1. TUJUAN PRAKTIKUM

Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah agar praktikan dapat mengetahui cara

mengisolasi DNA, mengetahui cara mengekstraksi DNA dari inti sel, mengetahui cara

pemurnian DNA, serta mengetahui dan membandingkan bentuk DNA pada sel hewan,

bakteri, dan yeast.

2. TINJAUAN PUSTAKA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk

mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat

pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi

sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk

sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan

kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis

ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari

kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan

struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk

sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug &

Cummings, 1994).

Di dalam sel, DNA bertindak sebagai penyimpan informasi genetik yang tersimpan

sebagai genom (total informasi genetik) dalam sel. Secara nyata, DNA mengisi inti sel

yang penyimpanannya sangat terorganisasi dalam bentuk benang kromatid dan

kromosom. DNA tidak hanya terdapat dalam eukaryot, tetapi juga terdapat dalam

mitokondria dan kloroplastida. Pada eukaryot, DNA di dalam satu kromosom merupakan

molekul linier yang berlipat – lipat, dan spesies yang berbeda mempunyai jumlah

kromosom yang berbeda pula. Fungsi utama DNA adalah penyimpanan dan

mengorganisasikan informasi genetik total dalam sel (Muslim, 2003).

1

Stabilitas dari DNA dipengaruhi oleh matrix yang terkandung dalam DNA. Jadi tidaklah

mengherankan jika DNA pada padatan akan jauh lebih stabil jika dibandingkan dengan

DNA pada media cair. Karena pada padatan, matrix yang dikandung juga lebih banyak.

Sedangkan pada media cair, matrix yang ada kurang kuat, sehingga DNA mudah

terdegradasi. Hal yang sama juga ditemui pada bidang pangan, DNA rekombinan dari

starter yang berasal dari mahkluk hidup pada fermentasi termal akan memberikan

perlindungan bagi DNA untuk mencegah aktivitas Dnase I pada jaringan daging

(Skarger, 2001).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-

komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa.

Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa

purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda,

sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur

cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan

hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk

dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu

gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis,

2003).

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada

seluruh sistem kehidupan. DNA baik pada manusia, tumbuhan maupun hewan, dapat

diisolasi. DNA manusia atau hewan dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia dan

hewan terdiri atas plasma darah, globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein

dan hormon), dan gas (oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas

eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen

darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena

memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat

diisolasi. DNA pada manusia atau hewan lebih banyak dan lebih jelas terlihat daripada

DNA pada tumbuhan (Kimball, 1992).

2

Molekul DNA pada semua macam sel terdiri atas unit – unit keempat mononukleotida

utama yaitu d AMP, d GMP, d TMP, dan d CMP yang dihubungkan dalam suatu variasi

deretan oleh ikatan fosfodiester. DNA suatu spesies atau organisme tertentu mempunyai

perbandingan dan urutan yang khas untuk keempat mononukleotida tersebut. Selain itu,

berat molekul DNA untuk tiap macam organisme juga berbeda. Sel eukaryotik

mengandung beberapa kromosoma dan mempunyai banyak molekul DNA dengan berat

molekul yang sangat besar (Wirahadikusumah, 1989).

Struktur dan fungsi fisiologis bagian-bagian sel dapat dikaji dengan beberapa cara.

Misalnya, kita mengisolasi protein dan DNA serta menganalisis struktur dan fungsinya

secara in vitro. Isolasi protein dan DNA. Protein tertentu suatu sel (misalnya enzim

amilase atau lainnya) dapat difraksinasi, dipisahkan atau dimurnikan dari campuran

molekul lain melalui prosedur purifikasi protein. Aktivitas protein yang telah dimurnikan

kemudian dapat diuji dengan parameter biokimia (misalnya kinetika enzim dll) dan

dengan beberapa cara lainnya struktur primer, sekunder, dan tersier, dan kuartener dapat

ditentukan. Demikian pula aktivitas DNA dan enzim yang bekerja untuk DNA dapat diuji

secara invitro dengan bantuan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction). Kita bahkan

dapat melakukan sintesis DNA secara invitro (Choirul, 2003).

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.

Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul

dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan

berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik

sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi

dengan kecepatan yang bervariasi (Kimball, 1992).

Menurut Anonim (2006), isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:

a. Isolasi jaringan yang diinginkan.

b. Dinding dan membran sel dilisiskan

Menggunakan larutan pelisis yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan

tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis.

