BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman jagung merupakan salah satu jenis tanaman pangan biji-bijian dari

keluarga rumput-rumputan. Berasal dari Amerika yang tersebar ke Asia dan Afrika

melalui kegiatan bisnis orang-orang Eropa ke Amerika. Sekitar abad ke-16 orang

Portugal menyebarluaskannya ke Asia termasuk Indonesia. Orang Belanda

menamakannya mais dan orang Inggris menamakannya corn (saenong et all , 1988)

Jagung merupakan salah satu serealia yang strategis dan bernilai ekonomi

serta mempunyai peluang untuk dikembangkan karena kedudukannya sebagai

s`umber utama karbohidrat dan protein setelah beras (Purwanto, 2008). Namun,

upaya peningkatan produksi jagung masih menghadapi berbagai masalah sehingga

produksi jagung dalam negeri belum mampu mencukupi kebutuhan nasional

(Soerjandono, 2008). Satu tanaman berumur 80 – 150 hari. Paruh pertama dari siklus

merupakan tahap pertumbuhan vegetatif, dan paruh kedua untuk tahap pertumbuhan

generatif. Tinggi tanaman jagung sangat bervariasi. Memiliki ketinggian rata-rata

antara 1 meter sampai 3 meter, namun ada varietas yang dapat mencapai tinggi 6

meter. Tinggi tanaman bisa diukur dari permukaan tanah hingga ruas teratas sebelum

bunga jantan (Suprapto,2011).

Keragaman genetik tanaman merupakan salah satu upaya untuk mendukung

pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat diketahui melalui beberapa penanda,

antara lain dengan pola pita DNA (Lamadji,1998), yang sering disebut sebagai

penanda dalam molekuler. Penanda molekuler berperan penting dalam konservasi dan

pengelolaan sumber daya genetic tanaman (Karp et al. 1997).

Perkembangan biologi molekuler yang pesat sejak akhir abad ke-20 ikut

mendukung berkembangnya penelitian-penelitian di bidang biologi termasuk

1

biodiversitas dan sistematika tumbuhan. Penggunaan penanda molekuler.

Penggunaan penanda molekuler memiliki beberapa keuntungan, yaitu hasil yang

konsisten dan dapat dideteksi pada semua jenis jaringan dengan berbagai tahap

perkembangan, serta tidak dipengaruhi oleh kondisi lingkungan (Mondini et al.

2009).

DNA berkualitas tinggi yang diperoleh melalui proses ekstraksi merupakan

satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam

penandaan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB)

merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman yang

banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (Jose dan Usha, 2000).

Tahapan dalam proses analisis keragaman genetik yaitu isolasi DNA genom,

pemurnian dan penetapan kualitas dan kuantitas DNA, seleksi primer, dan analisis

polimorfisme (Dwiatmini et al., 2003).

Tahapan dalam proses analisis keragaman genetik yaitu isolasi DNA genom,

pemurnian dan penetapan kualitas dan kuantitas DNA, seleksi primer, dan analisis

polimorfisme (Dwiatmini et al., 2003).

Isolasi DNA tanaman dan amplifikasinya menggunakan primer acak telah

banyak dikembangkan, namun tidak setiap prosedur dapat diamplifikasi pada setiap

spesies tanaman sekalipun memiliki hubungan kekerabatan yang dekat (genus yang

sama) (Padmalatha dan Prasaad, 2006).

1.2 Tujuan dan Manfaat

Tujuan dilakukannya magang ini yaitu untuk mengetahui dan memahami

prosedur ekstraksi DNA jagung bersari bebas..

Manfaatnya yaitu dapat memahami isolasi DNA dan mengetahui manfaat dari

penggunaan DNA.

2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Karakterisasi Jagung secara umum

Jagung (Zea mays L) ialah salah satu tanaman pangan dunia yang

terpenting, selain gandum dan padi. Jagung dimanfaatkan sebagai sumber

karbohidrat utama di Amerika Tengah, juga bagi beberapa daerah di Indonesia.

Di Indonesia pemanfaatan jagung tidak hanya terbatas sebagai sumber pangan

utama saja namun juga telah dimanfaatkan untuk pakan unggas. Menurut

Tangendjaja (2007), jagung ialah bahan baku utama pakan unggas (sekitar 50%

dari ransum. Berdasarkan Angka Ramalan I (ARAM I) dimana produksi jagung

pada tahun 2013 diperkirakan sebesar 18,84 juta ton pipilan kering atau turun

sebesar 2,83 persen dibanding tahun 2012 (BPS, 2013).

