ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

BAB IPENDAHULUANA. Latar BelakangPemanfaatan mikroorganisme dalam bidang teknologi semakin banyak digunakan misalnya dalam menghasilkan berbagai produk seperti bahan pangan, industri, pertanian, obat-obatan, dan lain sebagainya. Pemilihan mikroorganisme secara maksimal perlu didukung oleh suatu metode isolasi dan identifikasi yang baik.Diketahui bahwa mikroba tersebar di alam, terdapat di lingkungan mana saja dalam populasi campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies tunggal di alam. Untuk mencirikan dan mengidentifikasikan suatu spesies mikroorganisme tertentu, pertama-tama spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni.Dalam mengisolasi suatu mikroorganisme, dilakukan denga cara yang aseptis untuk menghindari terjadinya kontaminasi degan mikroorganisme lain. Kebanyakan mikroorganisme dapat diisolasi da diinokulasi dalam biakan murni dengan memindahkan suatu koloni secara cermat, mensuspensikan kembali dalam cairan dan menanamnya kembali pada medium yang selektif. Isolasi dan inokulasi merupakan percobaan yang sangat penting, karena melihat kondisi lingkungan di sekitar kita yang banyak terdapat mikroorganisme baik yang pathogen maupun non patogen, sehingga pemisahan dan identifikasi bakteri yang saru dengan lainnya juga dibutuhkan. B. Tujuan PraktikumTujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni.C. Manfaat PraktikumMahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya dan memperoleh kultur murni.

BAB IITINJAUAN PUSTAKAA. Teori Umum Bakteri yang ditumbuhkan di laboratorium dalam sebuah larutan yang terdiri atas air, nutrien, dan sumber-sumber energi disebut sebagai suatu biakan atau kultur bakteri. Bakteri juga bisa ditumbuhkan dalam suatu kaldu (broth) atau medium kaldu cair atau pada medium yang dipadatkan dengan penambahan agar. Agar adalah suatu jenis karbohidrat kompleks yang diisolasi dari alga. Inokulasi bakteri ke atas permukaan agar disebut planting (disebar di atas plate). Jika sampel encer hasil dilusi dari suatu kultur disebar, masing-masing sel bakteri memproduksi dirinya sendiri menjadi kumpulan ribuan sel yang disebut koloni bakteri yang bisa dilihat dengan mata telanjang (Elrod & Stansfield,2002).Pertumbuhan mikroorganisme yang pada keadaan ideal sangat cepat, tiap organisme mengadakan reproduksi setiap 10-30 menit. Jika dilakukan pada suatu medium, pertumbuhan mikroorganisme terdiri atas beberapa fase yaitu : fase lag, merupakan fase adaptasi terhadap medium (lingkungan). Fase eksponensial (fase log) yaitu pertumbuhan cepat secara logaritma. Fase stasioner merupakan fase tetap, dalam fase ini tidak terjadi pertumbuhan mikroorganisme. Fase otolitik (fase kematian) pada fase ini pertumbuhan menurun secara logaritmis, disebabkan sel-sel mikroorganisme rusak oleh enzim-enzim yang dihasilkan sendiri (Makfoeld,dkk,2002).Setiap koloni atau galur mikroba yang akan diidentifikasi harus benar-benar murni dan untuk mendapatkan biakan murni digunakan media selektif yang memungkinkan untuk isolasi koloni mikroba tersangka berdasarkan pada karakter biokimia dari mikroba yang akan mempengaruhi sifat pertumbuhan bakteri pada suatu media spesifik. Identitas mikroba dapat dilihat dari pembentukan koloni yang spesifik pada media (Anonim,2008)Frekuensi isolasi bakteri aerob yang bersamaan dengan bakteri anaerob sering kali dikutip sebagai bukti bahwa bakteri anaerob hanya terdapat karena adanya bakteri aerob. Kebanyakan penelitian menunjukkan bahwa sedikitnya sepertiga sampai setengah jumlah infeksi yang melibatkan bakteri anaerob menghasilkan flora anaerob saja, sedangkan sisanya campuran dengan bakteri aerob (Muliawan,2007).Tahap penanaman sampel air yaitu dengan cara dalam penanaman sampel air ini yaitu sample air dihomogensikan dengan cara dikocok terlebih dahulu menggunakan vorteks, diambil sebanyak 1 ml dengat pipet ukur dan dimasukkan kedalam larutan trisalt secara aseptic. Untuk pengisolasian total bakteri, sample air diencerkan hingga 100 ml sedangkan untuk pengisolasian bakteri Vibrio sp., sampel air diencerkan hingga 10 ml. Setelah diencerkan, sebanyak 0,1 ml larutan dimasukkan ke dalam media kultur. Pengisolasian bakteri dilakukan secara aseptik dengan menerapkan metode sebar dimana setelah larutan dimasukkan ke dalam media, larutan tersebut disebar ratakan di permukaan media menggunakan spatula. Media kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dalam inkubator (Kharisma & Manan,2012).Metode pengenceran dilakukan dengan mengambil sebanyak 1 g sampel, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades sehingga didapat pengenceran 10-1, untuk mendapatkan pengenceran 10-2 dilakukan dengan mengambil 1 ml dari pengenceran 10-1 dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades, demikian seterusnya dilakukan seri pengenceran hingga 10-5. Pengenceran 10-4 dan 10-5 diambil 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi media TSA dan diratakan, kemudian diinkubasi dengan posisi cawan terbalik selama 24-48 jam pada temperatur 30oC.Setelah inkubasi selama 48 jam, dilakukan isolasi bakteri dengan metode goresan kuadran beberapa tahap hingga diperoleh 1 isolat yang murni. Isolat-isolat yang diperoleh kemudian diamati morfologi. Pengamatan pada morfologi koloni meliputi bentuk, tepian, elevasi dan warna koloni, sedangkan pengamatan morfologi sel meliputi uji pewarnaan Gram, bentuk sel dan uji motilitas (Safrida,dkk,2012).Salah satu contoh isolasi yaitu isolasi bakteri dari sampel makanan. Isolasi Enterobacteriaceae dari sampel makanan dilakukan menggunakan medium Eosin Methylen Blue Agar (EMB Agar), Salmonella Shigella Agar (SSA), dan Selenith Broth. Bakteri yang berhasil diisolasi kemudian diidentifikasi melalui serangkaian uji biokimia. Empat jenis isolasi kemudian dipilih untuk digunakan sebagai bakteri uji dalam uji hayati. Pada langkah kerja ini juga dilakukan penghitungan frekuensi ditemukannya bakteri yaitu dengan cara menghitung keberadaan bakteri pada setiap sampel makanan (Hidayati,dkk,2002).

