isolasi dna
TRANSCRIPT
A. Topik Praktikum
Isolasi DNA dengan teknik manual
B. Hari/Tanggal
Senin/5 Desember 2011
C. Tujuan
Untuk mengetahui teknik isolasi DNA dan metode Elektroforesis untuk
mendeteksi keberhasilan hasil isolasi.
D. Alat dan Bahan
Alat.
1. Tabung Eppendorf.
2. Tabung polypropylene.
3. Mikropipet.
4. Rak tabung.
5. Botol ampul.
6. Blue tip.
7. Yellow tip.
8. Vortex.
9. Sentrifuge.
10. Alat elektroforesis.
11. Alat pewarnaan gel dengan EtBr, dan gell doc (UV).
Bahan.
1. Sampel darah.
2. Tris HCl.
3. EDTA.
4. NaCl.
5. Kloroform.
6. MgCl2.
7. KCl.
8. SDS.
9. Etanol absolut.
10. EtBr.
11. Loading dye.
12. Agarose.
13. Aquadest.
E. Cara Kerja.
a. Isolasi DNA
1. Memasukkan 500 µl darah ke dalam tabung Eppendorf dengan menggunakan
mikropipet dan memakai blue tip.
2. Menambahkan 500 µl larutan 1 dan mencampurnya hingga homogen.
3. Menambahkan 12 µl NP40 dan mencamputkannya hingga homogen.
4. Mensentrifuge campuran pada kecepatan 2500 rpm selama 10 menit pada
suhu 4 0C.
5. Membuang supernatant yang terbentuk dan menambahkan 200 µl larutan 2,
kemudian mencampurnya hingga pelet larut.
6. Menambahkan fenol sebanyak 40 µl kemudian memvortex dan dilanjutkan
mensentrifuge selama 3 menit pada kecepatan 13.000 rpm.
7. Mengambil supernatan dan memasukkannya pada Eppendorf yang baru dan
dilanjutkan dengan menambahkan 20 µl kloroform: isoamil alcohol kemudian
memvortex campuran.
8. Mensentrifuge selama 2 menit pada kecepatan 13.000 rpm.
9. Mengambil supernatant dan memasukkannya ke dalam tube yang baru.
10. Menambahkan 40 µl kloroform: isoamil alkohol kemudian memvortex
campuran tersebut.
11. Mensentrifuge pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit.
12. Mengambil supernatan dan menambahkannya dengan 2 kali volume etanol
absolute 96% dingin.
13. Meletakkan pada freezer selama 5 menit kemudian mensentrifuge selama 5
menit pada kecepatan 13.000 rpm.
14. Membuang supernatant kemudian mencuci pellet DNA dengan 100 µl etanol
70%.
15. Mensentrifuge campuran pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit
kemudian membuang supernatan yang ada.
16. Mengeringkan pelet DNA dengan vacuum/aspirator atau bisa dengan
dianginkan selama 1 hari.
17. Menambahkan 15 µl TE.
18. DNA hasil isolasi dapat disimpan pada suhu -20 0C.
b. Elektroforesis dengan gel agarose
1. Membuat gel agarose dengan konsentrasi 0,8 %. Caranya dengan menimbang
0,8 gram agarose kemudian melarutkannya dengan TBE Buffer 1x sebanyak
100 ml, dan kemudian memanaskan dalam microwave selama 2 menit.
2. Menuangkan gel yang masih panas ke dalam cetakan yang telah disiapkan
dan diberi sisiran untuk membuat sumuran.
3. Menunggu hingga gel menjadi dingin.
4. Setelah gel dingin, kemudian memindahakn gel tersebut ke dalam
elektroforesis chamber dan menuangkan TBE Buffer.
5. Setelah itu mencampurkan Loading dye dengan sampel DNA kemudian
memasukkannya ke dalam sumuran-sumuran yang telah dibuat di gel agarose.
6. Menjalankan alat elektroforesis dan menjalankannya sekitar 45 menit hingga
terlihat loading dye yang berwarna biru bergerak.
7. Setelah running selesai maka dilakukan pewarnaan dengan EtBr dalam alat
shaker.
8. Mengamati gel di gell doc yang di dalamnya terdapat lampu UV, kemudian
memotret hasilnya.
F. Dasar Teori
1. Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel,
yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi,
beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim,dilanjutkan
langkah berikutnya adalah lisis sel.
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp
isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 1993 dalam asris07, 2010).
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada
akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa
bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai.
Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa
mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA
tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara
pengumpulan DNA dari darah sapi.
Pengetahuan DNA lebih ditekankan untuk hewan, – sapi – perbedaan garis
pada foto menunujukkan perbedaan bangsa, tampilan fisik, dan mungkin akan
mengarah kepada tampilan produksi. Praktikum isolasi DNA darah sapi memang
tergolong memerlukan waktu yang relatif lama, namun sebanding dengan ilmu
yang diperoleh.
