Laporan PraktikumISOLASI ENZIM AMILASE DARI MIKROBA Bacillus subtilisnAMA : dwi nichenim : h311 12 264KELOMPOK : iii (tiga)hARI/TGL PERCobaan: kamis/1 mei 2014ASISTEN: sartika

LABORATORIUM BIOKIMIAJURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS HASANUDDINMAKASSAR2014BAB IPENDAHULUAN1.1 Latar BelakangEnzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel hidup, kira-kira lebih dari 2000 enzim telah teridentifikasi yang masing-masing berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia dalam sistem hidup. Sintesis enzim terjadi di dalam sel dan sebagian besar enzim dapat diperoleh dengan ekstraksi dan jaringan tanpa mengubah fungsinya. Salah satu faktor yang berpengaruh pada enzim atau protein adalah keasaman atau pH dan temperatur. Enzim mempunyai aktivitas paling besar atau hilang sama sekali. Begitu pula dengan faktor temperatur. Enzim dapat bekerja pada temperatur optimum (Yazid dan Nursanti, 2006).Ezim merupakan suatu senyawa yang termasuk dalam golongan protein. Enzim ini memiliki fungsi yang sangat penting dalam kelangsungan hidup manusia karena sebagian besar dari proses metabolisme tubuh kita mengikutsertakan kinerja dari enzim tersebut. Enzim amilase adala enzim yang menghidrolisis pati menjadi dekstrin, kemudian menjadi maltosa, dan selanjutnya menjadi glukosa. Enzim ini memecah ikatan -1,4 maupun -1,6 glikolisis. Aktivitas katalitik suatu enzim sangat ditentukan oleh letak pusat aktif. Pada bagian pusat aktif ini terdapat gugus-gugus yang berperan dalam proses biokatalisis (Tim Dosen Biokimia, 2014)Enzim yang digunakan umumnya berasal dari enzim yang diisolasi dari bakteri. Penggunaan enzim dalam proses produksi dapat meningkatkan efisiensi dan meningkatkan jumlah produksi. Hal inilah yang melatarbelakangi percobaan dilakukan.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan1.2.1 Maksud PercobaanMaksud dari percobaan kali ini adalah untuk mempelajari dan mengetahui teknik isolasi enzim amilase dari mikroba Bacillus subtilis dan mengetahui aktivitas enzim amilase.

1.2.2 Tujuan PercobaanTujuan dari percobaan kali ini adalah untuk mengisolasi enzim amilase dari mikroba Bacillus subtilis dan mengetahui aktivitas enzim dari mikroba tersebut.

1.3 Prinsip PercobaanPrinsip dari percobaan kali ini adalah mengisolasi enzim amilase dari mikroba Bacillus subtilis dalam suatu medium padat dengan cara menginokulasi pada agar cawan dengan jarum ose melalui metode penyebaran kultur mikroba di atas agar pada kondisi optimum yaitu suhu 50 C dan pH 7 dan melakukan pengukuran OD dan uji aktivitas.

