TUGAS BIOTEKNOLOGI

Dyah Kesuma Ramadhani

06111009014

1. Apa kelebihan dari Agrobacterium tumafaciens sehingga bisa menyelipkan DNA/ gen asing

ke organisme lainnya dan bagaimana mekanismenya?

JAWAB

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan

untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman

transgenik. Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui

bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall

tumor). Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar

yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini

pada tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor, A. tumefaciens harus menempel

terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang

akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai sel tanaman. Selain tanaman dikotiledon,

tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum, dan tebu telah digunakan untuk

memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang

terinfeksi Crown Gall. Tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang pertumbuhannya

tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara tanaman-tanaman yang rentan dengan

strain virulen Agrobacterium tumefaciens.

Gb. 1 Tumor Crown Gall yang disebabkan oleh Agrobacterium tumafaciens

Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui media vector A.

tumefaciens paling sering digunakan untuk metransformasi tanaman, terutama tanaman

kelompok dikotil. Bakteri ini mampu mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui

eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf disc ) atau bagain lain dari jaringan tanaman

yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi.

Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing ). Segmen spesifik DNA plasmid

Ti disebut T-DNA (transfer DNA ) yang berpindah dari bakteri ke inti sel tanaman dan

berintegrasi kedalam genom tanamn. Karena A. tumefaciens merupakan patogen tanaman

maka Agrobacterium sebagai vektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah

bakteri dari jenis plasmid Ti yang dilucuti virulensinya (disarmed), sehingga sel tanaman yang

ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang mampu beregenerasi akan membentuk suatu

tanaman sehat hasil rekayasa genetik. Teknik transformasi melalui media vektor

Agrobacterium pada tanaman dikotil telah berhasil dengan baik tetapi sebaliknya tidak

umum digunakan pada tanaman monokotil. Namun beberapa peneliti telah melaporkan

bahwa beberapa strain Agrobacterium berhasil metransformasi tanaman monokotil seperti

jagung dan padi.

Dasar dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah transfer dan integrasi T-DNA ke

dalam genom di dalam inti sel tanaman. T-DNA adalah suatu bagian pada tumor inducing (Ti)

plasmid yang terdapat di dalam sel Agrobacterium. Ti-plasmid berukuran sekitar 200-800

kbp dan T-region (T-DNA)nya sendiri berukuran sekitar 10% nya (10-30 kbp). T-region ini

dibatasi oleh dua sekuen pembatas (border) yaitu right border dan left border yang

mengapit T-region. Bagian lain dari Ti-plasmid yang tidak kalah pentingnya adalah vir-region

yang mengandung sejumlah gen-gen virulen (virA, virB, virC, virD, virE, virF,virG dan virH)

yang berfungsi didalam proses transfer T-DNA ke dalam sel tanaman.

Gb. 2 Daerah virulensi pada Ti plasmid

Proses transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacterium pada sel tanaman. Kejadian

awal ini dimediasi oleh gen-gen yang berlokasi pada kromosom bakteri (gen chvA, chvB dan

att). Langkah berikutnya adalah terinduksinya gen-gen pada vir-region oleh suatu signal

yang spesifik didalam sel bakteri sehingga dihasilkan produk dari expresi gen-gen virulen

untuk memproses T-DNA dan mentransfernya dari dalam sel bakteri. Prosesing dan transfer

T-DNA dimediasi oleh berbagai protein yang dikode pembentukannya oleh gen-gen virulen.

Prosesing T-DNA dimulai dari suatu kejadian memproduksi T-DNA untai tunggal yang disebut

T-strand yang ditransfer ke dalam sel tanaman. Kejadian ini dimediasi oleh produk dari

genvirD1 dan virD2 yang berfungsi memotong T-DNA di bagian left border dan right border.

Salah satu produk yaitu molekul VirD2 tetap melekat secara kovalen pada 5’ end dari T-

strand dan membentuk apa yang disebut T-complex yang masih setengah jadi. Pembentukan

T-complex ini dilaporkan berfungsi untuk menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju inti

sel tanaman inang. Tahap akhir dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah

integrasi T-DNA ke dalam genom sel tanaman inang.

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah yang dapat menyebabkan penyakit tumor

pada beberapa tanaman. Bakteri menginfeksi melalui bagian yang luka pada batang

tanaman dan mengakibatkan tumor pada daerah sekitar akar dan batang tanaman.