Berdasarkan informasi tersebut, maka peningkatan produktivitas jagung pakan

sangat perlu dilakukan, mengingat masih terdapat beberapa kendala yang masih

menghambat produktivitas tanaman jagung itu sendiri baik dari pengaruh

lingkungan maupun secara genetik. Upaya peningkatan produktivitas yang dapat

dilakukan yaitu melalui salah satu program pemuliaan tanaman dengan perakitan

varietas jagung yang unggul. Upaya mendapatkan varietas jagung unggul yang

spesifik sesuai keinginan pengguna diperlukan dukungan ketersediaan plasma

nutfah yang informatif diantaranya melalui kegiatan karakterisasi. Adapun pada

kegiatan penelitian kali ini ada 4 populasi jagung yang di gunakan yaitu Lamuru ,

Bisma , Srikandi kuning , dan Srikandi putih . Adapun varietas varietas jagung

yang diteliti pada penelitian kali ini adalah : Varietas Bisma , Varietas Lamuru ,

Varietas srikandi putih , Varietas Srikandi kuning .

3

2.2 Isolasi DNA

Biologi Sel dan Molekuler merupakan bidang ilmu yang terus menerus

berkembang. Ilmu ini bermanfaat hampir di semua bidang. Baik dalam bidang

medis untuk menangani kelainan-kelainan genetik dan penemuan obat-obat baru,

pada bidang pertanian, peternakan, kehutanan untuk meningkatkan produk-

produk baik tanaman maupun hewan unggul maupun di bidang lingkungan dalam

hal mengatasi polutan serta perannya dalam kemajuan produksi pangan.

Isolasi DNA merupakan teknik yang penting dalam pengembangan ilmu ini.

Derajat kemurnian dan kualitas dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil

yang akan diperoleh. Secara umum, prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasi

DNA mencakup tiga hal penting, yaitu harus bisa dihasilkan DNA dengan

kemurnian yang tinggi, DNAnya harus utuh, dan jumlahnya mencukupi

(konsentrasi tinggi) (Clark, 1997).

Isolasi DNA juga merupakan langkah pertama dalam studi sekuen DNA dari

populasi DNA kompleks dan dalam analisis struktur genom dan ekspresi gen.

Kuantitas, kualitas dan integritas DNA akan mempengaruhi hasil yang diperoleh

secara langsung (Surzycki,2000).

Dengan adanya teknik isolasi DNA yang lebih murah, mudah dan cepat,

serang dosen diharapkan dapat memberikan bekal ketrampilan kepada mahasiswa

mengenai suatu teknik dasar yang dapat digunakan untuk mengembangkan

sumber daya hayati negara kita yang sangat kaya, agar mahasiswa tersebut dapat

mulai berpikir obyektif dan benar dalam mengembangkan teknologi, sehingga

penelitian di bidang ini dapat berkembang.

2.3 Marka Mikrosatelit atau SSR

Mikrosatelit atau simple sequence repeat (SSR) adalah sekuens DNA yang

mengandung motiv pendek yang diulang secara tandem dengan ukuran biasanya

2-5 bp dan terdapat dalam jumlah banyak menyelimuti seluruh genom . Akhir

ini , mikrosatelit merupakan marka yang umum digunakan untuk pemetaan

4

genetic pada tanaman. Mikrosatelit berevolusi lebih cepat dibandingkan dengan

DNA disekitarnya yang menjadikannya sangat polimorfik yang menjadikannya

marka pilihan untuk spesies spesies yang memiliki tingkat polimorfisme rendah.

Mikrosatelit di amplifikasi melalui PCR dengan menggunakan pasangan primer

yang mengapit daerah berulang tertentu . sikuens nukleotida yang mengapit

bagian berulang ini digunakan untuk medisai pasangan primer tersebut.

Amplifikasi di visualisasikan melalui elektroforesis pada gel poliakrilamid .

Marka ini bersifat kodominan dan sangat reprodusibel . Beberapa keuntungan lain

dari teknologi marka ini adalah sederhana secara teknis, cepat dalam pelaksaaan ,

dan relative murah bisa di bandingkan dengan marka RFLP.

Hal yang harus dipertimbangkan dalam mengembangkan metode ini

adalah fragmen fragmen genom harus di klon dan di sekuense untuk

mengidentifikasi mikrosatelit yang memerlukan keahlian tehnis tinggi , waktu

dan biaya. Disamping itu , umumya teknologi ini memerluka gel dengan resolusi

yang tinggi untuk memisahkan prodak hasil amplifikasi .