3

c. Diekstraksi dalam larutan

Setelah dilakukan inkubasi, jaringan yang telah bercampur dengan larutan pelisis

tersebut disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya

supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam

larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleusnya.

d. Dipurifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan jaringan dari zat-zat lainnya.

e. Dipresipitasi

Tahap terakhir ini, bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-

untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang

menyebabkan DNA menjadi terlihat. Supernatan yang berisi DNA kemudian

dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik

dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA.

Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000

rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang

kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol

bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur,

tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm.

Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya

adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA

untuk dipreservasi (Harley, 2006).

Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan

terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun

pada tumbuhan. Sel dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di

dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan

isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah

memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya

sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi

yang lebih ringan akan terletak di atas (Anonim, 2006).

4

Fraksinasi sel adalah upaya untuk memisah-misahkan bagian sel dan mengambil organel

yang diingini. Cara fraksinasi umumnya dimulai dengan homogenasi, diikuti dengan

ultrasentrifugasi sehingga akhirnya diperoleh organel yang diinginkan. Homogenasi

adalah upaya penggerusan jaringan agar sel-sel pecah dan isinya diletakkan dalam

medium homogenat dengan buffer yang menjaganya dari kerusakan. Ultrasentrifugasi :

pemusingan dengan kecepatan yang amat tinggi terhadap homogenat. Biasanya

ultrasentrifugasi dilaksanakan secara bertahap :

1. Sentrifugasi pada kecepatan 800 gram memisahkan bahan dari komponen makro

(debre atau kotoran yang harus dipisahkan pada tahap awal akan mengendap

sebagai pelet). Supernatan / cairan dipisahkan dari debre yang mengendap. Pada

kecepatan 800 gram s/d 1.000gram inti sel diketahui mengendap.

2. Sentrifugasi bertahap, berturut-turut pada kecepatan yang berbeda (misal 20.000

g, 100.000 g, dan 150.000 g) terhadap supernatan di atas kemudian dilakukan

sentrifugasi dengan kecepatan berbeda-beda secara bertahap yang bertujuan untuk

mendapatkan organel / zat metabolik yang sedang diamati (Muslim, 2003).

Pelet pada setiap tahap sentrifugasi diamati sehingga organel kecil / molekul besar

tertentu mengendap pada tahap sentrifugasi tertentu di atas. Hasil isolat organel ini

biasanya diperoleh dari sentrifugasi dengan kecepatan tertentu sebagai berikut :

a. Pada kecepatan 20.000 s/d 30.000 gram organel mitokondria, kloroplas, lisosom,

dan mikrobodi akan mengendap sebagai pelet

b. Pada 50.000 s/d 80.000 gram retikulum endoplasma akan mengendap

c. Pada 80.000 s/d 100.000 gram retikulum endoplasma halus akan mengendap

d. Adapun partikel kecil ribosom bebas dan partikel virus akan mengendap pada

kecepatan sentrifugasi 150.000 s/d 300.000 gram (Muslim, 2003).

Komposisi basa N pada DNA bervariasi antara spesies satu dengan lainnya. DNA yang

diisolasi dari bermacam-macam jaringan dalam satu spesies mempunyai basa N yang

sama. Komposisi basa N dalam DNA dalam satu spesies tertentu tidak mengalami

perubahan dengan umur, status nutrisional atau perubahan lingkungan. Ekstrak DNA

yang berasal dari spesies yang sangat dekat hubungan keluarganya mempunyai basa N

5

yang hampir sama dan sebaliknya apabila hubungan kekeluargaan itu jauh, maka

komposisi basa N nya sangat berbeda (Muslim, 2003).

Isolasi DNA dapat digunakan untuk mengecek ketepatan atau keidentikan dari suatu

kloning dengan gen yang diklon. Isolasi ini dapat dilakukan dengan PCR. Sel-sel dapat

diisolasi dari suatu jaringan dan dipisah-pisah menurut jenisnya masing-masing. Mula-

mula jaringan direduksi menjadi suatu suspensi yang hanya terdiri dari sel-sel yang

sejenis dengan cara membongkar matriks ekstraseluler dan sambungan-sambungan

antarsel. Sel-sel dapat dipisahkan dari suspensi sel dengan memanfaatkan perbedaan sifat

fisik sel (Alberts et al, 1994).

Larutan disaring untuk menghilangkan debris, seperti membran sel, protein yang

mengendap, potongan-potongan bahan yang tidak dapat dihancurkan seluruhnya dalam

blender. Molekul DNA yang larut air akan dapat melewati saringan. Lapisan lemak

bilayer dari membran sel dan nukleus dipecah oleh sabun, seperti lauryl atau laureth

sulfate yang terkandung dalam sampo and sabun pencuci piring. Sampo and sabun

pencuci piring juga mengandung EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid), yang

mengikat kation seperti Mg2+. Kation bertindak sebagai kofaktor yang membantu enzim

bekerja. Salah satu enzim yang berperan ialah nuklease, yaitu dengan menguraikan DNA.