BAB IITINJAUAN PUSTAKAMikrobiologi berasal dari kata mikro (kecil atau renik), bio (hidup) dan logos (ilmu). Jadi mikrobiologi merupakan bidang ilmu yang mengkaji tentang mikroba seperti virus, archeae, bakteri, fungi, algae, dan protozoa. Mikrobia (mikroorganisme) digunakan untuk menyatakan suatu organisme yang mempunyai ukuran yang sangat kecil, sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang tanpa menggunakan mikroskop (Ali, 2005).Mikroorganisme memegang peranan yang sangat penting, bahkan eksistensinya merupakan persyaratan mutlak bagi terbinanya semua kehidupan yang lain. Sebelum orang mengenal pemakaian mikroskop dengan daya pembesaran yang kuat, dan belum diketahui adanya dunia mikroorganisme, para ahli biologi tidak mengalami kesukaran dalam mengklasifikasi bermacam-macam bentuk hidup yang tampak oleh mata biasa, seperti dunia hewan (animalia) atau dunia tumbuhan (plantae). Tumbuhan dianggap tidak dapat bergerak dan sederhana susunannya, sedangkan hewan dapat bergerak dan susunannya lebih kompleks (Irianto, 2006).Berdasarkan ciri morfologinya, maka sejak tahun 1872 Ferdinan Cohn telah membagi bakteri ke dalam 4 bentuk yang berbeda-beda yaitu (Ali, 2005):1. Bentuk coccus, bakteri berbentuk bundar atau bulat.2. Bentuk basil, bakteri berbentuk batang atau silinder.3. Bentul spiral, bakteri berbentuk batang bengkok atau melingkar.4. Bentuk filamen, bakteri berbentuk serabut.Bakteri berbentuk batang dinamakan basilus (bacillus yang berarti batang). Bentuk basilus dapat pula dibedakan atas dua (Irianto, 2006):1. Basil tunggal, yaitu bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal.2. Diplobasil, yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan dua-dua.3. Streptobasil, yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan memanjang membentuk rantai. Berdasarkan susunan kelompoknya, maka bakteri Bacillus subtilis termasuk dalam kelompok Bacillus, streptobacillus, dan spirillum, yaitu pembelahan melintang terhadap axis longitudinal selnya, lalu terbentuk sel anakan seperti bakteri coccus (sendiri-sendiri)(Ali, 2005).Sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu: 1) sterilisasi pemanasan basah dengan menggunakan uap atau air panas; 2) sterilisasi kering dalam tanur; dan 3) pembakaran total (incineration). Berdasarkan pada ketiga cara tersebut, sterilisasi dapat dibagi menjadi sterilisasi kering (pemijaran, flaming, tanur uap panas) dan sterilisasi basah (penggodokan dalam air, uap mengalir, uap dalam tekanan)(Irianto, 2006).Beberapa mikroba dapat tumbuh dengan baik pada keadaan yang hangat dan lembap misalnya bakteri dapat dibedakan berdasarkan daya tahannya terhadap panas. Bakteri termofilik adalah bakteri yang suhu pertumbuhannya antara 45-55 oC, bakteri mesofilik yang suhu pertumbuhannya antara 20-45 oC dan bakteri psikrofilik adalah bakteri yang suhu pertumbuhannya dibawah 20 oC. spora bakteri pada umumnya pada suhu air mendidih dan pada suhu yang lebih rendah sporanya akan bergraminasi dan berkembang biak (Patong, 2013).Beberapa bakteri yang membutuhkan oksigen untuk tumbuh disebut bakteri aerobik sedangkan bakteri yang lain dapat tumbuh tanpa adanya oksigen disebut bakteri anaerobik. Faktor lingkungan hidup yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba diantaranya air, kelembapan nisbi, suhu, pH, oksigen, mineral dan lain-lain (Patong, 2013).Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel hidup. Sekarang, lebih dari 2000 enzim telah terindentifikasi, yang masing-masing berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia dalam sistem hidup. Sintesis enzim terjadi di dalam sel dan sebagian besar enzim dapat diperoleh dengan ekstraksi dari jaringan tanpa merusak fungsinya (Yazid dan Nursanti, 2006).Enzim adalah pusat untuk setiap proses biokimia yang bertindak dalam urutan terorganisir mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang mendegradasi nutrisi molekul, melestarikan dan mengubah energi kimia dan membuat makromolekul biologis dari prekursor sederhana. Melalui aksi enzim peraturan, jalur metabolisme yang sangat terkoordinasi untuk menghasilkan interaksi yang harmonis antara banyak kegiatan yang diperlukan untuk mempertahankan hidup (Nelson dan Cox, 2004).Berikut ini adalah ringkasan klasifikasi enzim secara internasional (Montgomery dkk., 1993):1. Oksidoreduktase mengkatalisis berbagai macam reaksi oksidasi-reduksi serta sering mempergunakan koenzim seperti NAD+, FAD, atau lipoat sebagai akseptor hidrogen. Nama umum lainnya adalah dehidrogenase, oksidase, peroksidase, dan reduktase.2. Transferase mengkatalisis berbagai jenis transfer kelompok dalam metabolisme banyak langkah-langkah penting yang memerlukan transfer dari satu molekul lain dari kelompok amino, karboksil, metil, asil, glikosil, atau fosforil. Nama umum yang sering digunakan adalah aminotransferase (transaminase), karnitin asil transferase, dan transkarboksilase.3. Hidrolase mengkatalisis pembelahan ikatan antara karbon dan beberapa atom lainnya dengan adanya penambahan air. Nama umum yang sering dijumpai termasuk esterase, peptidase, amilase, fosfatase, urease, pepsin, tripsin, dan kemotripsin.4. Liase mengkatalisis pemecahan ikatan karbon-karbon, karbon-sulfur, karbon-nitrogen tertentu (tidak termasuk peptida). Nama umumnya adalah dekarboksilase, aldolase, sitrat liase, dan dehidratase.5. Isomerase mengkatalisis rasemase isomer optik dan geometrik dan reaksi oksidasi-reduksi intramolekular tertentu. Nama umumnya antara lain epimerase, rasemase, dan mutase.6. Ligase mengkatalisis pembentukan ikatan antara karbon dan oksigen, sulfur, nitrogen, dan atom-atom lain. Energi yang diperlukan untuk pembentukan ikatan sering didapatkan dari hidrolisis ATP. Nama umumnya antara lain sintetase dan karboksilase.Enzim -amilase adalah enzim ekstrasel yang mengkatalisis reaksi pemotongan ikatan glukosidik 1,4 pada bagian dalam molekul substrat (endoenzim). Secara komersial enzim ini dihasilkan baik oleh bakteri dari genus Bacillus (Setiasih dkk., 2006).