B. Uraian Bahan1. Agar (Ditjen POM Edisi III, 1979)Nama resmi: AgarNama lain: Agar-agarPemerian: Tidak berbau atau bau lemah, berasa musilago pada lidahKelarutan: Tidak larut dalam air dingin, dan larut dalam air mendidihKegunaan: Sebagai bahan pemadat mediumPenyimpanan : Dalam wadah tertutup baik2. Pepton (Ditjen POM Edisi III, 1979)Nama resmi: PeptonNama lain: PeptonPemerian: Serbuk, kuning kemerahan sampai coklat, bau khas tidak bau Kelarutan: Larut dalam air, memberikan larutan berwarna coklat ke kuningan yang bereaksi asam.3. Beef Extract (Ditjen POM Edisi IV, 1995)Nama resmi: Beef extractNama lain: Kaldu nabati, kaldu hewani, ekstrak dagingPemerian: Berbau dan berasa pada lidah. Kaldu daging sapi konsentrat diperoleh dengan mengekstraksi daging sapi segar tanpa lemak, dengn cara merebus dalam air dan menguapkan kaldu pada suhu rendah dalam hampa udara sampai terbentuk residu kental berbentuk pasta. Massa berbentuk pasta, berwarna coklat kekuningan sampai coklat tua, bau dan rasa seperti daging, sedikit asam.Kelarutan: Larut dalam air dinginKegunaan: Sumber protein untuk pertumbuhan mikroorganismePenyimpanan: Simpan dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya4. Akuades (Ditjen POM Edisi III, 1979)Nama resmi : Akua destillataNama lain : Air sulingRM / BM : H2O / 18,02Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak berasaKegunaan : Sebagai sumber nutrien mikroba dan pelarut mediumPenyimpanan : Dalam wadah tertutup baik5. Dekstrosa (Ditjen POM Edisi IV, 1995)Nama resmi: DextrosumSinonim: Glukosa, dekstrosaRM / BM: C6H12O6/180,16Pemerian: Hablur tidak berwarna, serbuk halus atau butiran putih, tidak berbau, rasa manisKelarutan: Mudah larut dalam air, sangat mudah larut dalam air mendidih, agak sukar larut dalam etanol (95%) Kegunaan: Sebagai sumber nutrient yang spesifik untuk mikroba jamurPenyimpanan: Dalam wadah tertutup baikBAB IIIMETODE PERCOBAAN A. Waktu dan TempatPraktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, 23 Februari 2015 pada pukul 11.00 WITA dan bertempat di Laboratorium Mikrobiologi lantai II Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo, Kendari, Sulawesi Tenggara. B. Alat Dan Bahan1. AlatAlat yang digunakan dalam praktikum morfologi mikrroba adalah :Tabel.1. Alat-alat pada pewarnaan Gram dan SederhanaNo.Nama AlatFungsi