5

BAB IIIMETODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini meliputi pengamatan di laboratorium yang berlangsung dari 28

Juli sampai 21 Agustus 2015 dan kegiatan ini dilaksanakan di laboratorium

Bologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai Penelitian dan pengembangan

Tananaman serelia , Maros , Sulawesi Selatan .

3.2 Bahan dan Alat

Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

3.2.1 Bahan

Adapun bahan yang digunakan adalah Sampel daun sebanyak 0,4 gram, buffer

ekstraksi CTAB, β-mercaptoethanol, chisam, isopropanol, ethanol 70%, TE

buffer, agarose, TBE 0,5x, aquades, TBE 10x, acrylamide, temet, APS, Marker

SSR dan sekuense nukleotidanya.

3.2.2 Alat

Alat alat yang di gunakan dalam penelitian ini yaitu mesin PCR (Polymerase

Chain Reaction ) , UV Transilluminator , oven/ Microwafe , Spektropotometer ,

Microcentrifugase, Water Bath (60°C) , perlengkapan electrophoresis Horizontal

dan Vertical , Vortex mixer , Alat alat yang di gunakan dalam penelitian ini yaitu

mesin PCR (Polymerase Chain Reaction ) , UV Transilluminator , oven/

Microwafe , Spektropotometer , Microcentrifugase, Water Bath (60°C) ,

perlengkapan electrophoresis Horizontal dan Vertical , Vortex mixer , Shaker ,

Hotplate , stirrer bar , Freezer , kulkas , timbangan , pipet tip steril (10µl , 20µl,

100 µl , 200µl ) dan tip steril masing masing pipet , tray/nampan , kamera ,

masker , botol semprot , box es , gunting , ember , gayung , lakban , alat tulis

menulis .

6

3.3 Prosedur isolasi DNA

Kegiatan penelitian ini terdiri atas beberapa tahapan kegiatan yaitu sebagai

berikut:

3.3.1 Penyiapan materi DNA

Menggunakan 4 sampel varietas yang diujikan yaitu varietas Bisma, varietas

Lamuru, Varietas Srikandi Putih dan Srikandi Kuning dan juga telah memiliki

kondisi benih jagung yang baik tentunya agar penampakan hasil dapat sesuai yang

diinginkan berdasarkan schedule yang telah dibuat sebelumnya. Adapun cara

penyiapan materi yang digunakan adalah sebagai berikut:

Bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah daun tanaman jagung

empat varietas yang telah berumur 10 – 15 hari setelah tanam. Untuk mendapatkan

daun tersebut, Benih jagung pulut dikecambahkan pada trey 30 x 50 cm dengan

terdapat 5 baris (5 tanaman/baris tiap varietas) menggunakan media tanah, pasir dan

pupuk kandang. Benih dipelihara hingga berkecambah dan tumbuh menjadi tanaman

jagung dan dengan menyiram pada saat media tanam terlihat kering. Setelah tanaman

berumur 10 – 15 hari, daun dari tiap tanaman diambil sebagai sampel dengan

memotong daun menjadi potongan – potongan kecil. Setiap tanaman yang telah

ditimbang sebanyak 0,4 gram per varietas dan dibuat cadangan dengan berat yang

sama kemudian dimasukkan ke dalam tube. Daun dari tiap dalam satu dijadikan satu

(bulk) dan disimpan dalam kantong. Kantong disimpan dalam frezzer -200C.

3.3.2 Isolasi DNA dari daun yang telah disediakan mengikuti protocol CIMMYT

yang telah dimodifikasi.

Bahan: Sampel daun sebanyak 0,4 gram, buffer ekstraksi CTAB,

β-mercaptoethanol, chisam, propanol, ethanol 70%, TE buffer.

Metode:

1. Sampel daun di gerus dengan menggunakan pestel yang telah diisi buffer

ekstraksi sebanyak 1,7 ml menggunakan mortar hingga halus

7

2. Hasil gerusan dimasukkan kedalam 2 tube 2 ml masing-masing setengah

volume dan setiap tube ditambahkan β-mercaptoethanol sebanyak 10 μl.

3. Tube dimasukkan kedalam waterbath suhu 600C selama 1 jam, setiap 15

menit tube digoyang-goyang agar mercaptoethanol tercampur secara merata.

4. Tube kemudian diangkat dan didinginkan dalam suhu ruang dan setiap tube

ditambah chisam sebanyak 700 μl.