BAB IIIMETODE PERCOBAAN3.1 Bahan PercobaanBahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah bakto agar, yeast ekstrak, pepton, NaCl, CaCl2, K2HPO4, MgSO4.7H2O, amilum, BSA (Bovine Serum Albumin), Natrium Kalium Tatrat, Nelson A, Nelson B, buffer Fosfat pH 7, akuades, tissue roll, dan kertas label.

3.2 Alat PercobaanAlat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas kimia 1000 mL, gelas kimia 600 mL, pipet volume 1 mL, statif, bulb, labu semprot, labu ukur 50 mL, kuvet, penangas listrik, gegep, inkubator, cawan petri, erlenmeyer, pipet mikro, pipet tetes, enkas jarum ose, spektrofotometer 20 D+, neraca analitik, autoclave, shaker, sentrifuse, dan pembakar spritus.

3.1 Prosedur Percobaan3.1.1 Pembuatan Medium Padat Mula-mula ditimbang yeast ekstrak 0,2 gram, pepton 1 gram, CaCl2 0,015 gram, K2HPO4 0,01 gram, NaCl 0,01 gram, MgSO47H2O 0,05 gram, pati 1 gram dan bakto agar 2 gram dengan neraca analitik dan dimasukkan dalam gelas kimia. Setelah itu, campuran dilarutkan dengan akuades hingga 100 mL. Diukur pH larutan hingga mencapai pH 7. Larutan kemudian dididihkan lalu diaduk sampai tercampur sempurna lalu dipindahkan dalam tabung erlenmeyer. Tabung kemudian ditutup dengan kapas yang dibungkus kasa, lalu ditutupi lagi dengan aluminium foil. Tabung erlenmeyer dimasukkan dalam autoclave selama 15 menit, dan ditunggu sampai tekanannya turun selama kurang lebih 15 menit lagi. Larutan lalu dituang ke dalam cawan petri yang sebelumnya telah disterilkan dengan cara dicuci bersih, dibungkus kertas dan dimasukkan ke dalam oven. Cawan petri yang telah diisi media padat kemudian dibungkus dengan plastic wrap dan diinkubasi selama 24 jam. Dibuat 4 kuadran pada bagian bawah cawan petri dengan spidol permanen.

3.1.2 Peremajaan MikrobaSetelah terbentuk medium padat, bakteri Bacillus subtilis digoreskan pada medium tersebut. Mula-mula, jarum ose dicelupkan dalam etanol lalu dibakar pada pembakar spiritus sampai berubah warna menjadi kemerahan. Dalam keadaan membara, jarum ose ditempelkan pada tutup bagian dalam cawan petri kemudian diambil sampel bakteri Bacillus subtilis yang telah disediakan sebelumnya, lalu dipindahkan dengan cara digoreskan pada medium padat. Dilakukan berulang-ulang sampai keempat kuadran telah digores. Setelah itu, cawan petri dibungkus kembali dengan plastic wrap dan dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 50 C selama 24 jam kemudian dilanjutkan dengan uji iodida. Stok bakteri yang telah tumbuh dalam cawan petri ditetesi dengan larutan iodida dan dilihat zona bening yang terbentuk.

