LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“ISOLASI DNA KASAR”

Disusun Oleh:

Nama : Amilia Wahyu Agustin

NIM : 115040201111324

Kelompok : Selasa, 11.00

Asisten : Husnul Khotimah

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangPerkembangan ilmu biologi molekuler di dunia begitu

pesat,hal ini dipengaruhi oleh perubahan pola fikir dan keadaan wilayah sehingga banyaknya ilmu-ilmu yang mempelajari bagaimana memaksimalkan DNA dan mempelajari perubahan DNA (genetik) karena perubahan lingkungan maupun karena hal lainnya. Sehingga berbagai pihak harus bisa mengerti dan paham akan fenomena ini,salah satunya para pemulia tanaman di Indonesia.

DNA merupakan pembawa informasi genetik yang akan diturunkan kepada generasi penerusnya (Anonim, 2012), sehingga dengan memodifikasi informasi ini akan menghasilkan generasi baru yang bisa bersaing dan mendapatkan keuntungan berlimpah,baik dari segi budaya maupun ekonomi serta sosial. Sehingga ilmu ini sangatlah bermanfaat bagi umat manusia, khususnya dunia pertanian.  Dan ilmu dasar yang harus dimiliki untuk bisa mengolah data genetik yaitu harus mengetahui dan memahami teknik Isolasi DNA.

Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Maka dari itu penting bagi mahasiswa untuk mempelajari teknik yang sudah sangat umum ini.

1.2 TujuanUntuk mengetahui jenis detergen yang mempunyai daya

rusak paling tinggi dalam merusak membran sel.

1.3 ManfaatMahasiswa mengetahui teknik isolasi DNA dan

mangetahui zat yang paling efektif untuk melisis atau merusak membran sel.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Isolasi DNA

DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive.

“Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama.”

(Listanto,1996)

Isolasi (DNA) adalah proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung pada sumber, usia, dan ukuran sampel.

(Anonimb, 2012)

2.2 Macam-macam Metode Isolasi DNA

1. Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) dengan Nitrogen Cair

Metode IDaun temulawak sebanyak 1 gram digerus dengan PVP

dannitrogen cair hingga menjadi tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL 2-merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55 C, kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5 menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Pelet dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol 76% dan ammonium asetat). Sentrifugasi dilakukan pada

kecepatan 14000 g selama 10 menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan molecular water. Proteinase K ditambahkan dengan dua variasi penambahan.

2. Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) tanpa Nitrogen Cair

Metode IISampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus dengan PVP

dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan dengan incubator shaker pada suhu 65°C dengan 50 rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk proses cooling. Sampel ditambahkan 0.75 mL kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali. Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Pelet yang telah kering diberi 25 μL molecular water dan disimpan pada suhu -20°C.

3. Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995) Metode III

Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5), 50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%) sebanyak 400 μL dalam mortar dingin. Sampel ditambahkan 100 μL buffer ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan 400 μL kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4C. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800 μL etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -

20oC selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu 4C. Endapan berupa pellet DNAditambahkan 500 μL Etanol 70% dan disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 μL molecular water dan ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan selama 5 menit. Pellet kering ditambahkan 50 μL molecular water. Suspensi tersebut disimpan pada suhu -20oC.

Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik. Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan variasi penambahan larutan pada tahap yang berbeda.

(Utami, 2012)

2.3 Tahapan Isolasi DNA Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih

dahulu dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote.

Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide).

Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA tertentu, DNA genom kemudian dipotong dengan menggunakan enzin endonuclease restriksi, enzim ini enzim

yang dapat memotong molekul DNA di bagian tertentu. Hasil potongan dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujung-ujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong oleh enzim.

Selain dengan menggunkan enzin endonuclease restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong secara mekanis, misalnya menggunakan alat sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis adalah molekul DNA yang ujungnya tidak beraturan.

(Yuwono,2006)

2.4 Manfaat Isolasi DNA

Ada sejumlah tujuan dari isolasi DNA, antara lain:- Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel

- Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern

- Isolasi DNA genomik dalam rangka  pembuatan pustaka genomic

- Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA

- Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR

Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut:- Kemurnian

- Panjang DNA

- Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim

- Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung

Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai.

(Mustahib, 2009)

BAB IIIMETODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan3.1.1 Alat- Mortar + pistil : menghaluskan bahan- Tabung reaksi : wadah bahan yang sudah di haluskan dan

mengamati reaksinya- Spatula : Untuk mengaduk dan mengambil pasta sampel,

detergen dan garam- Beaker glass : tempat mencampur detergen, garam,

ekstrak buah mangga serta alcohol- Gelas ukur : mengukur volume larutan yang digunakan

(alkohol)- Pipet : mengambil larutan- Pisau : memotong bahan menjadi lebih kecil agar

mempermudah dalam menghaluskannya- Timbangan analitik : mengukur massa bahan- Cawan kecil (3 buah): wadah garam dan detergen- Rak tabung reaksi : meletakkan tabung reaksi