Deteksi DNA melalui elektroforesis dapat dilakukan dengan gel agarose dan gel
polyacrilamide. Namun, pada praktikum kali ini menggunakan gel agarose.
Karena jumlah DNA yang hanya mencapai 10 ng mampu terdeteksi oleh gel
agarose. Proses elektroforesis gagal dilakukan, waktu dan arus yang terlalu tinggi
ditengarahi menjadi faktor utama kegagalan tersebut. (Prafitdhin, 2009)
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara
ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat
dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal
dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA
prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki
protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear
dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315--316; Raven &
Johnson 2002: 94).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan
pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin
dan pirimidin. 'Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki
struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin
(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan
Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin
berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu
komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu
gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176--
178).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat
herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi
genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. (Human Genome Project 2005: 1)
DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan.
DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma
darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas
(oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel
darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah
yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena
memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga
dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada
pisang (Musa sp.) (Kimball 2005: 8; Kent & Carr 2001: 317).
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan
presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin
yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya
2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Kimball 2005: 4; Lewiston
2002:1--3; LPCH 2005: 2).
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan,
pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan
presipitasi, yaitu.
1. Mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah.
2. Melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah merah.
Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel
darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan
2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian
dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat
ekstrak nukleus sel darah putih.
3. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan
sel darah putih dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi
bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak
lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat (Kimball 2005: 4; Lewiston 2002:1--3;
LPCH 2005: 2).
4. Tahap isolasi jaringan; untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah
yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu
dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke
dalam tabung yang berisi darah diberikan larutan pelisis sel darah merah yang
merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan
terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA
(ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate)
dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse.
Selanjutnya tabung dibolak-balik denan gerakan memutar yang membentuk
angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Darah
yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya
supernatan yang terbentuk dibuang. Untuk melisiskan membran sel dan
membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi, diberikan larutan pelisis
sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit
hancur (Rybicki & Purves 2005: 1; Harley 2005: 410).
5. Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan
sel darah putih dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan
RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan
untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.
Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara
meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan
untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas
amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan
terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah,
sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi
isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8.
Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung
disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari
sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian
ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol
bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah
tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan
kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar
tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang
bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi (Harley 2005:
409--410; Lewiston 2002: 1--2).
Isolasi DNA genom tanaman memiliki prinsip yang sama dengan isolasi
DNA sel darah putih. Langkah pertama adalah dengan memasukkan sampel
tanaman ke dalam blender dan blender selama 5 menit. Hasil blender kemudian
ditambahkan air dengan perbandingan 1:1 dan garam lalu diaduk selama 15 menit.
Garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi DNA genom sel
darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih
stabil. Campuran tersebut kemudian disaring dengan corong dan ditambahkan
isopropanol yang berfungsi untuk memvisualisasikan DNA dan menetralkan
(desalted) sebab isopropanol tidak memiliki muatan, sedangkan DNA bermuatan
negatif (-). Kemudian tabung dibolak-balik untuk mendapatkan DNA. Akan
tetapi, setelah diberikan Tris-EDTA, yang didapat oleh praktikan hanyalah
pengotor yang tidak larut di dalamnya. Hal ini dapat terjadi karena kurang teliti
dalam mengerjakan proses isolasi tersebut (Harley 2005: 410).
2. Elektroforesis
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat
sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip,
teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan
berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan
terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda
(menggunakan prinsip dalam elektroforesis) (Wikipedia, 2011).
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada
suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik
tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.dengan demikian elektroforesis dapat
di gunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).posisi
molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang
banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat elektroforesis yang
dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida
(PAGE=poli-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada
pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada
dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan
bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh
karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam
medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan
negative, maka pertikel itu akan menuju elktrode positif
Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya
pengaruh medan listrik. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz,
yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi
elektris lingkungan: F= q.E
dimana, F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E
adalah medan listrik.
Elektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan
ke salah satu elektroda. Elektrotoresis dapat digunakan untuk mendeteksi muatan
partikel koloid. Jika partikel koloid berkumpul di elektroda positif berarti koloid
bermuatan negatif dan jika partikel koloid berkumpul di elektroda negatif berarti
koloid bermuatan positif.
Gambar 1. Rangkaian proses elektroforesis gel
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi
molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam
matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul
sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR,
kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode
karakterisasi lebih lanjut.