Penyebab pembentukan tumor bukan berasal dari bakteri itu sendiri tetapi dari plasmid

yang dikenal dengan plasmid Ti. Ukuran DNA plasmid Ti cukup besar, berkisar antara 140-

235 kb (1 kb = 1000 pasang basa). Selama menginfeksi, sebagian kecil dari DNA plasmid Ti

Gb. 3 Tahapan dasar pada proses transformasi oleh Agrobacterium tumafaciens

(15-30 kb), disebut T-DNA, ditransfer kedalam inti sel tanaman dan tersisipi kedalam DNA

inti sel tanaman. Dari sini T-DNA sudah terintegrasi dan stabil terpelihara dalam genom sel.

T-DNA membawa gen yang bertangung jawab terhadap pembentukan tumor dan sintesa

asam amino yang dikenal sebagai opine. Gen-gen yang bertanggungjawab untuk transfer T-

DNA juga terdapat dalam plasmid Ti yang disebut gen-gen virulen (gen vir). Infeksi

Agrobakterium memerlukan jaringan tanaman yang luka karena gen vir dapat terinduksi

oleh senyawa fenolik yang dilepaskan ole sel-sel tanaman yang terluka.

Daerah ini merupakan potongan DNA berukuran relatif pendek berisi urutan 25 pasang basa

yang berulang. Setiap potongan DNA yang tersisipi diantara kedua batas T-DNA akan

ditransfer dan diintegrasikan kedalam genom tanaman. Oleh karena itu plasmid Ti

merupakan vektor yang sangat cocok untuk mengintroduksi gen-gen asing ke dalam sel

tanaman.

2. Jelaskan mekanisme buatan lainnya dari teknik DNA rekombinan!

JAWAB

1. TEKNIK PLASMID/ Membuat insulin dengan bantuan E. coli

Plasmid adalah gen yang melingkar tepat pada sel bakteri, tak terikat pada kromosom.

Teknik plasmid adalah penggunaan plasmid sebagai vektor dalam teknologi DNA

rekombinan, misalnya pada bakteri penghasil insulin.

Gb. 4 Mekanisme penyisipan Agrobacterium tumafaciens untuk menghasilkan tanaman transgenik

Insulin adalah hormon yang mengubah glukosa menjadi glikogen, dan berfungsi

mengatur kadar gula darah bersama hormon glukagon. Kekurangan insulin karena cacat

genetik pada pankreas, menyebabkan seseorang menderita diabetes melitus (kencing

manis) yang berdampak sangat luas terhadap kesehatan, mulai kebutaan hingga

impotensi.

Sebelum ditemukan teknik sintesis insulin, hormon ini hanya bisa diperoleh dari

ekstraksi pankreas babi atau sapi, dan sangat sedikit insulin bisa diperoleh. Setelah

ditemukan teknik sintesis insulin di bidang bioteknologi inilah, harga insulin bisa ditekan

dengan sangat drastis sehingga bisa membantu para penderita diabetes melitus.

Pada proses pembuatan insulin ini, langkah pertama adalah mengisolasi plasmid dari E.

coli. Plasmid adalah salah satu bahan genetik bakteri yang berupa untaian DNA

berbentuk lingkaran kecil. Selain plasmid, bakteri juga memiliki kromosom. Keunikan

plasmid ini adalah: ia bisa keluar-masuk ‘tubuh’ bakteri, dan bahkan sering

dipertukarkan antar bakteri. Langkah kedua, plasmid yang telah diisolir dipotong pada

segmen tertentu menggunakan enzim restriksi endonuklease. Sementara itu DNA yang

di isolasi dari sel pankreas dipotong pada suatu segmen untuk mengambil segmen

pengkode insulin. Pemotongan dilakukan dengan enzim yang sama. DNA kode insulin

tersebut disambungkan pada plasmid menggunakan bantuan enzim DNA ligase. Hasilnya

adalah kombinasi DNA kode insulin dengan plasmid bakteri yang disebut DNA

rekombinan.

