UJI AKTIVITAS ANTIJAMUR (+)-KATEKIN

DAN GAMBIR (Uncaria gambir, Roxb)

TERHADAP BEBERAPA JENIS JAMUR DAN

MEKANISMENYA

Muh. Yanis Musdja

PENDAHULUAN

LATAR BELAKANG

Menyirih merupakan salah satu kegiatan yang memanfaatkan tanaman tradisional.

Gambir merupakan salah satu bahan menyirih.

Dibutuhkan penelitian ilmiah (SAINTIFIKASI) tentang kegunaan

gambir

Penelitian antijamur

Tujuan Penelitian

Mengetahui aktifitas anti jamur (+)- katekin gambir dan ekstrak air gambir terhadap beberapa jamur.

Mengetahui mekanisme penghambatan anti jamur (+)-katekin gambir dan ekstrak air gambir terhadap beberapa jamur.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan memberikan gambaran dan informasi tentang aktivitas anti jamur dari (+)-katekin dan ekstrak air gambir, serta mekanisme panghambatannya terhadap beberapa jamur untuk menunjang saintifikasi gambir sebagai pengobatan tradisional.

Bongkahan Gambir

Kandungan kimia

Kandungan Kimia Daun Gambir dan Bongkahan Gambir Kandungan katekin total daun gambir 13,7 % (Anggraini et al, 2011), kandungan (+)-katekin daun gambir 9,4% (Das N.P, 1967). Kandungan utama bongkahan gambir adalah katekin (40-60%), zat penyamak (22-50%), serta sejumlah alkaloid seperti gambirtannin, turunan dihidro dan okso-gambirtannin. (Wiart, 2006; Amos, 2010). Taniguchi et al (2008) menemukan 9 jenis katekin pada gambir, yakni, (+)-catechin, (-)-epicatechin Gambiriin A1, Gambiriin A2, Gambiriin B1, Gambiriin B2, Catechin-(4α-8)-ent-epicatechin, Gambirflavan D1 dan Gambirflavan D2.

Khasiat empirik

• Kegunaan gambir secara tradisional adalah sebagai pelengkap makan sirih dan obat-obatan, gambir juga digunakan untuk obat luka bakar, di samping rebusan daun muda dan tunasnya digunakan sebagai obat diare serta obat kumur-kumur pada sakit kerongkongan.

• Secara moderen gambir banyak digunakan sebagai bahan baku industri farmasi dan makanan, di antaranya bahan baku obat penyakit hati dengan paten “catergen”, bahan baku permen yang melegakan kerongkongan bagi perokok di Jepang karena gambir mampu menetralisir nikotin.

• Sedangkan di Singapura gambir digunakan sebagai bahan baku obat sakit perut dan sakit gigi

(+)-Katekin

• (+)-Katekin adalah golongan senyawa pilofenol tipe flavonoid, yang banyak dijumpai pada teh, anggur, buah-buahan dan tumbuh-tumbuhan polon-polongan. Lima jenis katekin terbesar yaitu (+)- katekin, (-)- epikatekin, (-)-epigallokatekin (EGC), (-)- apikatekin gallat, dan (-)- epikatekin gallat (I. C. W., Arts et al, 1998).

Metode Pengujian Antimikroba

Metode Difusi Metode Dilusi

Bongkahan gambir

Dilarutkan dalamaquadest

Freeze drying

Fraksinasi etil asetat

Ekstrak etil asetat gambir

Kromatografi kolom

(+)-katekin

Ekstrak air gambir

Uji aktivitas antijamur

Pengujian aktivitas antijamur

Pengujian kebocoran membran sel

Analisa morfologi sel dgn SEM

Penentuan MIC

Penentuan zona hambat

Analisa kebocoran

protein dan asam nukleat dgn UV

Analisa kebocoran ion logam dgn AAS

Analisis kerusakan bakteri (Carson et al. 2002)

