isolasi dna

23
A. Topik Praktikum Isolasi DNA dengan teknik manual B. Hari/Tanggal Senin/5 Desember 2011 C. Tujuan Untuk mengetahui teknik isolasi DNA dan metode Elektroforesis untuk mendeteksi keberhasilan hasil isolasi. D. Alat dan Bahan Alat. 1. Tabung Eppendorf. 2. Tabung polypropylene. 3. Mikropipet. 4. Rak tabung. 5. Botol ampul. 6. Blue tip. 7. Yellow tip. 8. Vortex. 9. Sentrifuge. 10. Alat elektroforesis. 11. Alat pewarnaan gel dengan EtBr, dan gell doc (UV). Bahan. 1. Sampel darah. 2. Tris HCl. 3. EDTA. 4. NaCl.

Upload: criztiawan-blitzshter

Post on 24-Jul-2015

721 views

Category:

Documents


6 download

TRANSCRIPT

Page 1: Isolasi DNA

A. Topik Praktikum

Isolasi DNA dengan teknik manual

B. Hari/Tanggal

Senin/5 Desember 2011

C. Tujuan

Untuk mengetahui teknik isolasi DNA dan metode Elektroforesis untuk

mendeteksi keberhasilan hasil isolasi.

D. Alat dan Bahan

Alat.

1. Tabung Eppendorf.

2. Tabung polypropylene.

3. Mikropipet.

4. Rak tabung.

5. Botol ampul.

6. Blue tip.

7. Yellow tip.

8. Vortex.

9. Sentrifuge.

10. Alat elektroforesis.

11. Alat pewarnaan gel dengan EtBr, dan gell doc (UV).

Bahan.

1. Sampel darah.

2. Tris HCl.

3. EDTA.

4. NaCl.

5. Kloroform.

6. MgCl2.

7. KCl.

8. SDS.

9. Etanol absolut.

10. EtBr.

11. Loading dye.

Page 2: Isolasi DNA

12. Agarose.

13. Aquadest.

E. Cara Kerja.

a. Isolasi DNA

1. Memasukkan 500 µl darah ke dalam tabung Eppendorf dengan menggunakan

mikropipet dan memakai blue tip.

2. Menambahkan 500 µl larutan 1 dan mencampurnya hingga homogen.

3. Menambahkan 12 µl NP40 dan mencamputkannya hingga homogen.

4. Mensentrifuge campuran pada kecepatan 2500 rpm selama 10 menit pada

suhu 4 0C.

5. Membuang supernatant yang terbentuk dan menambahkan 200 µl larutan 2,

kemudian mencampurnya hingga pelet larut.

6. Menambahkan fenol sebanyak 40 µl kemudian memvortex dan dilanjutkan

mensentrifuge selama 3 menit pada kecepatan 13.000 rpm.

7. Mengambil supernatan dan memasukkannya pada Eppendorf yang baru dan

dilanjutkan dengan menambahkan 20 µl kloroform: isoamil alcohol kemudian

memvortex campuran.

8. Mensentrifuge selama 2 menit pada kecepatan 13.000 rpm.

9. Mengambil supernatant dan memasukkannya ke dalam tube yang baru.

10. Menambahkan 40 µl kloroform: isoamil alkohol kemudian memvortex

campuran tersebut.

11. Mensentrifuge pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit.

12. Mengambil supernatan dan menambahkannya dengan 2 kali volume etanol

absolute 96% dingin.

13. Meletakkan pada freezer selama 5 menit kemudian mensentrifuge selama 5

menit pada kecepatan 13.000 rpm.

14. Membuang supernatant kemudian mencuci pellet DNA dengan 100 µl etanol

70%.

15. Mensentrifuge campuran pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit

kemudian membuang supernatan yang ada.

16. Mengeringkan pelet DNA dengan vacuum/aspirator atau bisa dengan

dianginkan selama 1 hari.

