelai. Puncak yang diberi bayangan adalah produk hidroksilasi DAI dan GEN

Tambahan mengenai produk hidroksilasi dari DAI dan GEN ini, yang mana merupakan katekol yang telah didiskusikan sebelumnya, ekstrak urin ditelaah untuk mencari keberadaan metabolit metileter yang cocok, yang timbul dari metilasi dugaan katekol oleh COMT. Hanya metileter dari 3-HO-DAI dan 3,6-diHO-DAI yang dapat diobservasi oleh MS di dalam mode deteksi ion multipel pada konsentrasi yang jauh lebih sedikit dibandingkan denagn katekol induknya.Analisis lebih lanjut dari urin dengan teknik spektrometer massa menyingkap 4 metabolit equol monohidroksilasi, yaitu 3-HO-equol, 6-HO-equol, 8-HO-equol dan 4-HO-equol (cis dan trans). Dua dari metabolit-metabolit tersebut, yakni 3-HO-equol dan 4-HO-equol telah dilaporkan sebelumnya14,16. Bukti awal dari metabolit mono dan dihidroksilasi O-desmetilangolensin juga diperoleh dalam penelitian kami (Kulling et al, data tidak dipublikasikan).

5. Potensi Genotoksik dari Isoflavon

Karena senyawa dihidroksi secara struktur berhubungan dengan isoflavon, seperti estrogen sintetik DES dan estrogen endogen E2, menunjukkan potensi untuk menyebabkan kerusakan genetik17, laboratorium kami, sebagaimana laboratorium lain telah menyelenggarakan penelitian tentang potensi genotoksik dari fitoestrogen. Tabel 1 meringkas data tentang isoflavon dan koumestrol fitoestrogen koumestan (COM) dari laboratorium kami, menggunakan sel V79 hamster Cina dan titik-akhir dari kerusakan genetik mengikuti respons positif pada DES atau E2. Sebagian besar dari data ini dipublikasikan10,12. Temuan perbedaan diobservasi antara berbagai jenis fitoestrogen. Dimana DAI bersifat inaktif pada semua titik-akhir, efek positif diobservasi pada GEN, FOR, BCA dan COM. Keempat senyawa ini menginduksi mikronuklei pada sel V79; walaupn demikian, karakterisasi lebih jauh dengan antibodi antikinetokor CREST menunjukkan bahwa GEN- dan mikronulei yang diinduksi-COM mengandung fragment kromosom asentrik10, dimana mikronuklei yang diinduksi FOR dan BCA mengandung semua kromosom (Kulling, data tidak dipublikasikan). Hal ini mengindikasikan potensi klastogenik untuk GEN dan COM, namun aktivitas aneuploidogenik untuk FOR dan BCA pada sel V79. Efek mikrotubulus dan henti mitotik diobservasi pada FOR dan BCA, dan induksi dari mutasi pada lokus HPRT10 dan penyimpangan kromosom secara struktural oleh GEN dan COM12 tadi konsisten dengan kategorisasi ini.

Tabel 1Ringkasan efek genotoksik dari berbagai jenis fitoestrogen isoflavon dan estrogen endogen E2 dimasukkan sebagai perbandinganTitik-akhirDAIGENFORBCACOME2

Mikronuklei dalam sel V79

Positif-CREST--+++++-+++

Negatif-CREST-+++--++-

Efek mikrotubulus dalam sel V79

Gangguan CMTC--++-+

Spindel mitotik abnormal--+++++-++

Henti mitotik pada sel V79--+++++-++

Mutasi HPRT pada sel V79-(+)--++Tidak dapat ditentukan

Penyimpangan kromosom pada limfosit manusia yang dikultur-+++Tidak dapat ditentukanTidak dapat ditentukan+++Tidak dapat ditentukan

Walaupun penelitian mengenai toksisitas genetik oleh fitoestrogen jarang dilakukan, beberapa laboratorium juga melaporkan efek genotoksik dari GEN pada sel yang dikultur. Sebagai contoh, Morris et al18 mengobservasi induksi mikronuklei, mutasi HPRT dan apoptosis dari galur sel limfoblastoid manusia yang diterapi dengan GEN, dan Pool-Zobel et al19 melaporkan untaian DNA berubah pada sel HT29 yang diinduksi GEN tetapi tidak terjadi pada DAI. Penyimpangan struktur kromosom diobservasi oleh Abe20 dalam limfosit manusia yang diekspos dengan GEN.