3.1.3 Pembuatan Media InokulumPembuatan media inokulum dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak 0,16 gram, pepton 0,8 gram, CaCl2 0,012 gram, K2HPO4 0,008 gram, NaCl 0,04 gram, MgSO47H2O 0,04 gram dan pati 1 gram dengan menggunakan neraca analitik dan dimasukkan dalam tabung erlenmeyer. Setelah itu dilarutkan dengan akuades hingga 80 mL kemudianlarutan tersebut dihomogenisasi. Dipanaskan sampai larut kemudian dibagi dalam 4 erlenmeyer masing-masing berisi 20 mL dan disterilkan dalam autoclave.Isolat bakteri yang telah ditumbuhkan pada media padat diambil sebanyak 2-3 ose dan dimasukkan ke dalam inokulum yang telah dibuat. Biakan tersebut dishaker pada suhu 50 C selama 24 jam.

3.1.4 Pembuatan Media ProduksiPembuatan media produksi dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak0,2 gram, pepton 1 gram, CaCl2 0,015 gram, K2HPO4 0,01 gram, NaCl0,05 gram, MgSO47H2O 0,05 gram, dan pati 1 gram dengan neraca analitik dan dimasukkan dalam tabung erlenmeyer. Setelah itu dilarutkan dengan akuades hingga 100 mL akuades kemudian distirrer sampai tercampur sempurna. Larutan kemudian disterilkan di dalam autoclave. Selanjutnya inokulum aktif dipindahkan kedalam media produksi, kemudian dikocok pada kecepatan 180 rpm selama 48 jam pada suhu 50 C.

3.1.5 Pengukuran Optical Density (OD)Larutan yang telah dishaker selama 2 hari diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer 20 D+ pada panjang gelombang 650 nm lalu disentrifugasi 3.500 rpm pada suhu 4 C selama 30 menit. Larutan kemudian akan terbagi menjadi dua bagian, yaitu residu (berupa padatan di dasar tabung) dan supernatan (cairan bening kekuningan). Bagian residu dibuang, sedangkan bagian supernatan diambil untuk pengujian uji aktivitas enzim.

3.1.6 Uji Aktivitas Enzim AmilaseSebanyak 1 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Di tambahkan 0,5 mL amilum dan 0,5 mL buffer pH 6 ke dalam sampel. Dimasukkan ke dalam oven pada suhu 42 C selama 1 jam. Masing-masing larutan sampel, standar, dan blanko dipipet 0,5 mL kedalam tabung reaksi. Ditambahkan 0,5 mL larutan Nelson. Dan dipanaskan selama 15 menit. Ditambahkan 0,5 mL arsen dan diencerkan dengan 3,5 mL aquades. Diukur absorbansi masing-masing larutan dengan menggunakan spektronik 20 D+ pada panjang gelombang maksimum.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil PengamatanPada umumnya enzim amilase berasal dari bakteri, salah satunya bakteri termofilik yang mempunyai aktivitas tinggi dan bersifat lebih stabil seperti bakteri Bacillus subtilis. Pada percobaan ini, dilakukan pembuatan medium padat sebagai tempat pertumbuhan mikroba. Uji aktivitas dilakukan terhadap 3 larutan yaitu larutan blanko, larutan standar, dan larutan sampel dan diukur dengan menggunakan spektrofotometer dan dilakukan pengukuran OD (optical density) atau disebut juga tingkat kekeruhan adalah untuk melihat seberapa banyak mikroba yang ada dalam enzim yang telah dibuat. Data yang diperoleh adalah sebagai berikut.Tabel 1. Penentuan Panjang Gelombang () Maksimum (nm)Absorbansi

6000,209

6500,274

7000,272

Gambar 1. Grafik Penentuan Panjang Gelombang () MaksimumTabel 2. Uji AktivitasKonsentrasiAbsorban

0,0020.214

0,0040,274

0,0060,334

0,0080,580

0,0100,572

0,0120,774

Sampel1,405

Gambar 2. Grafik Uji Aktivitas

4.2 Pembahasan

Pemakaian enzim meningkat pesat, salah satu enzim yang paling banyak digunakan adalah amilase. Pada umumnya enzim amilase berasal dari bakteri, salah satunya bakteri termofilik yang mempunyai aktivitas tinggi dan bersifat lebih stabil seperti bakteri Bacillus subtilis.