5. Larutan didalam tube dihomogenkan menggunakan shaker selama 10 menit

dan setelah itu dimasukkan kedalam centrifuges dengan kecepatan 11600 rpm

selama 10 menit.

6. Supernatant akan terbentuk berupa larutan berwarna kuning yang kemudian

dipindahkan kedalam tube baru.

7. Isopropanol dingin ditambahkan sebanyak 700 μl untuk setiap tube berisi

supernatant.

8. Tube disimpan selama 24 jam di dalam frezzer suhu -200C.

9. Setelah 24 jam, tube diambil dan diputar-putar agar tebentuk untaian DNA

berupa berwarna putih.

10. Larutan selain DNA dikeluarkan dari tube sehingga hanya menyisakan DNA.

11. Pencucian DNA dilakukan dengan menggunakan 700 μl ethanol 70%

kedalam tube selama 10 menit. Prosedur ini diulang sebanyak 2 kali.

12. DNA dalam tube kemudian dikering anginkan.

13. TE buffer ditambahkan kedalam tube sebanyak 100 ml untuk setiap tube.

14. Tube diinkubasi didalam water bath pada suhu 600C selama 60 menit.

15. Tube kemudian dicentrifuge dengan kecepatan 70 rpm selama 10 menit.

3.3.3 Uji kuantitas dan kualitas DNA menggunakan alat nanodrop

nanoPhotometer IMPLEN.

Bahan : 3 μl DNA

Metode : DNA diteteskan diatas nanoPhotometer dengan volume 3-4 μl per sample.

NanoPhotometer secara otomatis akan menghasilkan data berupa konsentrasi DNA

8

(ng/mikroL) dan kemurnian DNA dalam optical dencity (OD) pada gelombang

cahaya 260/280. Kemurnian yang bagus untuk marka SSRs adalah OD 1,7 – 2 murni.

3.3.4 Uji kualitas DNA dengan Elektroforesis Horizontal

Bahan: agarosa dan TBE 0,5x.

Metode pembuatan gel agarosa: buat gel agarosa untuk wadah besar 25x25 cm TBE

0,5x 300 ml, dan agarosanya 3 gram. Masukkan kedua bahan tersebut dalam labu

erlemeyer, tutup dengan plastic atau aluminium foil dan masukkan kedalam

microwave selama 2 menit. Angkat bahan dan dinginkan dengan air mengalir hingga

agak dingin kemudian tuangkan kedalam wadah gel agarosa. Setelah gelnya sudah

dingin dan padat sisir-sisir wadah diangkat.

Metode uji kualitas dengan elektroforesisi horizontal:

1. Meneteskan loading dye pada kertas parafilm sebanyak sampel yang ada

dengan volume 4 µl menggunakan pipet mikro.

2. Mengambil masing-masing sampel sebanyak 4 µl dan dicampurkan pada

masing-masing titik loading dye.

3. Menyedot kembali loading dye yang sudah tercampur dengan DNA.

4. Mengisi pada sumur ke 5 gel agarosa, karena pada sumur 1 sampai 4 akan

diisi dengan lambda.

5. Setelah semua sampel seleseai dimasukkan kesumur, selanjutnya sambungkan

listrik dengan tegangan 100 volt selama 1 jam.

6. Gel agarosa hasil elektroforesis direndam pada larutan etidium bromide

selama 30 menit

7. Gel dicuci dengan aquades, kemudian diperiksa hasilnya dengan alat

transuliminator.

8. Memotret gambar, kemudian print out dan selanjutnya melakukan

perbandingan λ DNA , menghitung kuantitas DNA dan menghitung

pengenceran DNA.

9

3.3.5 Amplifikasi PCR

Amplifikasi PCR menggunakan 30 SSR primer yang dipilih berdasarkan

marker yang berasosiasi dengan karakter toleransi bulai yang diperoleh melalui

database genom jagung pulut. Prosedur amflifikasi PCR mengikuti George et al.

(2004).

Tabel 1: Cocktail PCR untuk 1x reaksi

No. Larutan stok Volume

1 GoTag®Green Master Mix (Biorad) 6,25

2 Primer 0,5

3 DNA 1

4 Nonapure (ddH2O) 2,25 2,25

Volume total 10

Metode :

1. DNA sebanyak 1 μl dimasukkan kedalam mikroplate PCR. DNA diletakkan

didasar mikroplate dan disimpan dalam es.

2. Hasil amplifikasi PCR dibuat dengan mencampurkan semua larutan stok

kedalam tabung mikrosentifuge sesuai dengan volume reaksi yang

dibutuhkan.