Diambil 10ml suspensi bakteri Sentrifuge dingin, kec 3500

rpm, 20menit

Filtrat dibuang, endapan

dicuci dan ditambahkan

buffer fosfat

Ditambahkan sampel

dengan dosis 1 KHM & 2

KHM

Diinkubasi shaker 24 jam,

150rpm

Suspensi disentrifuge, 15 mnt,

kec 3500 rpm

Disaring dengan kertas

saring steril pellet

supernatan

Analisis kerusakan sel

dengan SEM

analisis kebocoran

protein dan asam nukleat

dengan spektro UV-Vis

Analisis kebocoran

ion-ion logam K+ dan

Ca2+ dengan AAS

HASIL PENELITIAN

Isolasi dan Identifikasi (+)-Katekin

• Hasil dari KLT didapatkan beberapa fraksi yang digabungkan, yaitu : 1-8, 9-10, 11-28, 29-40, 41-75.

• Persentase kadar (+)-katekin yang didapat sebesar 22,54%

Pengujian zona hambat

Aktivitas Gambir dan Katekin terhadap 5 jamur pada konsentrasi 7000 µg

No. Jamur uji Diameter hambat

1 Candida albicans -

2 Saccharomyces cerevisiae -

3 Fusarium oxysporum -

4 Aspergillus niger -

5 Aspergillus flavus -

6 Kontrol pelarut -

Penentuan MIC

Penentuan nilai MIC

2,5 mg/ml – 25 mg/ml

No. Jamur uji Nilai MIC (mg/ml)

Gambir (+)-katekin

1 Candida albicans

- -

2 Saccharomyces cerevisiae

7,5 12,5

3 Fusarium oxysporum

- -

4 Aspergillus niger

- -

5 Aspergillus flavus

- -

6 Kontrol pelarut - -

Analisa kebocoran protein dan asam nukleat dgn spektrofotometri UV VIS

Data Spektrofotometri UV VIS Gambir S. cerevisiae

Panjang gelombang

Absorbansi

Kontrol 1 MIC 2 MIC

260 nm 0,693 0,747 0,873

280 nm 0,870 0,895 0,957

Analisa kebocoran protein dan asam nukleat dgn spektrofotometri UV VIS

Data Spektrofotometri UV VIS (+)-Katekin S. cerevisiae

Panjang gelombang

Absorbansi

kontrol 1 MIC 2 MIC

260 nm 0,693 1,575 1,816

280 nm 0,870 2,032 2,658

Analisa kebocoran ion-ion logam

Konsentrasi Data ion Ca2+ Data ion K+

(+)-katekin Gambir (+)-katekin Gambir

Kontrol Ca2+ 1,57 1,57 1,57 1,57

Kontrol K+ 85,7 85,7 85,7 85,7

1 MIC 5,96 2,73 88,5 92,9

2 MIC 6,36 4,99 89,4 119,5

Perubahan Morfologi Sel Saccharomyces cerevisiae

(a) (b) (c)

Perubahan Morfologi Sel Saccharomyces cerevisiae

(d) (e)

Perubahan Morfologi Sel Saccharomyces cerevisiae

• Morfologi sel S. cerevisiae kontrol (a), sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengan gambir 1 MIC (b), sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengan gambir 2 MIC (c), sel S.cerevisiae setelah perlakuan dengan katekin 1 MIC(d), dan sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengan katekin 2 MIC (e) (Pembesaran 15.000 kali). Tanda panah adalah terjadinya kerusakan sel.

KESIMPULAN

1. Persentase kadar (+)-katekin yang disiolasi dari gambir yang berasal dari Payakumbuh, Sumatera Barat sebesar 22,54%.

2. Nilai MIC gambir pada S. cerevisiae (LIPIMC) adalah 7,5 mg/ml dan untuk (+)-katekin sebesar 12,5 mg/ml. Sedangkan gambir dan (+)-katekin tidak menunjukan aktivitas antijamur terhadap C. albicans (LIPIMC), A. niger (LIPIMC 759), A. flavus (LIPIMC 745), F.oxysporum (LIPIMC 762) hingga konsentrasi uji 25 mg/ml.

KESIMPULAN

3. Mekanisme penghambatan gambir dan katekin terhadap Saccharomyces cerevisiae adalah dengan mengganggu permeabilitas membran sel.