Pada percobaan isolasi ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas suatu enzim. Alat yang digunakan telah disterilkan terlebih dahulu, karena mikroba yang dihasilkan bersifat sensitif sehingga diperlukan situasi tertentu agar menghasilkan mikroba dengan baik. Oven digunakan untuk mengeringkan alat yang akandigunakan seperti cawan petri. Autoklaf digunakan untuk mensterilkan bahan dengan cara penguapan dan tekanan yang dapat diatur, sesuai yang diinginkan. Enkas yang berfungsi sebagai tempat peremajaan mikroba atau tempat untuk bekerja yang dapat mengurangi kontaminasi dengan udara. Sebelum digunakan, enkas ini harus disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 70 % kedalamnya. Sentrifuge digunakan untuk menstrifugasi bahan agar dapat terpisah secara jelas antara filtrate dan residu.Inkubator digunakan untuk memanaskan larutan dengan suhu yang diinginkan.

4.2.1 Pembuatan Medium Padat

Pembuatan medium padat berfungsi sebagai tempat peremajaan bakteri. Mikroba itu akan tumbuh dalam medium padat yang komposisinya terdiri dari bakto agar, yang berfungsi sebagai sumber energi dan sumber karbohidrat yang mengandung karbon. Yeast ekstrak berfungsi sebagai sumber nutrisi bagi bakteri. Serbuk (NH4)2SO4 sebagai sumber senyawa nitrogen. Serbuk Mg2SO4 sebagai sumber unsur logam Mg dan NaK2HPO4 digunakan sebagai sumber fosfat yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba.

Pada peremajaan bakteri pada media padat dilakukan penggoresan, dimana penggoresan terdapat beberapa teknik, namun teknik yang digunakan dalam percobaan ini adalah teknik sinambung, yakni penggoresan yang dilakukan berbentuk zig-zag. Penggoresan dilakukan dalam medium padat yang telah dibuat. Dimana medium yang digunakan harus betul-betul kering, agar koloni yang dihasilkan menyebar mengikuti goresannya.

Penggoresan dilakukan dengan menggunakan ose. Sebelum digunakan jarum tersebut dipijarkan terlebih dahulu, hal ini bertujuan agar bakteri yang terdapat pada mata ose tersebut dapat dihilangkan dan mencegah pencemaran penggoresan pada daerah berikutnya. Kemudian dilakukan pemanasan dengan lampu spiritus yang bertujuan untuk menghilangkan bakteri yang terdapat disekitar alat gelas, yang dapat mengganggu pertumbuhan mikroba. Setelah perlakuan berdasarkan prosedur maka dihasilkan dua macam medium, yakni medium yang berisi mikroba dan medium yang tidak mengisi mikroba. Dimana medium yang berisi medium akan menghasilkan zona-zona bening yang sudah dimakan oleh subtrat. Sedangkan pada medium yang tidak berisi mikroba dapat terjadi karena telah terkontaminasi dengan udara luar pada saat penggoresan.

4.2.2 Pembuatan Medium Inokulum dan Media Produksi.Pembuatan medium inokulum berfungsi sebagai tempat mikroba mengadaptasi lingkungannya. Pada tahap ini, medium dishaker karena bakteri akan tumbuh secara maksimal di daerah yang bergerak. Komposisinya sama dengan komposisi medi padat namun tidak menggunakan bakto agar. Lalu bakteri yang tumbuh di medium padat diinokulum pada medium inokulum yang dilakukan dalam enkas agar tetap steril.Setelah biakan dishaker selama 24 jam. Biakan kemudian dipindahkan ke dalam media produksi dan dishaker selama 48 jam untuk produksi enzim amilase.