3. Hasil amplifikasi PCR sebanyak 9 μl dimasukkan kedalam mikroplate yang

sudah berisi DNA.

4. Diatas hasil amplifikasi PCR ditambahkan mineral oil satu tetes dan

mikroplate kemudian ditutup menggunakan aluminium foil atau selotip.

5. Mikroplate kemudian dimasukkan kedalam thermal cycle (mesin PCR) dan

PCR dilakukan dengan siklus PCR sebagai berikut:

Tabel 2. Siklus reaksi PCR

Step Reaksi Kondisi

1 Initial denaturation 94oC selama 2 menit

2 Denaturation 94oC selama 30 detik

10

3 Annealing 56oC selama 1 menit

4 Extension 72oC selama 1 menit

5 Cycling Kembali ke step 2, 29 kali

6 Final Extension 72oC selama 5 menit

7 Soak 4oC, α

6. Setelah siklus PCR selesai, mikroplate diambil dan disimpan pada suhu -20oC

atau 4oC dengan menggunakan dye.

3.3.6 Elektroforosis pita DNA berbasis 8% polyacrylamide Gel

Electrophoresis (PAGE) dan visualisasi pita DNA.

Pemisahan pita DNA hasil PCR dilakukan dengan elektroforesis

menggunakan PAGE 8% mengikuti protocol CIMMYT. Elektroforesis menggunakan

alat elektroforesis mini yaitu Dual Mini-Verticals complete system MGV-202-33.

Visualisasi fragmen-fragmen DNA yang terdeteksi dari proses elektroforesis

menggunakan teknik pewarnaan perak (silvertstaining) mengikuti George et al.

(2004)

Bahan: Bahan-bahan yang diperlukan untuk pembuatan PAGE 8% dan silverstaining

disajikan dalam table 4 dan 5.

Tabel 3. Bahan untuk pembuatan 8% Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)

dengan volume 500 ml dari konsentrasi stok 40%.

No Larutan Stok Volume

1 Acrrylamide 100

2 10x Tris-borate-EDTA (TBE) 50

3 ddH2O 350

Total Volume 500

Tabel 4: Bahan yang digunakan untuk gel elektroforesis

11

No Bahan Volume

1 8% PAGE 50 ml

2 Red Safe 5 μl/palte

3 N,N,N’,N’-tetrametil-etiled-diamin (TEMED) 50 μl

4 Ammonium persulfat (APS) 500 μl

Tabel 5: bahan untuk visualisasi pita DNA

No. Larutan Stok Volume

1 1 L Silverstining

Silvernitrat 1 gr

ddH2O 1 L

2 1 L NaOH

NaOH 20 gr

Formaldehid 3 μl

ddH2O 1 L

\ Eklektroforesis berbasis 8% PAGE

1. Persiapan gel elektroforesis (gel casting)

A. Plate elektroforesis dibersihkan dengan ethanol 95% menggunakan tisu

kimwipes. Prosedur ini diulang sebanyak tiga kali.

B. Gasket Gel wrap dikeringkan menggunakan tisu kimwipes hingga tidak ada

air yang menempel.

C. Gasket dipasang pada plate kaca

D. Kemudian spacer dipasang pada plate kaca

E. Plate kaca dirangkai dengan memasangkan pasangan plate pada plate kaca

yang sudah berisi spacer dan gasket.

F. Plate kaca lengkap kemudian dijepit menggunakan penjepit white spring

clamp

12

G. Gel elektroforesis dituang kedalam plate kaca yang sudah dirangkai melalui

dari bagian tengah plate menggunakan syringe

H. Sisir kemudian dimasukkan kedalam gel dan plete kemudian ditutup

menggunakan aluminium foil.

I. Gel didiamkan selama 20 menit atau sampai membeku. Setelah beku ambil

sisir dari dalam gel, sehingga terbentuk sumur-sumur gel.

2. Elektroforesis

a. Set plate diletakkan ke dalam buffer dengan plate yang lebih kecil

menghadap buffer reservoir atas.

b. Letakkan set plate dengan tempat plate menggunakan white clamp lebar (Cat.

