PENETAPAN KADAR PARASETAMOL, ASAM ASETILSALISILAT, DAN KAFFEIN SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

A. Tujuan

1. Mengenal teknik pemisahan secara ekstraksi cair-cair

2. Menetapkan kualitas pemisahan menggunakan HPLC

3. Menetapkan kadar parasetamol, asam asetisalisilat dan kafein dakam obat simptomatis untuk sakit kepala menggunakan HPLC

B. Prinsip

Obat penghilang rasa sakit dilarutkan dalam dietileter, ekstraksi kafein dengan HCl 3M dan ekstraksi asam asetilsalisilat dengan larutan NaHCO3 10%. Untuk mengetahui kinerja pemisahan secara ekstraksi cair-cair, injeksikan masing-masing fraksi : ekstrak HCl, ekstrak NaHCO3 , dan lapisan dietileter pada HPLC fasa terbalik setelah penggantian pelarut dengan fasa gerak yang digunakan.

C. Latar Belakang Teoritik

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu metoda pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat /bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang mampu menentukan rasemis dan isomer aktif (Effendi, 2004)

Fasa gerak Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah

satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu fasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price) (Effendi,2004).

Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan. Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2) (Effendi, 2004).

Keuntungan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair

klasik, antara lain:

1. Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

2. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

3. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.

4. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.

5. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

6. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus (Effendi, 2004).

Diagram Blok HPLC

(Effendi,2004)Keterangan :

Pompa (Pump) Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Injektor (injector) Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang

minimum dari material kolom. Ada dua model umum : a. Stopped Flow b. Solvent Flowing Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom.

Kolom (Column) Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung

pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC) .

Detektor (Detector) . Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom

(analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain: Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia

(Effendi, 2004)

Pemisahan Cair-CairKalau suatu senyawa (zat terlarut) ditambahkan kedalam campuran pelarut yang saling

tidak bercampur, zat terlarut tersebut medistribusikan dirinya sendiri diantara kedua pelarut berdasarkan afinitas masing-masing fase. Senyawa polar akan cenderung menyukai fase berair atau fase polar, sedangkan senyawa-senyawa yang non polar akan cenderung menyukai fase organic atau non polar. Senyawa yang ditambahkan mendistribusikan dirinya sendiri di antara kedua pelarut yang tidak bercampur berdasarkan hokum partisi, yang menyatakan bahwa “senyawa tertentu pada suhu tertentu, akan memisahkan dirinya sendiri diantara dua pelarut yang saling tidak bercampur pada perbandingan konsentrasi yang tetap”. Perbandingan yang tetap ini dikenal dengan sebutan koefisien partisi senyawa tersebut dan dinyatakan secara sistematis sebagai berikut :

P =

Koefisien partisi merupakan informasi penting karena dapat digunakan untuk memperkirakan proses absorpsi, distribusi dan eliminasi obat di dalam tubuh. Pengetahuan tentang nilai P dapat digunakan untuk memperkirakan onset kerja obat atau durasi kerja obat, atau untuk mengetahui apakah obat akan bekerja secara aktif (Donald, 2004).

Sifat Fisika Kimia masing-masing bahan

1. Paracetamol atau acetaminophen (C8H9NO2)

Paracetamol adalah senyawa turunan benzena tersubstitusi oleh 2 gugus fungsi yaitu hidroksil dan amida( acetamida/ ethenamida ), tersusun dari senyawa N-acetyl-para-aminophenol dan para-acetyl-amino-phenol.

• Densitas :1.263 g/cm³

• Titik Lebur :170 °C (338 °F)

• Massa Molar :151.17 g/mol

• Ksp :1.4 g/100 ml or 14 mg/mL (20 °C)

• Berwujud butiran kristal putih, rasa pahit

• Larut dalam air, alkohol, aseton, gliserol, propylene glycol, gliserol, kloroform, metil alkohol, dan hidroksida alkali, tak larut dalam benzena dan eter.

• Stabil pada pH > 6, dan tidak stabil pada pH asam atau pada kondisi alkaline

• Ikatan jenuh mudah putus, menjadi asam asetik dan p-aminophenol.

(MSDS Acetaminophen,2013).

2. Dietileter (C4H10O)

• Massa Molar : 74.12 g/mol

• Berwujud cairan tidak berwarna

• Titik beku : -116 °C (-177 °F)

• Titik didih : 34.6 °C (94.3 °F) pada tekanan 1,013 hPa (760 mmHg)

• Densitas : 0.71 g/cm3 pada suhu 20 °C (68 °F)

• Kelarutan dalam air : 65 g/l pada suhu 20 °C (68 °F)

Dietileter bersifat mudah terbakar dan bisa meledak, berbahaya jika tertelan, jika terkontak dengan mata maupun kulit dapat menyebabkan iritasi yang serius, berbahaya jika terhirup yang berakibat rasa pusing

(MSDS Diethyleter, 2013).

3. Natrium Sulfat Anhidrat (Na2SO4)

• Berwujud padat (kristal padat, serbuk Kristal, granul, dan serbuk) putih , tidak berbau dan pahit

• Massa Molar : 142.06 g/mol

• Titik didih : 1100°C (2012°F)

• Titik leleh : 888°C (1630.4°F)

• Na2SO4 larut pada air dingin, hydrogen iodida, dan gliserol. Tidak larut dalam alcohol

• Bersifat higroskopik

Na2SO4 berpotensi akut mengiritasi mata, kulit, saluran cerna dan saluran pernapasan jika terkontak langsung

(MSDS Sodium Sulfate Anhydrous, 2013).