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat
sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip,
teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan
berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan
terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda
(menggunakan prinsip dalam elektroforesis
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang
(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk
memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau
oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,
dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang
memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam
nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang
digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur
(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel
ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,
arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif
alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju
perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk
menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi
dengan deterjen (misalnya natrium didesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan
(staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida,
perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk
keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya
setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet.
Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut
dibuat.
G. Data dan Analisis Data
Berdasarkan pada data yang didapat, yakni foto hasil elektroforesis dapat
dilihat tidak adanya pita-pita yang muncul pada gel yang dipakai untuk proses
elektroforesis. Berikut adalah foto gel hasil elektroforesis.
Gambar 2. Menuangkan agarose ke elektroforesis dengan menggunakan
mikropipet
Gambar 3. Foto hasil elektroforesis untuk mengecek keberadaan DNA
Gambar di atas menunjukkan tidak adanya pita-pita berwatna putih yang
terbentuk. Dari kondisi ini dapat dilihat kalau proses isolasi yang dilakukan tidak
berhasil. Tidak adanya pita menunjukkan tidak adanya DNA pada sumuran yang
ada dalam gel elektroforesis.
Pada saat diberi etanol absolut baru tampak adanya benang-benang
berwarna putih seperti kabut. Dugaan awal yang muncul adalah bahwa benang-
benang tersebut merupakan DNA, karena DNA dapat terpresipitasi di dalam
alcohol absolute dingin. Namun ternyat setelah dilakukan elektroforesis ternyata
tidak muncul pita-pita DNA. Berarti kemungkinan yang muncul sebagai benang
ketika diberi Etanol bukan DNA melainkan pengotornya saja.
Keberadaan DNA seharusnya ditunjukkan dengan adanya band atau pita
berwarna putih ketika gel disinari dengan sinar ultraviolet. Pada gel dapat muncul
warna putih karena DNA telah berikatan dengan EtBr, dan EtBr memiliki sifat
dapat berpendar ketika disinari dengan sinar ultra violet.
H. Pembahasan
Hasil analisis data menunjukkan bahwa proses isolasi DNA berhasil
dilaksanakan. Keberhasilan ini dapat dilihat dari adanya terbentuknya pita-pita
DNA pada gel agarose ketika dilakukan pengamatan di gell doc.
Perpindahan molekul DNA dari medan listrik negatif ke arah positif terjadi
ketika DNA di running pada proses elektroforesis. Cara deteksi DNA dilakukan
dengan menggunakan media gel agarosa. Isolat DNA sebelum dimasukkan
ditambahkan bahan kimia berupa loading dye agar warnanya memudahkan
pemindaian. Sehingga terlihat sampai dimana DNA tersebut berjalan memintas
gel agarose.
Foto pada data diambil menggunakan kamera yang dibantu dengan
penyinaran Ultra Violet (UV). Namun pita DNA tidak muncul. Menurut
Prafitdhin (2009), tidak adanya pita DNA ini dapat diakibatkan oleh waktu
perendaman yang terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis, maka
DNA gagal berada di gel agarose. DNA terus menembus gel tersebut hingga
keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel.
I. Diskusi
Fungsi kemikalia yang dipakai dalam kegiatan isolasi DNA
1. Tris-HCl: sebagai buffer elusion
2. EDTA: sebagai pengikat ion Mg2+ yang merupakan kofaktor enzim
endonuklease
3. NaCl: sebagai pengokat DNA, Na+ dapat mengikat DNA yang bermuatan
negatif
4. SDS: deterjen yang berfungsi untuk melisiskan membran sel karena mengikat
molekul lipid yang ada pada mebran sehingga membrane akan rusak.
5. Alkohol 96%: untuk mempresipitasi DNA
6. Alkohol 70% untuk mencuci DNA dari berbagai kemikalia yang mungkin
tersisa selama proses isolasi DNA
J. Daftar Rujukan
Isolasi DNA http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/
Suropeji. 2009. Isolasi DNA. (on line)
http://suropeji.com/isolasi-dna/#ixzz1g8uB6PgB. Diakses 13
Desember 2011.
Prafitdhin, Achmad. 2009. Isolasi DNA, Polymerase Chain reaction (PCR), dan
deteksi DNA melalui Elektroforesis. (on line) http://prafitdhin-
achmad.blogspot.com/2010/02/isolasi-dna-polymerase-chain-
reaction.html. diakses tanggal 16 Desember 20011.
ISOLASI DNA KERBAU
LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
Untuk memenuhi tugas terstruktur matakuliah Bioteknologi yang dibimbing oleh Dr.agr. M. Amin, S.Pd., M.Si., Dr. Ummie Lestari M.Si., dan
Dr. Endang Suarsini M.Ked
Disusun Oleh
Nur Ismirawati100341507516
Off B
UNIVERSITAS NEGERI MALANGPROGRAM PASCASARJANA
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGIDesember 2011