# GPC-0001) dengan menjepitkan clamp 4 mm dibawah ujung reservoir atas.

c. Buffer TBE 1x kemudian dituang kedalam reservois atas dan bawah. Sumur-

sumur gel dibersihkan dengan menyemprotkan buffer yang terdapat pada

bagian atas gel menggunakan syringe.

d. Sampel elktroforesis berupa DNA hasil PCR dipanaskan dan kemudian

disimpan dalam es.

e. Sampel segera dimasukkan kedalam sumur-sumur gel sebanyak 4 μl

f. Setelah sampel selesai dimasukkan, power lead diletakkan pada elektroda

dibagian tutup buffer reservoir dipasang.

g. Power lead disambungkan ke power supply dan proses eletroforesis dimulai.

h. Elektroforesis dihentikan setelah satu jam atau dye berada ditengah-tengah

gel elektroforesisi. Pita DNA siap untuk diwarnai dan dilihat.

3.3.7 Hasil PCR

1. Plate kaca fragmen DNA dimasukkan kedalam tray yang berisi larutan

silverstaining sebanyak 1 L dan tray di shaker dengan kecepatan 70 rpm selama 5

menit.

2. Plate dipindahkan kedalam tray yang berisi 1 L ddH2O dan tray digoyangkan

dengan kecepatan 70 rpm selama 5 menit.

13

3. Plate kemudian dipindahkan kedalam tray yang berisi 1 L NaOH dan tray di

goyangkan dengan kecepatan 100 rpm selama 10 menit.

4. Plate dipindahkan kedalam tray yang berisi 1 ddH2O dan tray di goyangkan

dengan kecepatan 70 rpm selama 5 menit.

5. Pita DNA siap di foto dan diskoring.

14

BAB IVHASIL dan PEMBAHASAN

4.1 Kuantitas dan kualitas DNA berdasarkan Nanospektrometer

Menurut teori , sampel DNA yang dianggap cukup murni memiliki perbandingan

A260 / A280 (Purity) = 1,80 – 2,0. Menurut Sambrook et al. (1989), kisaran angka

tersebut telah memenuhi persyaratan yang dibutuhkan dalam analisis molekuler.

Tingkat tinggi rendahnya kemurnian dalam pengujian kuantitas DNA dengan

spektrofotometer dapat dipengaruhi pada saat pengambilan supernatant tidak

maksimal sehingga DNA genom banyak yang terbuang. Selain itu, tinggi rendahnya

nilai kemurnian yang dimiliki oleh DNA menunjukkan bahwa DNA tergolong masih

kotor. Dalam proses isolasi dan purifikasi DNA tanaman adalah terjadinya degradasi

DNA oleh enzim endonuklease, tingginya kandungan polisakarida, senyawa inhibitor

seperti polifenol dan metabolit sekunder lain yang dapat mengganggu reaksi

enzimatis (Padmalatha & Prasad, 2006).

Hasil pengecekan kualitas dan kuantitas dengan spektrofotometer pada grup A

konsentrasi DNA berkisar antara 158 ng/ul hingga 196,3 ng/ul . Konsentrasi sampel

tertinggi berada pada sampel L-A-16 yaitu 851 ng/ul . Dan konsentrasi sampel

terendah berada pada sampel L-A-21 158 ng/ul.

Adapun hasil pengecekan kualitas dan kuantitas dengan spektrofotometer

pada grop B konsentrasi DNAnya berkisar antara 142 ng/ul hingga 239 ng/ul .

Konsentrasi DNA tertinggi berada pada sampel L-B-11 yaitu 239ng/ul dan

konsentrasi sampel yang paling rendah berada pada sampel L-B-16 yaitu 142 ng/ul.

Hasil kuantifikasi dengan menghitung konsentrasi dan tingkat kemurnian

DNA menggunakan alat spektrofhotometer dapat dilihat pada tabel. 4 :

15

Tabel 5 Daftar Konsentrasi dan kemurnian STOCK DNA Lamuru 2015

Daftar Konsentrasi STOCK DNA Lamuru 2015

No. Sampel

Group A Group B

Konsentrasi DNA ng/ul

Purity(260/280)

Konsentrasi DNA ng/ul

Purity (260/280)

1 177 1,031 186 1,0352 177 1,055 211 1,2753 228 1,127 237 1,2144 208 1,024 201 0,9985 213 1,120 219 1,1256 222 1,043 204 1,1227  226  1,151 223  1,1068 201 0,986 196 0,9989 242 1,367 212 1,22610 851 0,920 210 0,93311 180 1,043 239 1,09812 220 1,069 207 1,08313 230 1,090 219  1,26614 217 1,270 212 1,28915 162 0,973 148 0,93516 196,3 1,252 200 0,99017 169 1,217 142 0,94218 203 1,097 201 1,34719 197 0,993 206 0,99820 208 1,074 196 1,03721 158 1,109 196 1,34422 225  1,381  193 1,10423 192 1,018 203 0,98924 208 1,046 228 1,08325 227 1,199 126 1,976

4.2 Kuantitas dan kualitas DNA hasil Elektroforesis Horizontal

Agarosa merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga merah. Gel

agarose dapat digunakan untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari 100 bp,

sedangkan untuk memisahkan DNA dengan ukran lebih pendek dapat digunakan gel

16

poliakrilamid. Gel agarose merupakan fase diam dalam pemisahan fragmen DNA dan

muatan listrik sebagai fase geraknya.