4.2.4 Penentuan OD dari Larutan Enzim dan Uji Aktivitas EnzimUntuk mengetahui uji aktifitas enzim dilakukan pengukuran larutan sampel, larutan standar dan larutan blanko sebagai pembanding. Larutan sampel didapatkan dari larutan yang dishaker selama 3 hari kemudian ditambahkan dengan buffer pH 5,0, 6,8 dan 7,4 dikarenakan enzim pada larutan tersebut bekerja pada pH optimum. Ditambahkan pula dengan larutan amilum yang berfungsi sebagai substratnya. Kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 38 C karena pada suhu ini enzim bekerja. Setelah sampai pada waktu 10 menit, ditambahkan TCA (trikloroasetat) 1,5 M. Fungsi penambahan tersebut yaitu untuk mendenaturasi protein yang terkandung dalam larutan tersebut dan pada kondisi ini enzim tidak bekerja lagi. Dimasukkan dalam sentrifus 3500 rpm selama 30 menit, agar dapat terpisah secara jelas antara filtrat dan residu. Hasil yang didapatkan adalah sebagai berikut.

Gambar 3. Grafik Uji Aktivitasy = 61,9x 0,01161,405= 61,9x 0,0116

x= x= 0,0227 mMDiketahui, t = 10 menit V = 0,1 mL

1 unit =

= = 0,000227 U= 2,27 x 10-4 UTotal aktivitas enzim dalam percobaan adalah 2,27 x 10-4 U/mL x 100 mL = 2,27 x 10-2 UJadi, aktifitas enzim yang diperoleh dalam percobaan ini secara keseluruhan adalah 0,0227 Unit.Berdasarkan tabel dan grafik di atas, didapatkan nilai OD (Optical Density) dapat diperoleh dengan pengukuran optical density dengan menggunakan spektrofotometer 20 D+. Pengukuran ini bertujuan untuk mengetahui sejauh mana pertumbuhan mikroba.0,214 + 0,274 + 0,334 + 0,580 + 0,572 + 0,774 + 1,405OD =

7 = 0,59Nilai OD (Optical Density) yang diperoleh untuknilai OD yang diperoleh yaitu 0,59. Semakin tinggi nilai OD (Optical Dencity) maka semakin banyak bakteri yang dihasilkan dan begitu pula pada tingkat kekeruhan yang memperlihatkan bahwa semakin keruh berarti semakin banyak bakteri yang tumbuh pada medium. Semakin tinggi tingkat kekeruhan maka semakin banyak bakteri yang dihasilkan. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa semakin banyak bakteri yang dihasilkan dalam medium produksi maka semakin besar aktifitas enzim yang terjadi di dalamnya.

BAB VPENUTUP5.1 KesimpulanDari percobaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan bahwa enzim amilase dapat diisolasi dari mikroba Bacillus subtilis yang terbentuk pada medium ditandai dengan adanya zona-zona bening dengan aktivitas optimum enzim pada pH 7-8 dan nilai aktivitas enzim pada larutan mikroba adalah 0,0227 Unit.

5.2 Saran5.2.1 LaboratoriumSaran untuk laboratorium agar lebih memperhatikan kualitas bahan-bahannya dan memperhatikan alat-alatnya agar tidak terjadi kesalahan yang tidak terduga.

5.2.2 PraktikumSaran untuk praktikum mungkin untuk ke depannya dilakukan isolasi enzim lain dari mikroba seperti enzim protease yang tentunya dengan menggunakan metode lain seperti metode Lowry.

5.2.3 AsistenSaran untuk asisten agar dapat lebih memperhatikan praktikan dalam pengerjaan praktikum ini sehingga dapat meminimalisir kesalahan yang mungkin terjadi.

DAFTAR PUSTAKAAli, A., 2005, Mikrobiologi Dasar, Badan Penerbit UNM, Makassar.

Irianto, K., 2006, Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme, CV. Yrama Widya, Bandung.

Montgomery, R., Dryer, R. L., Conway, T. W., dan Spector, 2001, Biochemistry: A Case Oriented Approach, Sixth Edition, C.V.Mosby Co., St.Louis.

Nelson, D.L., Cox, M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition, Amazone.

