Muhammad Riyadi Prakoso240210120035V.PEMBAHASAN

HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan fasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat kedalam kolom dengan bantuan pompa/tekanan.

Gambar 1. Komponen Kromatografi(Vogels, 1989)

Komponen-komponen HPLC adalah:1. Gradien Controller/Solvent Reservoir : Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akandialirkan ke dalam kolom dengan bantuan pompa. Syarat fasa gerak yang digunakan harus dimilipore (pori-pori+5m) dan didegass.2. Pompa: Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom.3. Sample Introductions/Injector: Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampeldengan bantuan syringe.4. Kolom: Merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlah terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan.5. Detektor: Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom.6. Data Output: Fungsinya untuk menampilkan hasil yang diperoleh.Pompa merupakan alat yang termasuk ke dalam komponen HPLC, pompa yang digunakan dalam HPLC berbeda-beda. Jenis- jenis pompa yang biasa digunakan antara lain: Pompa bolakbalik (reciprocating pump) Paling banyak digunakan Jumlah volume pelarut tidak terbatas Dapat digunakan untuk elusi gradient Menghasilkan aliran berpulsa Pompa jenis penyuntik (syringe pump) Kapasitas ruang pelarut 250 500 mL Untuk kolomkolom kecil (micro bore columns) Menghasilkan aliran bebas pulsaDetector merupakan salah satu komponen yang terdapat dalam HPLC, detector berperan sebagai komponen untuk menangkap sampel yang diuji sehingga detector memiliki beberapa jenis diantaranya: Spektrofotometer UV Visible Indeks bias Spektrofluorimeter (zat berfluoresensi) Konduktivitas listrik (zat ionik) Spektrometer infra merah Spektrometer massa( LC MS ) Spektrometer NMR ( LC NMR )Pemisahan denganHPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kaliHPLC dikelompokkan menjadiHPLC fase normal danHPLC fase terbalik.Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:1. Kromatografi AdsorbsiPrinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.2. Kromatografi fase terikatKebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3. Kromatografi penukar ionKCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.4. Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi UkuranKromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.6. Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.Dasar pemisahan HPLC adalah perbedaan kecepatan migrasi dari komponen-komponen sampel yang terjadi karena adanya perbedaan kesetimbangan distribusi dalam fasa diam dan fasa gerak untuk senyawa-senyawa yang berbeda. HPLC sangat ideal untuk memisahkan molekul-molekul dari sampel organik dalam sampel biologis, bahan-bahan alam yang mudah mengalami perubahan, senyawa yang kurang stabil, dan senyawa dengan berat molekul tinggi (Hendayana, 2006).Menurut Underwood (2002), persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak sebagai berikut: Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detectorPerbandingan HPLC dengan kromatografi cair klasik dapat dilihat pada Tabel 1.Tabel 1. Perbandingan Kromatografi Cair Klasik dan HPLC

(Anshori, 2007)

HPLC merupakan metode separasi bahan pangan yang tujuannya bukan untuk produksi melainkan untuk analisis, oleh karen itu HPLC memiliki beberapa keunggulan, diantaranya: Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan dataVolume sampel kecil Daya pisah tinggi Merupakan metode analitis yang cepat, peka, akurat, tepat, reproducible, dan preparative Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat volatile dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal. Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

VI.KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 KesimpulanKesimpulan dari praktikum ini adalah: HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan fasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat kedalam kolom dengan bantuan pompa/tekanan. Komponen HPLC antara lain gradien controller / solvent reservoir, pompa, sample introductions / injector, kolom, detector, dan data output. Jenis-jenis HPLC adalah kromatografi adsorbsi, fase terikat, penukar ion, pasangan ion, eksklusi ukuran, dan afinitas.

6.2 SaranPraktikum berikutnya lebih dipersiapkan agar hasil yang didapatkan lebih baik lagi.

DAFTAR PUSTAKA

Anshori. J. A. 2007. Pelatihan HPLC. Universitas Padjadjaran, Jatinangor.

Hendayana, S. 2006.Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern. PT. Remaja Rosdakarya, Bandung.

Underwood. 2002.Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga, Jakarta.

Vogels, 1989. Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 5th edition. Longman Scientific & Technical. John Wiley & Sons, Inc. New York.