4. Karena gambir dan (+)-katekin terhadap C. albicans, A. niger, A. flavus , F.oxysporum , dan S. cerevisiae tidak menunjukan aktivitas hingga konsentrasi 25 mg/ml, maka sampel uji diklasifikasikan sebagai antimikroba resistant menurut data pengujian University of Pennsylvania dalam University of Pennsylvania Medical Centre Guide Lines for Antimicrobial Therapy.

saran

1. Perlu diperhatikan kualitas gambir, agar didapatkan hasil uji yang lebih baik.

2. Perlu dilakukan penelitian terhadap (+)- katekin dan gambir untuk pemanfaatan lainnya.

Tinjauan Tentang Jamur ciri cendawan

pH optimum 3,8-5,6

Suhu optimum 22-300 C (saprofit);30-370 C (parasit)

Gas Aerobic obligat (kapang); Fakultatif

(khamir)

Cahaya Tidak ada

Kadar gula dalam medium laboratories 4-5%

Karbon Organic

Komponen structural dinding sel Kitin, selulose, atau glukan

Kerentanan terhadap antibiotic peka terhadap griseofulvin

• Pembuatan Medium

• Potato Dextrose Agar (PDA)

• Serbuk PDA sebanyak 39 gram dilarutkan dalam 1 L aquadest dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Larutan tersebut kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit.

• Potato Dextrose Broth (PDB)

• Serbuk PDB sebanyak 24 gram dilarutkan dalam 1 L aquadest dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit.

• Pembuatan larutan Uji

• Larutan uji dibuat dengan melarutkan gambir dengan DMSO 10% dan katekin dilarutkan dalam aseton (pengujian zona hambat) dan dalam methanol 20% (pengujian MIC). Untuk penentuan zona hambat antijamur, konsentrasi larutan uji yang dibuat sebesar 350 mg/ml untuk penentuan zona hambat jamur. Sedangkan untuk penentuan nilai MIC konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5 mg/ml; 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; dan 25 mg/ml.

• Pembuatan Stok Jamur

• Jamur uji diinokulasi dalam media agar PDA yang dibuat membentuk agar miring dengan cara menggoreskan masing-masing jamur menggunakan jarum ose steril ke dalam 5 ml media agar miring PDA dan diinkubasi pada suhu ruang selama waktu tumbuh optimum masing-masing jamur.

• Pembuatan Suspensi Jamur

• Biakan jamur yang telah diremajakan tersebut, diambil sebanyak 1 ose dan disuspensikan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml media cair PDB kemudian diinkubasi dengan shaker inkubator pada suhu ruang °C selama waktu tumbuh optimum masing-masing jamur. Jumlah jamur yang terdapat dalam suspensi dihitung dengan menggunakan metode cawan hitung. Jumlah jamur tersebut nantinya digunakan untuk pengujian aktivitas antimikroba.

• Penentuan Diameter Daerah Hambat • Penentuan aktivitas antijamur dari gambir dan (+)- katekin

terhadap Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Aspergillus flavus ,dan Fusarium oxysporum dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan kertas cakram. Media agar PDA yang sudah dicairkan sebanyak 20 ml dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan menjadi padat. Setelah memadat, suspensi dari setiap jamur sebanyak 0,1 ml disebar ke permukaan agar secara merata pada cawan yang berbeda. Kertas cakram steril diletakkan di atas medium agar dan ditetesi larutan uji sebanyak 20 µl. Untuk kontrol negatif digunakan pelarut DMSO 10% (pengujian gambir) dan aseton (pengujian katekin) sebanyak 20 µl pada setiap jamur uji. Masing-masing cawan petri diinkubasi pada suhu ruang selama waktu tumbuh optimum masing-masing jamur. Aktivitas antijamur diamati berdasarkan diameter daerah hambat yang terbentuk di sekeliling kertas cakram. Pengujian dilakukan secara duplo.