Adapun hasil elektroforesis gel agarosa setelah visualisasikan di

UVtransluminator menunjukkan kecerahan kecerahan masing masing DNA yang

dapat di bandingkan dengan menggunakan pembanding λ200 λ300 λ100 λ50.

Sehingga dapat diketahui pengenceran yang harus dilakukan untuk mencapai tahap

PCR.Bila dihubungkan dengan hasil table 1 , hasil table 1 seharusnya memiliki rasio

nilai yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan hasil visualisasi elektroforesis DNA

Lamuru akan tetapi hasil menunjukkan hal yang sebaliknya. Salah satu

kemungkinannya yaitu karena Lambda pada elektroforesis ini terlalu sering

digunakan sehingga hasil visualisasi DNA tidak sesuai dengan konsentrasi yang di

inginkan.

Setelah proses elektroforesis selesai lalu di amati di atas UV transimulator

dapat di peroleh hasil seperti gambar di bawah ( Gambar 1)

Gambar Ia. Stok DNA jagung Lamuru

17

Gambar Ib. DNA lamuru hasil pengenceran

Gambar III . Lanjutan elektroforesis Horizontal untuk perhitungan kuantitas

dan kualitas DNA

Gambar III a Stok DNA lamuru susulan

Gambar III b DNA Hasil Pengenceran Lamuru

Data di atas memiliki beberapa gambar yang terjadi menjadi Ia & Ib dan IIa & IIb ,

dikarenakan oleh sampel DNA pada gambar II baik A ataupun B di tidak tepat waktu panen .

Hal ini bisa saja dikarenakan oleh benih benihnya tidak memiliki kekuatan tumbuh yang tinggi

sehingga tidak dapat di panen tepat waktu atau bisa saja di karenakan oleh lingkungan di

18

sekitar benih menyebabkan benih tidak dapat tumbuh dan berkembang sesuai dengan

seharusnya.

4.3 Visualisasi pemisahan DNA hasil amplifikasi PCR

Visualisasi pemisahan DNA hasil amplifikasi PCR sebagai berikut :

Gambar 4 .Visualisasi hasil amplifikasi PCR menggunakan marka SSR phi233376

Gambar 5. Visualisasi hasil amplifikasi PCR menggunakan marka SSR phi093

Berdasarkan gambar ( Gambar 4 & Gambar 5 ) diatas menunjukkan bahwa seluruh

sampel DNA teramplifikasi dengan baik dan menunjukkan variasi gambar pita DNA

yang jelas dan beragam. Apabila di bandingkan dengan hasil pengenceran , ada

beberapa DNA yang memiliki konsentrasi yang tinggi adapun di antranya yaitu L-1,

L-14 , L-24 akan tetapi masih dapat teramplifikasi dengan baik dan memunculkan

visualisasi pita DNA yang bagus. Pada beberapa visualisasi pita DNA bervariasi ada

pita DNA yang tipis dan tebal , dikarenakan oleh beberapa hal seperti pada proses

pengisian DNA yang lebih ataupun kurang dari standar yang telah di tetapkan

sebelumnya sehingga visualisasi DNA tidak seragam.

Adapun hasil yang di peroleh dari perhitungan berat molekul ada beragam . Pada

visualisasi hasil amplifikasi PCR menggunakan marka SSR phi233376 ( Gambar 4 ) berkisar

antara 28 bp hingga 533,5 bp . Berat molekul yang tertinggi ialah 533,5 bp yang berada pada

marker g3 . Dan berat molekul terendah yaitu 28 bp yang berada pada marker I 2 . Adapun

rinciannya sebagai berikut G1 = 159.9 ; G2 = 186,6 ; G3 = 533,5 ; H =142.75 ; I1= 233,5 ; I2

= 28 .