Page 3: Isolasi DNA

17. Menambahkan 15 µl TE.

18. DNA hasil isolasi dapat disimpan pada suhu -20 0C.

b. Elektroforesis dengan gel agarose

1. Membuat gel agarose dengan konsentrasi 0,8 %. Caranya dengan menimbang

0,8 gram agarose kemudian melarutkannya dengan TBE Buffer 1x sebanyak

100 ml, dan kemudian memanaskan dalam microwave selama 2 menit.

2. Menuangkan gel yang masih panas ke dalam cetakan yang telah disiapkan

dan diberi sisiran untuk membuat sumuran.

3. Menunggu hingga gel menjadi dingin.

4. Setelah gel dingin, kemudian memindahakn gel tersebut ke dalam

elektroforesis chamber dan menuangkan TBE Buffer.

5. Setelah itu mencampurkan Loading dye dengan sampel DNA kemudian

memasukkannya ke dalam sumuran-sumuran yang telah dibuat di gel agarose.

6. Menjalankan alat elektroforesis dan menjalankannya sekitar 45 menit hingga

terlihat loading dye yang berwarna biru bergerak.

7. Setelah running selesai maka dilakukan pewarnaan dengan EtBr dalam alat

shaker.

8. Mengamati gel di gell doc yang di dalamnya terdapat lampu UV, kemudian

memotret hasilnya.

F. Dasar Teori

1. Isolasi DNA

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel,

yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi,

beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim,dilanjutkan

langkah berikutnya adalah lisis sel.

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp

isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk

memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang

mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul

ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 1993 dalam asris07, 2010).

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu

supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

Page 4: Isolasi DNA

Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada

akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa

bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai.

Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa

mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA

tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara

pengumpulan DNA dari darah sapi. 

Pengetahuan DNA lebih ditekankan untuk hewan, – sapi – perbedaan garis

pada foto menunujukkan perbedaan bangsa, tampilan fisik, dan mungkin akan

mengarah kepada tampilan produksi. Praktikum isolasi DNA darah sapi memang

tergolong memerlukan waktu yang relatif lama, namun sebanding dengan ilmu

yang diperoleh.

Deteksi DNA melalui elektroforesis dapat dilakukan dengan gel agarose dan gel

polyacrilamide. Namun, pada praktikum kali ini menggunakan gel agarose.

Karena jumlah DNA yang hanya mencapai 10 ng mampu terdeteksi oleh gel

agarose. Proses elektroforesis gagal dilakukan, waktu dan arus yang terlalu tinggi

ditengarahi menjadi faktor utama kegagalan tersebut. (Prafitdhin, 2009)

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara

ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat

dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk

sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria

dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal

dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola

pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA

prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki

protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear

dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315--316; Raven &

Johnson 2002: 94).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan

Page 5: Isolasi DNA

pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin

dan pirimidin. 'Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki

struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin

(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan

Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin

berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu

komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu

gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176--

178).

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat

herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi

genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. (Human Genome Project 2005: 1)

DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan.

DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma

darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas

(oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel

darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah

yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena

memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga

dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang merah (Allium cepa) dan pada

pisang (Musa sp.) (Kimball 2005: 8; Kent & Carr 2001: 317).

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan

presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan

berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi

yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan

terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin

yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya

2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Kimball 2005: 4; Lewiston

2002:1--3; LPCH 2005: 2).

Page 6: Isolasi DNA

Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan,

pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan

presipitasi, yaitu.

1. Mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah.

2. Melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah merah.

Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel

darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan

2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian

dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat

ekstrak nukleus sel darah putih.

3. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan

sel darah putih dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi

bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak

lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang

menyebabkan DNA menjadi terlihat (Kimball 2005: 4; Lewiston 2002:1--3;

LPCH 2005: 2).

4. Tahap isolasi jaringan; untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah

yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu

dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke

dalam tabung yang berisi darah diberikan larutan pelisis sel darah merah yang

merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan

terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA

(ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate)

dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse.

Selanjutnya tabung dibolak-balik denan gerakan memutar yang membentuk

angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Darah

yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu

disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya

supernatan yang terbentuk dibuang. Untuk melisiskan membran sel dan

membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi, diberikan larutan pelisis

sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)

Page 7: Isolasi DNA

yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit

hancur (Rybicki & Purves 2005: 1; Harley 2005: 410).

5. Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan

sel darah putih dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan

RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan

untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.

Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara

meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan

untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas

amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan

terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah,

sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian

disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm.

Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi

isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8.

Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung

disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari

sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian

ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol

bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah

tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan

kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar

tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang

bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi (Harley 2005:

409--410; Lewiston 2002: 1--2).

Isolasi DNA genom tanaman memiliki prinsip yang sama dengan isolasi

DNA sel darah putih. Langkah pertama adalah dengan memasukkan sampel

tanaman ke dalam blender dan blender selama 5 menit. Hasil blender kemudian

ditambahkan air dengan perbandingan 1:1 dan garam lalu diaduk selama 15 menit.

Garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi DNA genom sel

darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih

stabil. Campuran tersebut kemudian disaring dengan corong dan ditambahkan

Page 8: Isolasi DNA

isopropanol yang berfungsi untuk memvisualisasikan DNA dan menetralkan

(desalted) sebab isopropanol tidak memiliki muatan, sedangkan DNA bermuatan

negatif (-). Kemudian tabung dibolak-balik untuk mendapatkan DNA. Akan

tetapi, setelah diberikan Tris-EDTA, yang didapat oleh praktikan hanyalah

pengotor yang tidak larut di dalamnya. Hal ini dapat terjadi karena kurang teliti

dalam mengerjakan proses isolasi tersebut (Harley 2005: 410).

2. Elektroforesis

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat

sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip,

teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan

berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan

terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda

(menggunakan prinsip dalam elektroforesis) (Wikipedia, 2011).

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada

suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik

tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.dengan demikian elektroforesis dapat

di gunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).posisi

molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau

autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk

mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang

digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang

banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat elektroforesis yang

dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida

(PAGE=poli-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada

pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada

dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan

bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam

elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh

karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam

Page 9: Isolasi DNA

medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan

negative, maka pertikel itu akan menuju elktrode positif

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya

pengaruh medan listrik. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz,

yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi

elektris lingkungan: F= q.E

dimana, F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E

adalah medan listrik.

Elektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan

ke salah satu elektroda. Elektrotoresis dapat digunakan untuk mendeteksi muatan

partikel koloid. Jika partikel koloid berkumpul di elektroda positif berarti koloid

bermuatan negatif dan jika partikel koloid berkumpul di elektroda negatif berarti

koloid bermuatan positif.

Gambar 1. Rangkaian proses elektroforesis gel

Page 10: Isolasi DNA

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi

molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat

dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut

dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam

matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul

bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun

dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul

sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR,

kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode

karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat

sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip,

teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan

berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan

terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda

(menggunakan prinsip dalam elektroforesis

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk

memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau

oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,

dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang

memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan

poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam

nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang

digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur

(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan

kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel

ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,

arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif

alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju

perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu

Page 11: Isolasi DNA

panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk

menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi

dengan deterjen (misalnya natrium didesil sulfat, SDS) untuk membuat protein

tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan

(staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida,

perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk

keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya

setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet.

Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut

dibuat.

G. Data dan Analisis Data

Berdasarkan pada data yang didapat, yakni foto hasil elektroforesis dapat

dilihat tidak adanya pita-pita yang muncul pada gel yang dipakai untuk proses

elektroforesis. Berikut adalah foto gel hasil elektroforesis.

Gambar 2. Menuangkan agarose ke elektroforesis dengan menggunakan

mikropipet

Page 12: Isolasi DNA

Gambar 3. Foto hasil elektroforesis untuk mengecek keberadaan DNA

Gambar di atas menunjukkan tidak adanya pita-pita berwatna putih yang

terbentuk. Dari kondisi ini dapat dilihat kalau proses isolasi yang dilakukan tidak

berhasil. Tidak adanya pita menunjukkan tidak adanya DNA pada sumuran yang

ada dalam gel elektroforesis.