Selanjutnya, DNA rekombinan yang terbentuk disisipkan kembali ke sel bakteri. Bila

bakteri E. coli berbiak, maka akan dihasilkan koloni bakteri yang memiliki DNA

rekombinan. Setelah tumbuh membentuk koloni, bakteri yang mengandung DNA

rekombinan diidentifikasi menggunakan probe. Probe adalah rantai RNA atau rantai

tunggal DNA yang diberi label bahan radioaktif atau bahan fluorescent dan dapat

berpasangan dengan basa nitrogen tertentu dari DNA rekombinan. Pada langkah

pembuatan insulin ini probe yang digunakan adalah ARNd dari gen pengkode insulin

pankreas manusia. Untuk memilih koloni bakteri mana yang mengandung DNA

rekombinan, caranya adalah menempatkan bakteri pada kertas filter lalu disinari dengan

ultraviolet. Bakteri yang memiliki DNA rekombinan dan telah diberi probe akan tampak

bersinar. Nah, bakteri yang bersinar inilah yang kemudian diisolasi untuk membuat

strain murni DNA rekombinan. Dalam metabolismenya, bakteri ini akan memproduksi

hormon insulin.

2. TEKNIK HIBRIDOMA/ Pembuatan Antibodimonoklonal dari sel kanker dan sel limfosit

Teknik hibridoma adalah teknik pembuatan sel yang dihasilkan dari fusi antara sel B

limfosit dengan sel kanker. Sifat dari sel hibridoma ini adalah imortal. Dalam percobaan

yang umum dilakukan, proses pembuatan sel hibridoma dilakukan dengan

menggunakan sel mieloma NS-1 dan sel limpa dari mencit.

Proses pembuatan dari sel hibridoma :

a. proses imunisasi dengan menggunakan antigen tertentu yang disuntikan ke

dalam tubuh mencit (Mus musculus)*

b. sel B-limfosit mencit akan merespon antigen sehingga terbentuk antibodi .

c. pemisahan sel B-limfosit yang sudah mengandung antibodi dari organ limpa

mencit

d. sel B-limfosit kemudian difusikan dengan sel kanker immortal menghasilkan

sel hibridoma

e. fusi sel hibridoma ini dilakukan dengan membuat membran sel menjadi

lebih permeabel sehingga kedua sel bisa menyatu

f. sel hibridoma kemudian diklon pada kultur sel sehingga dihasilkan banyak sel

yang memiliki anti bodi tertentu sehingga dikenal dengan antibodi monoklonal

yang bisa disimpan lama dalam keadaan dibekukan

GB. 5 Teknik hibridoma menggunakan mencit

3. TERAPI GENETIK

Terapi gen adalah suatu teknik terapi yang digunakan untuk memperbaiki gen-gen

mutan (abnormal/cacat) yang bertanggung jawab terhadap terjadinya suatu penyakit.

Pada awalnya, terapi gen diciptakan untuk mengobati penyakit keturunan (genetik) yang

terjadi karena mutasi pada satu gen, seperti penyakit fibrosis sistik. Penggunaan terapi

gen pada penyakit tersebut dilakukan dengan memasukkan gen normal yang spesifik ke

dalam sel yang memiliki gen mutan. Terapi gen kemudian berkembang untuk mengobati

penyakit yang terjadi karena mutasi di banyak gen, seperti kanker. Selain memasukkan

gen normal ke dalam sel mutan, mekanisme terapi gen lain yang dapat digunakan adalah

melakukan rekombinasi homolog untuk melenyapkan gen abnormal dengan gen normal,

mencegah ekspresi gen abnormal melalui teknik peredaman gen, dan melakukan mutasi

balik selektif sehingga gen abnormal dapat berfungsi normal kembali.

4. KLONING

Kloning adalah penggunaan sel somatik makhluk hidup multiseluler untuk membuat satu

atau lebih individu dengan materi genetik yang sama atau identik.

Ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai berikut :

a. Suatu frakmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada

molekul DNA sirkular yang di sebut sektor untuk menghasilkan chimoera atau

molekul DNA rekombiner.

b. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk kedalam sel tuan

rumah (host) yang biasanya berupa bakteri, walaaupun sel-sel jenis lain dapat di

gunakan.

Gb. 6 Terapi gen

c. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau

turunan yang identik, baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya.

d. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi diwariskan pada

progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya.

e. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau

klonsel host yang identik

f. Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA

rekombinasi dengan demikian dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul

rekombinasi telah diklon.

GB. 7 Kloning pada domba dolly