19

Dan hasil yang diperoleh dari perhitungan berat molekul pada phi093 ( Gambar 5)

juga beragam . Berat molekul berkisar antara 266,71 bp hingga 451 bp . Berat molekul

tertinggi yaitu 266,71 bp pada marker E. Dan berat molekul terendah yaitu 451 bp berada pad

marker C . Adapun rinciannya ialah sebagai berikut : C = 451 bp ; D1 = 360,71 ; D2=

377,28 ; E = 266,71 bp . Data data tersebut menunjukkan karakter yang disandikan memiliki

variasi yang tinggi karena berasal dari tetua yang bersari bebas .

20

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dari proses isolasi DNA 25 individu varietas jagung lamuru bersari bebas dapat

disimpulkan hasil isolasi DNA, rata rata diperoleh DNA dengan kuantitas dan

kualitas yang cukup tinggi. Adapun dari hasil visualisasi dari proses amplifikasi PCR

ada beberapa DNA yang tidak murni karena mengandung kotoran kotoran seperti

protein. Hasil PCR menunjukkan dari 2 primer yang digunakan menampilkan gambar

pita DNA dengan heterozigositas yang tinggi dan juga letak posisi alel yang

bervariasi hal ini bisa menjadi bukti bahwa varietas jagung lamuru merupakan

varietas jagung yang bersari bebas.

21

UCAPAN TERIMA KASIH

Saya mengucapkan puji syukur kepada Tuhan YME , atas kesempatan dan kesehatan

yang diberikan untuk mengikuti kegiatan penelitian dan magang yang dilaksanakan di

Balai Penelitian Tanaman Serealia Maros. Kegiatan ini didanai oleh Balai Penelitian

Tanaman Serealia Maros. Ucapan terima kasih diberikan Kepada Dr. Marcia

B.Pabendon selaku Kepala Laboratorium Biologi Molekuler dan kak Tati , Kak

Karlina , Kak Edita , Kak Fristy selaku pendamping di Laboratorium, yang telah

sabar dalam membantu dan membimbing kami dalam kegitan magang ini sehingga

tujuan penelitian dan kegitan magang dapat tercapai. Dan terimakasih untuk segala

ilmu yang telah diberikan kepada kami , semoga ilmu yang telah Ibu dan kakak kakak

berikan dapat kami manfaatkan dengan sebaik baiknya.

22

Daftar Pustaka

Clark, M.S. (1997). Plant Molecular Biologi . Lab Fox. BIOS Scientific Publisher Limited. UK.

BPS. 2010-2013. Statistik Indonesia. Badan Pusat Statistik Indonesia.

Dwiatmini, K., Mattjik, N.A., Awidinnor, H., & Toruan-Matius, N.L. 2003. Analisis pengelompokan dan hubungan kekerabatan spesies anggrek Phalaenopsis berdasarkan kunci determinasi fenotipik dan marka molekuler RAPD. Jurnal Hortikultura, 3(1), 16-17

Devereux, R. & S.S. Wilkinson. 2004. Amplification of Ribosomal RNA Sequences. Kluwer Academic Publisher, Netherlands.

Karp A., S. Kresnovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. 1997. Moleculer tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. IPGR. Teechnical Bulletin no.2.

Khosravinia, H., H.N.N. Murthy, D.T. Parasad, & N. Pirany. 2007. Optimizing Factors Influencing DNA Extraction from Fresh Whole Avian Blood. African Journal of Biotechnology. 6 (4): 481-486.

Mondini, L., A. Noorani, M,A. and Pagnotta. 2009. Assesing Plant Genetic Diversity byMolecular Tools. Diversity. 2009(1): 19-35

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor.

Jose, J. and R. Usha. 2000. Extraction of geminiviral DNA from a highly mucilaginous plant (Abelmoschus esculentus). Plant Mol. Biol. Rep. 18: 349 - 355.

Padmalatha, K., M.N.V. Prasad. 2006. Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of selected medicinal and aromatic plants of conservation concern from Peninsular India. African J. Biotech. 5: 230-234.

Saenong, Sania. (1988). Teknologi Benih Jagung. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Bogor. Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian.

SAMBROOK, J. and D.W. RUSSEL. 1989. Molecular Cloning: ALaboratory Manual. New York: Cold-Spring Harbor Laboratory Press. 2nd edition 165p

23

Surzycki, S.(2000). Basic Techniques in Molecular Biology , Springer-Verlay, Berlin Heidelberg. Germany.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Toha, Abdul Hamid A. 2001. Biokimia Metabolisme Biomolekul. Bandung: Alfa

Beta.

Yunus, Muhammad, 2004 . Marka molekuler untuk perbaikan tanaman..

Makassar :Buku panduan laboratorium.

24