Pada saat diberi etanol absolut baru tampak adanya benang-benang

berwarna putih seperti kabut. Dugaan awal yang muncul adalah bahwa benang-

benang tersebut merupakan DNA, karena DNA dapat terpresipitasi di dalam

alcohol absolute dingin. Namun ternyat setelah dilakukan elektroforesis ternyata

tidak muncul pita-pita DNA. Berarti kemungkinan yang muncul sebagai benang

ketika diberi Etanol bukan DNA melainkan pengotornya saja.

Keberadaan DNA seharusnya ditunjukkan dengan adanya band atau pita

berwarna putih ketika gel disinari dengan sinar ultraviolet. Pada gel dapat muncul

warna putih karena DNA telah berikatan dengan EtBr, dan EtBr memiliki sifat

dapat berpendar ketika disinari dengan sinar ultra violet.

H. Pembahasan

Hasil analisis data menunjukkan bahwa proses isolasi DNA berhasil

dilaksanakan. Keberhasilan ini dapat dilihat dari adanya terbentuknya pita-pita

DNA pada gel agarose ketika dilakukan pengamatan di gell doc.

Page 13: Isolasi DNA

Perpindahan molekul DNA dari medan listrik negatif ke arah positif terjadi

ketika DNA di running pada proses elektroforesis. Cara deteksi DNA dilakukan

dengan menggunakan media gel agarosa. Isolat DNA sebelum dimasukkan

ditambahkan bahan kimia berupa loading dye agar warnanya memudahkan

pemindaian. Sehingga terlihat sampai dimana DNA tersebut berjalan memintas

gel agarose.

Foto pada data diambil menggunakan kamera yang dibantu dengan

penyinaran Ultra Violet (UV). Namun pita DNA tidak muncul. Menurut

Prafitdhin (2009), tidak adanya pita DNA ini dapat diakibatkan oleh waktu

perendaman yang terlalu lama pada TBE 1X dengan alat elektroforesis, maka

DNA gagal berada di gel agarose. DNA terus menembus gel tersebut hingga

keluar dari gel. Akibatnya tidak ada satu pun garis cahaya yang muncul pada gel.

I. Diskusi

Fungsi kemikalia yang dipakai dalam kegiatan isolasi DNA

1. Tris-HCl: sebagai buffer elusion

2. EDTA: sebagai pengikat ion Mg2+ yang merupakan kofaktor enzim

endonuklease

3. NaCl: sebagai pengokat DNA, Na+ dapat mengikat DNA yang bermuatan

negatif

4. SDS: deterjen yang berfungsi untuk melisiskan membran sel karena mengikat

molekul lipid yang ada pada mebran sehingga membrane akan rusak.

5. Alkohol 96%: untuk mempresipitasi DNA

6. Alkohol 70% untuk mencuci DNA dari berbagai kemikalia yang mungkin

tersisa selama proses isolasi DNA

J. Daftar Rujukan

Isolasi DNA http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/

Page 14: Isolasi DNA

Suropeji. 2009. Isolasi DNA. (on line)

http://suropeji.com/isolasi-dna/#ixzz1g8uB6PgB. Diakses 13

Desember 2011.

Prafitdhin, Achmad. 2009. Isolasi DNA, Polymerase Chain reaction (PCR), dan

deteksi DNA melalui Elektroforesis. (on line) http://prafitdhin-

achmad.blogspot.com/2010/02/isolasi-dna-polymerase-chain-

reaction.html. diakses tanggal 16 Desember 20011.

ISOLASI DNA KERBAU

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Untuk memenuhi tugas terstruktur matakuliah Bioteknologi yang dibimbing oleh Dr.agr. M. Amin, S.Pd., M.Si., Dr. Ummie Lestari M.Si., dan

Dr. Endang Suarsini M.Ked

Page 15: Isolasi DNA

Disusun Oleh

Nur Ismirawati100341507516

Off B

UNIVERSITAS NEGERI MALANGPROGRAM PASCASARJANA

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGIDesember 2011