• Penentuan MIC (Minimum Inhibitor Concentration) • Penentuan MIC gambir dan (+)-katekin dilakukan dengan metode

makrodilusi dengan menggunakan petridish. Untuk pengujian MIC dengan metode makrodilusi masing-masing petridish diisikan medium PDA yang telah mengandung seri konsentrasi sampel uji 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5 mg/ml dan 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; dan 25 mg/ml, kemudian ditotol suspensi jamur dan di inkubasi selama waktu tumbuh optimum masing-masing jamur pada suhu ruang. Setelah proses inkubasi, diamati masing-masing seri konsentrasi larutan uji terdapat pertumbuhan atau tidak. Untuk kontrol digunakan empat macam kontrol yaitu

• kontrol media, hanya berisi media PDA • kontrol negatif, berisi media PDA dan pelarut • kontrol bakteri, berisi media PDA dan suspensi jamur • Kontrol pelarut, berisi media PDA, suspensi bakteri dan pelarut • Dari prosedur tersebut diperoleh nilai MIC

gambir dan katekin. Nilai MIC dinyatakan sebagai konsentrasi terkecil dari sampel uji yang dapat menghambat pertumbuhan jamur uji.

• Analisis Kebocoran Protein dan Asam Nukleat (Carson et al., 2002)

• Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dan pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 260 nm (untuk kandungan nitrogen dari asam nukleat) dan panjang gelombang 280 nm (untuk kandungan nitrogen dari protein). Suspensi jamur uji sebanyak 10 ml, yang telah ditumbuhkan selama 24 jam dalam media PDB, disentrifus dingin dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuang lalu endapan sel disuspensikan dengan 9,5 ml buffer fosfat pH 7,0. Selanjutnya ditambahkan sampel uji dengan dosis 1 MIC, 2 MIC dan kontrol, diinkubasi dalam shaker inkubator selama 48 jam. Setelah diinkubasi, suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit, lalu disaring untuk memisahkan supernatan dari sel. Cairan supernatan diambil dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV. Pellet jamur dikoleksi untuk difoto dengan SEM dengan perlakuan pada prosedur

•Analisis Kebocoran Ion-Ion Logam

• Untuk analisis kebocoran ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca2+ dan K+ yang keluar dari membran sel jamur akibat perlakuan dengan sampel. Kebocoran ion Ca2+ dan K+ dideteksi dengan menggunakan AAS. Sampel untuk analisis kebocoran ion logam berupa cairan supernatan yang berasal dari perlakuan pada prosedur

Penentuan diameter zona hambat bakteri

PDA steril yang telah memadat

Diinokulasikan 0,1 ml suspensi sel bakteri

Diratakan dengan batang spreader

Diletakan kertas cakram steril

Diteteskan 10 µl (+)-Katekin/ ekstrak Gambir

Diinkubasi suhu 370 C, 24 jam

Diukur zona bening disekitar cakram

Penentuan KHM Ekstrak Gambir & (+)-Katekin Microplate

+100 µl MHB, + 100 µl suspensi bakteri

150 µl MHB+100 µl suspensi bakteri

Diinkubasi 24 jam, 37o C

Larutan uji dan pembanding (+50 µl) Larutan kontrol

(+)-Katekin Ekstrak Gambir 100 µl MHB+100 µl suspensi bakteri +50 µl pelarut

200 µl MHB+50 µl pelarut

250 µl medium

Di plating, diinkubasi selama 24 jam37o C Diamati pertumbuhan bakteri

Analisis kerusakan Jamur (Carson et al. 2002)

Diambil 10ml suspensi bakteri Sentrifuge dingin, kec 3500

rpm, 20menit

Filtrat dibuang, endapan

dicuci dan ditambahkan

buffer fosfat

Ditambahkan sampel

dengan dosis 1 KHM & 2

KHM

Diinkubasi shaker 24 jam,

150rpm

Suspensi disentrifuge, 15 mnt,

kec 3500 rpm

Disaring dengan kertas

saring steril pellet

supernatan

Analisis kerusakan sel

dengan SEM

analisis kebocoran

protein dan asam nukleat

dengan spektro UV-Vis

Analisis kebocoran

ion-ion logam K+ dan

Ca2+ dengan AAS

Penentuan diameter zona hambat bakteri

MHA steril yang telah memadat

Diinokulasikan 0,1 ml suspensi sel bakteri

Diratakan dengan batang spreader

Diletakan kertas cakram steril

Diteteskan 10 µl (+)-Katekin/ ekstrak Gambir

Diinkubasi suhu 370 C, 24 jam

Diukur zona bening disekitar cakram