1.Tabung reaksiSebagai tempat dilakukan pengenceran dan sebagai media untuk meletakkan suspensi bakteri

2.Cawan petriSebagai media untuk meletakkan suspensi bakteri yang akan inkubasi

3.Pipet tetesUntuk meneteskan suspensi bakteri

5.Rak tabungSebagai tempat diletakkannya tabung reaksi

6. BunsenUntuk memijarkan jarum inokulum dan untuk memanaskan cawan petri

7.Jarum inokulumUntuk digoreskan pada bakteri yang telah diinkubasi dan akan dipindahkan pada media baru

8.ElektromantelUntuk memanaskan media

9. InkubatorUntuk menginkubasi bakteri yang telah ditanam

2. BahanBahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :Tabel.2. Bahan pada pewarnaan SederhanaNo.Nama AlatFungsi

1.Saos tomatSebagai sampel yang akan diuji

2.AkuadesSebagai bahan pelarut

3.AlkoholUntuk mensterilkan tangan dan tempat dilakukan isolasi

4.Media NA IkanSebagai tempat penanaman bakteri

C. Cara Kerja1. Pengenceran a. Diisi tabung reaksi dengan akuades. Dengan 10ml pada tabung satu dan 9 ml pada tabung dua sampai tabung sepuluh b. Dilarutkan saos dalam tabung satu yang berisi akuades 10 mlc. Dikocok hingga homogend. Dipipet 1 ml kedalam tabung dua yang berisi akuades 9 mle. Dikocok hingga homogenf. Diulangi perlakuan di atas sampai tabung ke sepuluh2. Penanaman dengan metode agar tabur ulasa. Diambil suspensi bakteri yang berasal dari tabung kesepuluh dari pengenceran sebanyak 0,1 mlb. Diteteskan pada media agar yang padatc. Diratakan suspensinya dengan menggunakan batang L yang telah disterilkan.d. Diinkubasi dengan menggunakan inkubator selama 24 jam dengan suhu 370C3. Penanaman dengan metode agar tuanga. Diambil suspensi bakteri yang berasal dari tabung kesepuluh dari pengenceran sebanyak 1 mlb. Dituang ke dalam cawan petric. Dituangkan media yang masih caird. Diputar cawan hingga homogen e. Dipanaskan pada bunsen sambil diputar-putar f. Diinkubasi dengan menggunakan inkubator selama 24 jam dengan suhu 370C4. Penanaman dengan goresan1.) Media Nutrient Agar (NA) a. Disentuhkan isolat bakteri dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkanb. Digoreskan pada media NA yang baru pada tabung reaksi secara zig-zagc. Dimasukkan ke dalam inkubator2.) Media Nutrient Broth (NB)a. Disentuhkan isolat bakteri dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkanb. Digoreskan pada media NB yang baru pada tabung reaksi c. Dimasukkan ke dalam inkubator

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASANA. Hasil PengamatanTabel.3.Hasil isolasi dan inokulasi bakteri NoSampelGambarKeterangan