D. Alat dan Bahan

Alat :

- HPLC

- Flakon

- Corong pisah

- Erlenmeyer 50 mL

- Labu takar 10 mL, 25 mL, 50 mL

- Corong

- Pengaduk

- Statip dan klem

- Indicator universal pH stick

- Baskom dan es

- Pipet tetes

- Pipet volume

- Gelas beker

- Gelas ukur

- Sendok

Bahan :

- Serbuk campuran obat penghilang rasa sakit

- Larutan dietileter

- HCl 0,1 M

- HCl 6M

- Larutan 10% natrium bikarbonat (NaHCO3)

- Larutan jenuh NaCl

- Natrium sulfat anhidrat (Na2SO4)

- NaOH 1M

- Ekstrak HCl mengandung asam konjugat kafein

- Ekstrak bikarbonat mengandung konjugat basa asam asetilsalisilat

E. Bagan Kerja

0,5 g serbuk campuran obat penghilang rasa

sakit

Dilarutkan pada Erlenmeyer dengan 20ml dietileter, lalu dimasukkan ke corong pisah

Ekstrak dietil eter

Ditambahkan 20mL HCl 0,1

Lapisan HCl Lapisan dietileter

Diekstraksi ulang, ditambahkan lagi 20mL HCl 0,1 M

Lapisan HCl Lapisan dietileter

digabungkan

Ditambahkan 20ml natrium bikarbonat 10%

Ekstrak bikarbonat

Ekstrak lapisan dietileter

Ditambahkan 15ml natrium bikarbonat 10%

Ekstrak bikarbonat

Lapisan dietileter

digabungkan

Lapisan dietileter

Dicuci dengan 20ml larutan jenuh NaCl

Lapisan air Lapisan eter

1. Dimasukkan ke Erlenmeyer, ditambahkan sedikit Na2SO4 anhidrat

2. Dikeringkan ±5menit, disaring

3. Hasil saringan diuapkanParacetamolDilarutkan pada solven yang sesuai

Diektraksi lebih lanjut (bagan selanjutnya)

Diekstraksi lebih lanjut (bagan selanjutnya)

Paracetamol hasil ekstraksi

Ekstrak HCl mengandung asam konjugat kafein

1. Dibasakan dengan NaOH 1M sampai pH 10 dalam tangas es

2. Dituang ke corong pisah, ditambahkan 20ml dietileter, digojog.

Lapisan air Lapisan eter

Ekstrak dengan dietileter 20ml, digojog

Lapisan air Lapisan eter

digabungkan

1. Ditambahkan sedikit Na2SO4

2. Dikeringkan ±5menit, disaring

Lapisan eter bersih

diuapkan

Kafein

Dilarutkan pada solven yang sesuai

Kafein hasil ekstraksi

Ekstrak bikarbonat mengandung konjugat basa asam asetilsalisilat

1. Didinginkan, dengan perlahan diasamkan dengan 1,5ml HCl 6M hingga pH 1

2. Dituang ke corong pisah, ditambahkan 20ml dietileter, di gojog

Lapisan air Lapisan eter

Ekstrak dengan dietileter 20ml, digojog

Lapisan air Lapisan eter

digabungkan

1. Ditambahkan sedikit Na2SO4

2. Dikeringkan ±5menit, disaring

Lapisan eter bersih

diuapkan

Asam asetilsalisilat

Dilarutkan pada solven yang sesuai

Asam asetilsalisilat hasil ekstraksi

Sampel Paracetamol, Kafein dan asam asetilsalisilat hasil

ekstraksi

Masing-masing dilarutkan seluruhnya dalam labu takar 10ml, diencerkan hingga batas

masing-masing sampel dimasukkan ke flakon, diukur dengan HPLC, tentukan AUC

Apakah sudah masuk rentang kurba baku?Belum

Ubah konsentrasi tiap-tiap larutan sampel dengan melakukan pengenceran Sudah

Kondisioning HPLC

Apakah sudah memenuhi System Stability Requirement ?Sudah Belum

Diskusikan dengan asisten/dosenDibuat campuran larutan stokDiinjeksikan dan dihitung resolusinyaPembuatan seri pengenceran larutan stokPembuatan kurva bakuValidasi metode pengukuran secara HPLC

DAFTAR PUSTAKA

Cairns, Donald, 2004, Intisari Kimia Farmasi, edisi 2, Buku Kedokteran EGC, Jakarta, p.p 27-28.

Putra, Effendy De Lux, 2004, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi, , diakses pada tanggal 26 Februari 2014.

Science Lab, 2013, MSDS Diethyleter, http://www.sciencelab.com/msds.php, diakses pada tanggal 25 Februari 2014.

Science Lab, 2013, MSDS Acetaminophen, http://www.sciencelab.com/msds.php, diakses pada tanggal 25 Februari 2014.

Science Lab, 2013, MSDS Sodium Sulfate Anhydrous, http://www.sciencelab.com/msds.php, diakses pada tanggal 25 Februari 2014.