Patong, A.R., 2013, Analisis Kimia Pangan, Dua Satu Press, Makassar.

Setiasih, S., Wahyuntari, B., Trismilah, dan Apriliani, D., 2006, Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstrasel dari Isolat Bakteri Termofil SW2, Jurnal Kimia Indonesia, 1(1):22-27.

Tim Dosen Biokimia, 2013, Penuntun Praktikum Biokimia, FMIPA Universitas Hasanuddin, Makassar.

Yazid, E., dan Nursanti L., 2006, Penuntun Praktikum Biokimia untuk Mahasiswa Analisis, Penerbit Andi, Yogyakarta.

LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 30 Mei 2014Asisten Praktikan

SARTIKA DWI NICHELampiran 1. Bagan KerjaA. Pembuatan Medium Padat2 gram Bakto agar

Ditambahkan 0,2 gram yeast ekstrak, 1 gram pepton, 0,01 gram NaCl, 0,01 gram K2HPO4, 0,05 gram MgSO4.7H2O, 0,15 gram CaCl2 anhidrat, dan 1 gram amilum. Dicampur dalam gelas kimia.Campuran

- Dilarutkan dengan aquades hingga 100 mL dan diaduk hingga semua larut.- pH diatur hingga tercapai pH 7.- Dipanaskan hingga mendidih selama 10 menit.- Dituang ke dalam erlenmeyer dan ditutup dengan kapas wol serta aluminium foil.- Disterilkan dengan autoclaveMedium

- Larutan dituang ke dalam cawan petri.- Cawan petri dilapisi dengan parafilm dan didiamkan dalam oven.- Ditandai menjadi empat kuadran.- Mikroba digoreskan pada permukaan medium- Cawan petri dimasukkan dalam oven pada suhu 50 oCMedium Steril

B. Pembuatan Media Inokulum0,16 gram yeast ekstrakMedium steril

- Ditambahkan dengan 0,8 gram pepton, 0,4 gram NaCl, 0,008 gram K2HPO4, 0,04 gram MgSO4.7H2O, 0,012 gram CaCl2 anhidrat dan1 gram amilum.-Dicampurkan ke dalam erlenmeyer 250 mL dan dilarutkan dengan 80 mL aquades.-Dishake selama 3 hari kemudian disterilkan.-Dimasukkan isolate bakteri Bacillus subtilis yang telah ditumbuhkan tadi ke dalam media padat dengan menggunakan jarum ose.-Dibiakkan dan dishakepada suhu kamar selama satu malam

C. Pembuatan Medium Produksi0,2 gram yeast ekstrak

Ditambahkan 1 gram pepton, 0,05 gram NaCl, 0,01 gram KH2PO4, 0,05 gram MgSO4.7H2O, 1 gram Pati dan 0,015 g CaCl2 anhidrat. Dicampurkan ke dalam erlenmeyer 250 mL Ditambahkan akuades hingga volume mencapai 100 mL. Dishaker selama 3 hari. Disterilkan dalam autoclave. Dipindahkan ke dalam media produksi Dikocok pada kecepatan 180 rpm selama 48 jam pada suhu 50 CHasil

D. Penentuan Optical DensityLarutan Blanko, Larutan Standar, dan Larutan Sampel

Diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 650 nm. Disentrifuse 3500 rpm pada suhu 4 C selama 30 menit.Hasil

E. Uji Aktivitas EnzimLarutan Blanko, Larutan Standar, dan Larutan Sampel

Dihidrolisis sampel dengan memasukkan 1 mL enzim ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 0,5 mL amilum dan 0,5 mL buffer pH 6 pada sampel. Dimasukkan dalam oven sampel tadi pada suhu 42 C selama1 jam. Masing-masing larutan sampel, standar, dan blanko dipipet 0,5 mL ke dalam tabug reaksi . Ditambahkan 0,5 mL Neslon A dan dipanaskan selama 15 menit. Ditambahkan 0,5 mL arsen dan diencerkan dengan 3,5 mL aquades. Diukur absorbansi masing-masing larutan dengan menggunakan spektronik 20 D+ pada panjang gelombang maksimum 650 nm. Hasil

Lampiran 2. Gambar PengamatanLarutan Deret Standar

Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan Bakteri