6. Kesimpulan

Penelitian terbaru di laboratorium kami, diringkas dalam kesimpulan ini, telah menunjukkan dengan jelas bahwa fitoestrogen isoflavon dalam metabolisme oksidatif in vitro dan in vivo, meningkatkan jenis metabolit hidroksi, semuanya berupa katekol atau pirogalol. Hal ini mejadi menarik sekarang untuk diinvestigasi apakah isozim sitokrom P450 juga terlibat dalam pembentukan metabolit-metabolit ini dan untuk mempelajari sifat biologisnya. Sementara formasi katekol sebagai jalur utama dalam metabolisme estrogen endogen E221, isoflavon dapat terhubung dengan metabolisme E2 jika mereka berbagi jalur P450. Pendahuluan dari satu atau dua grup hidroksi dapat meningkatkan atau menurunkan aktivitas estrogenik dan antioksidatif dari isoflavon induknya, sehingga akan mengatur dua bagian yang berhubungan dengan efek protektif dari fitoestrogen ini melawan penyakit-penyakit tertentu22. Metabolit oksidatif dapat juga berdiferensiasi dari isoflavon induknya dalam hubungan dengan potensi genotoksiknya. Penelitian mengenai hal ini juga menunjukkan GEN memiliki potensi klastogenik, sedangkan DAI yang memiliki satu grup hidroksi kurang daripada GEN, tidak memiliki aktivitas klastogenik. Yang menjadi perhatian adalah observasi bahwa metabolit katekol dari isoflavon tampaknya menjadi substrat yang kurang baik untuk COMT7. Ketika metilasi katekol secara umum dianggap sebagai reaksi detoksifikasi17, 21, aktivitas rendah dari COMT dapat meningkatkan kadar katekol di jaringan. Bila tidak diinaktivasi secara efisien oleh proses konjugasi, katekol ini dapat mengalami siklus redoks membentuk orto-quinon dan spesies oksigen reaktif, keduanya dapat merusak makromolekul selular dan dapat menyebabkan sitotoksisitas dan genotoksititas. Semua aspek dari metabolisme oksidatif isoflavon ini patut menjalani investigasi lebih lanjut.

7. NomenklaturBCAbiochanin ACOMcoumestrolCOMTkatekol-O-metiltransferaseDADdetektor pengatur diodaDAIdaidzeinDESdietilstilbestrolE217-estradiolFORformononetinGCkromatografi gasGENgenisteinGLYglisiteinHOhidroksiHPLCkromatografi cair berdaya-tinggiHPRThipoxantin fosforibosiltransferaseMSspektrometri massaNADHnikotinamida adenin dinukleotida reduksiUVultraviolet

8. Ucapan terimakasihPenelitian yang dilakukan di laboratorium kami didukung oleh Deutsche Forschungssgemeinschaft (Grants Ku 1079 / 5-1 dan Me 574 / 9-2). Kami ucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya untuk karya yang terampil dan berdedikasi dari Cornelia Hodapp, Doris Honig, Renate Loske dan Sybille Mayer.

9. Daftar pustaka

1. W. E. Ward, L. U . Thompson, dalam: M. Metzler (Ed.), The Handbook of Enviromental Chemistry, Vol. 3, Part L: Endocrine Disruptors, Part I. Springer: Berlin. 2001. Bab 6, hal. 101.

2. M. Axelson, D. N. Kirk, R. D. Farrant, G. Cooley, A. M. Lawson, K. D. R. Setchell. Biochem J. 1982. 201: 353.

3. C. Banwart, H. Adlercreutz, T. Fotsis, K.Wahala, T. Hase, G. Brunow, Finn. Chem Lett. 1984. 120: 4-5.

4. N.G. Coldham, M. J. Sauer. Toxicol Appl Pharmacol. 2000. 164: 206.

5. K.D.R Setchell. Am J Clin Nutr. 1998. 68: 1333S.

6. S.E. Kulling, D. M. Honig, T. J. Simat, M. Metzler. J Agric Food Chem. 2000. 48: 4963.

7. S. E. Kulling, D. M. Honig, T. J. Simat, M. Metzler. J Agric Food Chem. 2001. 49: 3024.

8. B. E. Henderson, R. Ross, L. Bernstein. Cancer Res. 1998. 48 : 246.

9. R. R. Newbold, J. A. McLachlan, dalam: J. Huff, J. Boyd, J. C. Barret (Eds.) Cellular and Molecular Mechanisms of Hormonal Carcinogenesis: Enviromental Influences. New York: Wiley-Liss. 1996. 131.

10. S. E. Kulling, M. Metzler. Fod Chem Toxicol. 1997. 35: 605.

11. S. E. Kulling, E. Jacobs, E. Pfeiffer, M. Metzler. Mutat Res. 1998. 416: 115.

12. S. E. Kulling, B. Rosenberg, E. Jacobs, M. Metzler. Arch Toxicol. 1999. 73: 50.

13. K. D. R. Setchell, N. M. Brown, P. Desai. L. Zimmer-Nechemias, B. E. Wolfe, W. T. Brashear, A.s. Kirschner, A. Cassidy, J. E. Heubi. J Nutr. 2000. 131: 1362S.

14. C. Bannwart, H. Adlercreutz, K. Wahala, T. Kotiaho, A. Hesso, G. Brunow, T. Hase. Biomed Environ Mass Spectrom. 1988. 17: 1

15. G. E. Joannou, G. E. Kelly, A. Y. Reeder, M. Waring, C. Nelson. J Steroid Biochem Mol Biol. 1995. 54: 167.

16. S. Heinonen. K. Wahala. H. Adlercreutz. Anal Biochem. 1999. 274: 211.

17. M. Metzler, S. E. Kulling, E. Pfeiffer, E. Jacobs. Lebensm-Unters-Forsch. 1998. A 206: 367.

18. S. H. Morris, J. J. Chen, O. E. Domon, L. J. McGarrity, M. E. Bishop, M. G. Manjanatha, D. A. Casciano. Mutat Res. 1998. 405: 41.

19. B. L. Pool-Zobel, H. Adlercreutz, M. Giei, U. M. Liebigel, J. Sittlington, I. Rowland, K. Wahala, K. W. Rechkemme. Carcinogenesis. 2000. 21: 1247.

20. T. Abe. Leukemia. 1999. 13: 317.

21. J. G. Liehr. Endocr Rev. 2000. 21: 40.

22. J. J. B. Anderson, M. Anthony, M. messina, S. C. Garner. Nutr Res Rev. 1999: 12: 75. 15