ISOLASI PROTOPLAS

Salah satu cara untuk mengembangkan tanaman unggul adalah dengan merakit varietas baru yg berproduksi tinggi dan tahan terhadap hama penyakit adl dengan isolasi protoplas

Protoplas sel tumb yg telah dihilangkan dinding selnya atau “sel telanjang”

Jaringan organ yg digunakan utk isolasi protoplas misalnya tunas batang, buah, akar, bintil akar legum, atau dari kultur suspensi sel, daun muda atau kalus maupun biji

Isolasi protoplas dapat dilakukan dengan melalui:

1. perkecambahan in vitro kemudian di kalus kan dan diambil protoplas nya

2. kultur kalus embrionik 3. produksi tunas in vitro 4. protoplas mesofil daun dan kalus

PROSEDUR ISOLASI PROTOPLAS1. Persiapan eksplan Eksplan yang digunakan umumnya berasal dari jaringan

yang lebih muda misal daun (struktur dinding selnya masih sederhana)

2. Sterilisasi eksplan Bagian yang ingin dijadikan eksplan dicuci kemudian

disterilkan dgn Sodium hypoklorit 1-2 % slama 10-30menit kemudian dicuci kembali dengan aquades 3- 4kali tergantung eksplan yg digunakan

3. Isolasi protoplasma Mekanik Enzimatik kemudian di sentrifungi atau dapat pula disaring

METODE MEKANIK Mengupas dinding sel menggunakan alat bedah

mikro dengan memotong sel satu persatu Sel diletakkan pada media dengan konsentrasi yg

lebih tinggi (hipertonis) dari dalam sel plasmolisis

Setelah berkerut (jangan terlalu lama) kemudian dipotong dinding sel nya dan diletakkan dilarutan hipotonis deplasmolisis dihasilkan protoplas

Kelemahannya:a. Keberhasilan rendahb. Sering terjadi kerusakan protoplas pd saat

pengupasan dinding sel

METODE ENZIMATIK Menggunakan enzim yg dapat

mengancurkan / meluruhkan komponen dinding sel seperti: cellulase, Hemicellulase, dan pectinase

Selama 12-18 jam sel-sel akan keluar dan dinding sel akan lisis sehingga didapatkan protoplas.

MEDIA KULTUR Protoplasma yang telah dimurnikan

biasanya dikulturkan dalam medium Agar semisolid dan Liquid.

Umumnya menggunakan media MS atau B5

Diberi larutan osmotikum (untuk mengurangi daya tarik menari / adhesi antara sitoplasma & dinding sel) seperti: manitol 13% atau sorbitol 500-600mM/L

Penambahan 1 mM/L CaCl2 untuk meningkatkan pembelahan sel

ZPT : auksin & sitokinin

CONTOH ISOLASI PROTOPLAS YANG BERHASIL DILAKUKAN1. Jeruk siam simadu dan jeruk mandarin

satsuma dari mesofil daun dengan pemurnian larutan sukrosa 25% + manitol 13%

2. Isolasi protoplas mesofil daun mandarin satsuma dan kalus jeruk siam simadu

3. Tanaman Kacang Panjang secara Enzimatis dari mesofil daun dengan perkecambahan in vitro terlebih dahulu kemudian diambil daun muda nya dan di isolasi protoplas

JERUK SIAM SIMADU DAN JERUK MANDARIN SATSUMA DARI MESOFIL DAUN DENGAN PEMURNIAN LARUTAN SUKROSA 25% + MANITOL 13%

PERKECAMBAHAN KACANG PANJANG (VIGNA SINENSIS L.) SECARA IN VITRO UMUR +10 HARI DAN HASIL ISOLASI ASAL MESOFIL DAUN.

ISOLASI PROTOPLAS MESOFIL DAUN MANDARIN SATSUMA DAN KALUS JERUK SIAM SIMADU DENGAN KOMBINASI ENZIM SELULASE 1%+MASEROZIM 1% YANG DIMURNIKAN DENGAN LARUTAN SUKROSA 25% + MANITOL 13%

protoplas mesofil daun mandarin satsuma

Protoplas kalus embriogenik jeruk siam simadu