1.Saos tomatISOLASI

Penanaman dengan metode agar tuang pada cawan petri

2.Saos tomatISOLASI

Penanaman dengan metode agar tabur ulas pada cawan petri

3.Saos tomatISOLASI

Penanaman dengan metode agar tabur ulas pada tabung reaksi

4. Saos tomatISOLASI

Penanaman dengan metode agar tuang pada tabung reaksi

5. Saos tomatINOKULASI

Penanaman dengan metode agar tabur ulas pada tabung reaksi

6.Saos tomatINOKULASI

Penanaman dengan metode agar tuang pada tabung reaksi

B. PembahasanIsolasi adalah cara pemisahan mikroorganisme tertentu dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh biakan yang sifatnya murni, sehingga dapat dibuat sebagai biakan kultur murni. Dalam praktikum isolasi bakteri, memerlukan lingkungan dan medium yang berisi zat hara untuk pertumbuhan sel, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakan yang sesuai dengan mikroorganisme. Medium biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba dalam bentuk padat, semi padat, dan cair, yang digunakan dalam praktikum ini adalah medium padat yaitu agar. Agar digunakan sebagai media karena tidak dapat diuraikan oleh mikroba. Media yang digunakan dalam praktikum adalah Nutrient Agar (NA) karena yang akan di biakan adalah bakteri.Metode inokulasi terbagi dua yaitu metode agar tegak dimana metode ini menggunakan medium yang telah dipadatkan dengan tegak (permukaannya rata) dalam tabung reaksi. Inokulasi dengan cara ini menggunakan ose lurus dengan cara menusukkan ose yang telah disentuhkan dengan biakan bakteri ke dalam medium yang memadat hingga dari tinggi medium. Kemudian diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37oC selama 1 x 24 jam untuk bakteri dan selama 3 x 24 jam untuk jamur pada suhu kamar.Metode inokulasi selanjutnya yakni metode agar miring. Pada metode agar miring inokulasi menggunakan medium yang telah dipadatkan dengan dimiringkan dalam tabung reaksi. Pada metode ini digunakan ose bulat yang telah disentuhkan dengan biakan bakteri atau jamur dengan cara digoreskan secara zigzag pada permukaan medium. Kemudian diinkubasikan selama 1x24 jamuntukbakteri dalaminkubatorpadasuhu37oC. Dalam kultur murni digunakan pula metode isolasi yang terbagi menjadi dua bagian yaitu isolasi substrat padat dengan metode gores, pertama-tama medium dimasukkan dalam cawan petri, ditunggu hingga memadat. Lalu digoreskankan sampel yang telah digerus pada medium yang memadat. Setelah itu, cawan petri tersebut dibungkus dan diinkubasi secara terbalik. Diamati pertumbuhan koloni mikrobanya. Isolasi substrat cair dengan metode tuang dilakukan dengan cara Sampel yang berupa larutan atau suspensi dimasukkan ke dalam cawan Petri, lalu dimasukkan juga medium. Dihomogenkan dengan cara digerakkan membentuk angka delapan. Ditunggu hingga medium memadat lalu cawan Petri tersebut dibungkus dan diinkubasi secara terbalik dan diamati pertumbuhan koloni mikrobanya.Bakteri membutuhkan waktu untuk pembelahan selama 1-2 hari. Inkubasi dilakukan dengan membalik cawan Petri. Hal ini dimaksudkan agar uap air yang terjadi selama proses inkubasi, tidak jatuh ke dalam medium yang dapat mengganggu petumbuhan mikroba.

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME

RISNA YULIANIHENDRA SENDANAO1A114080

BAB VPENUTUPA. KesimpulanBerdasarkan percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa untuk memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni dapat dilakukan dengan cara isolasi dan inokulasi. Isolasi adalah proses pengambilan atau pemindahan mikroorganisme dari alam ke medium buatan. Metode isolasi terbagi dua yaitu isolasi substrat padat dengan metode gores dan isolasi substrat cair dengan metode tuang. Inokulasi adalah suatu proses yang dilakukan untuk memindahkan mikroorganisme yang telah ditumbuhkan pada suatu media buatan ke media buatan yang baru. Metode inokulasi terbagi dua yaitu metode agar tegak dimana metode ini menggunakan medium yang telah dipadatkan dengan tegak (permukaannya rata) dalam tabung reaksi dan metode agar miring. Pada metode agar miring inokulasi menggunakan medium yang telah dipadatkan dengan dimiringkan dalam tabung reaksi.B. Saran Sebaiknya saat melakukan isolasi dan inokulasi mahasiswa dapat melakukan dengan cara yang sesuai agar mikroba dapat tumbuh sesuai dengan waktu pembelahannya yaitu 12 hari.

DAFTAR PUSTAKAAnonim, 2008, Pengujian Mikrobiologi Pangan, Jurnal Badan Pengawasan Obat dan Bahan Makanan Republik Indonesia, 9 (2)

Elrod, Sausan., Stansfield, William, 2002, Genetika Edisi Keempat, Penerbit Erlangga, Jakarta

Ditjen POM, 1979, Farmakope Indonesia Edisi III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Ditjen POM, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Hidayati, E., Juli, N., Marwani, E, 2002, Isolasi Enterobacteriaceae Patogen dari Makanan Berbumbu dan Tidak Berbumbu Kunyit (Curcuma longa L.) Serta Uji Pengaruh Ekstrak Kunyit (Curcuma longa L.) Terhadap pertumbuhan Bakteri yang Diisolasi, Jurnal Matematika dan Sains, 7(2)

Kharisma, Adnan., Manan, Abdul, 2012, Kelimpahan Bakteri Vibrio sp. Pada Air Pembesaran Udang Vannamei (Litopenaeus vannamei) Sebagai Deteksi Dini Serangan Penyakit Vibriosis, Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 4(2)

Makfoeld, D., Marseno, D.W., Hastuti, P., Anggrahini, S., Raharjo, S., Sastrosuwignyo, S., Suhardi., Martoharsono, S., Hadiwiyoto, S., Tranggono, 2002, Kamus Istilah Pangan dan Nutrisi, Penerbit Kanisius, Yogyakarta

Muliawan, Sylvia Y, 2007, Bakteri Anaerob yang Erat Kaitannya dengan Problem di Klinik, Penerbit Buku Kedokteran EGC, JakartaSafrida, Y.D., Yulvizar, C., Devira, C.N, 2012, Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Berpotensi Probiotik Pada Ikan Kembung (Rastrelliger sp.), Jurnal Depik, 1(3)