3.1.2 Bahan- Buah mangga matang : Sebagai sampel yang akan diamati

DNAnya- Aquades : Untuk melarutkan detergen dan garam- Garam (2,5 gr) : untuk menghilangkan protein dan

karbohidrat dengan cara presipitasi- Alkohol dingin : untuk mengikat strand DNA yang

telah terkumpul- Deterjen (@2,5 gr) krim, bubuk, dan cair : untuk merusak

dinding sel dan meluruhkan DNA

3.2 Langkah Kerja

Ambil @5 gr/ prlkuan

Tambahkan 2,5 gr deterjen

Tambahkan 2,5 gr garam

Haluskan dengan mortar

Tambahkan aquades 50 ml

Aduk hingga homogen

Diamkan 15 menit

Ekstrak bahan

Amati sampai muncul gumpalan di permukaan selama 10 menit

Ambil 5 ml dengan pipet

+ Alkohol dingin 0,6 ml

Buah mangga

Masukkan ke dalam beaker glass

Masukkan ke dalam tabung reaksi

3.3 Analisa Perlakuan

Pasta daun dimasukkan kedalam gelas ukur yang berisi aquades sebanyak 50 ml., lalu tambahkan garam 2,5 gram. Adapun fungsi dari penambahan garam yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dengan cara presipitasi. Penambahan garam juga dpat

digunakan untuk melarutkan DAN, karena ion Na+ yang diakndung oleh garam mampu memblikir dengan kutub n e g a t i f f o s f a t D N A . D a l a m h a l i n i p e n a m b a h a n g a r a m b i s a d i k a t a k a n d a p a t membantu dalam hal

pemekatan DNA. Setiap langkah diatas dilakukan sebanyak 3 kali sehingga

pembuatan pasta terdapat 3 tabung reaksi. Pada botol pertama tambahkanlah deterjen bubuk, botol kedua di tambahkan deterjen krim, serta botol ketiga ditambahkan dengan deterjen cair, masing-masing sebanyak 2,5 gram. Fungsi dari penambahan deterjen yaitu untuk melisiskan barier sel secar  kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel. Diadauk sampai rata hingga homogen lalu diamkan selama 15 menit agar lebih homogen.

Kemudian dari hasil tadi dan di masukkan ke dalan tabung reaksi menggunakan pipet masing-masing sebanyak sebanyak 5 ml dan ditambahi dengan alkohol dingin 0,6 ml untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai  benang benang putih yang terapung diatas filtrat. Alkohol yang ditambahkan dalam keadaan dingin, karena pada alkohol yang dingin dapat membantu mempercepat proses mempertifikasi DNA. Selain itu, konsentrasi DNA yang akan terikat oleh alkohol tersebut akan semakin pekat lalu tunggu 10 menit agar proses penggumpalan DNA berjalan optimal lalu amati hasilnya.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.2 PembahasanDari gambar di atas dapat kita lihat deterjen yang paling

banyak menampakkan benang-benang putih adalah detergen bubuk, kemudian disusul deterjen krim, dan yang paling sedikit menampakkan benang-benang putih adalah detergen cair. Hal ini dikarenakan bahan pembuat deterjen bubuk lebih keras, artinya konsentrasinya tinggi sehingga mempunyai daya rusak yang besar dibandingkan dengan deterjen krim atau pun cair.

Menurut literatur yang didapat pada suatu jurnal penellitian, larutan deterjen berfungsi menurunkan tegangan permukaan cairan dan melarutkan lipid sehingga membran sel mengalami degradasi, dan organel-organel di dalamnya dapat keluar dari sel.

BAB VPENUTUP

4.3 Kesimpulan Jenis deterjen yang digunakan untuk isolasi DNA sangat berpengaruh tehadap hasil yang ditunjukkan dari segi jumlah benang putih yang tampak dan juga cepat tidaknya benang putih tersebut tampak.

Deterjen yang berbentuk bubuk mempunyai pengaruh yang paling besar terhadap hasil yang ditunjukkan dari isolasi DNA karena terlihat benang putih paling banyak, jelas dan muncul dengan cepat.

4.4 Saran- Untuk praktikumPerlu pembaharuan beberapa alat praktikum, seperti pipet- Untuk asitenPraktikum tanpa asisten yang jelas membuat praktikan kebingungan, tetapi seru juga. :D

DAFTAR PUSTAKA

Anonima.2012.Isolasi DNA.http://asris07.student.ipb.ac.id/ 2010/06/19/isolasi-dna/ diakses 6 Desember 2012

Anonimb.2012.DNA isolation methods.http://www.enotes.com/dna-isolation-methods-reference/dna-isolation-methods. Full copy right World of Forensic Science, ©2006 Gale Cengage. All Rights Reserved.diakses 4 Desember 2012

Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k.1996.Metode Sederhana Isolasi DNA dari Tanaman Jagung Transgenik untuk Polymerase Chain Reaction.Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnology. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor

Mustahib.2009.Isolasi DNA.http://biologi.blogsome.com/2009/ 11/02/isolasi-dna/ diakses 6 Desember 2012

Utami, Annisa; Riani Meryalita; Nur Aeny Prihatin; Laksmi Ambarsari; Popi Asri Kurniatin; Waras Nurcholis.2012. Variasi Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa.Surabaya

Yuwono, Triwibowo.2006.Bioteknolgi Pertanian.Gadjah Mada University Press.Yogyakarta