Kutub positif dari NaCl (Na2+) mengarah ke DNA yang bersifat negatif. Hal ini

menimbulkan shield di sekitar molekul DNA dan menyebabkannya berkumpul

(coalesce). Hal ini membuat DNA dapat terpresipitasi ketika ditambahkan alkohol. Selain

itu, garam juga menyebabkan protein terdenaturasi. Pada akhir percobaan, terbentuk

globula kecil putih. Hal ini merupakan DNA. Molekul DNA bersifat larut air, tapi tidak

larut dalam alkohol. Akibatnya, ketika DNA kontak dengan alkohol, molekul DNA akan

terpresipitasi dalam alkohol dan dapat terlihat secara visual. Namun, yang tampak

tersebut merupakan ribuan molekul DNA yang tergabung bersama. DNA murni

sebenarnya tidak berwarna. Warna yang tampak saat pengamatan berasal dari pigmen

bahan yang diekstrak DNA nya (Kimball, 1992).

6

Dalam proses ekstraksi DNA ditambahkan larutan ethanol. Penambahan ini berfungsi

untuk membantu mendeteksi adanya DNA dalam bahan pangan. Dalam ekstraksi, DNA

akan dihasilkan terdapat pada lapisan atas yang ditambahkan ethanol, karena DNA tidak

larut ethanol. Sehingga dapat diamati dengan melihat lapisan atas dari campuran tersebut

(Mazmur, 1961).

7

3. MATERI METODE

3.1. Materi

3.1.1. Bahan

Dalam praktikum ini, bahan-bahan yang digunakan antara lain adalah kultur bakteri

(Acetobacter xylinum), yeast (Saccharomyces cerevisiae), daging hati, kecambah kacang

hijau, larutan sukrosa 0,5 M dingin, larutan NaCl 1 M dingin, larutan 10 % deterjen

“sunlight”, larutan kloroform, larutan etanol 95 % dingin, dan es batu.

3.1.2. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain timbangan, blender,

erlenmeyer, kain mori, corong, gelas ukur, beker glass , tabung sentrifuge, sentrifuge,

pengaduk, pipet tetes, pipet volum, pompa pileus, pipet mikro, baskom.

3.2. Metode

3.2.1. Sel Tumbuhan

3.2.1.1. Isolasi Inti Sel Tumbuhan

Pertama-tama 4 gram kecambah kacang hijau yang telah diiris ditimbang. Ditambah

dengan 20 ml larutan sukrosa 0,5 M dingin. Lalu dimasukkan ke dalam blender lalu

dihomogenisasi dengan kecepatan maksimum selama 15 detik. Ditambah dengan 20 ml

larutan sukrosa 0,5 M dingin. Kemudian disaring dengan kain saring. Filtrat

disentrifugasi selama 10 menit. Cairan yang dihasilkan dibuang sedangkan endapannya

diambil. Endapan yang didapat ditambah dengan 10 ml larutan sukrosa 0,5 M dingin.

Kemudian disentrifugasi lagi selama 10 menit. Cairan yang dihasilkan dibuang dan

endapannya diambil.

3.2.1.2. Ekstraksi DNA dari Inti Sel Tumbuhan

Endapan inti sel ditambah dengan 20 ml NaCl 1 M dingin dan 0,2 ml larutan “sunlight”

10 %. Campuran tersebut diaduk dalam baskom berisi es batu hingga mengental.

Kemudian ditambah 0,2 ml kloroform. Disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan

8

maksimal. Cairan yang didapat dipindah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan etanol

sebanyak 2 kali volume cairan tersebut. Perubahan yang terjadi diamati.

3.2.2. Sel Hewan

3.2.2.1. Isolasi Inti Sel hewan

4 gram daging hati yang telah diiris ditimbang. Ditambah dengan 20 ml larutan sukrosa

0,5 M dingin. Lalu dimasukkan ke dalam blender lalu dihomogenisasi dengan kecepatan

maksimum selama 15 detik. Ditambah dengan 20 ml larutan sukrosa 0,5 M dingin.

Kemudian disaring dengan kain saring. Filtrat disentrifugasi selama 10 menit. Cairan

yang dihasilkan dibuang sedangkan endapannya diambil. Endapan yang didapat ditambah

dengan 10 ml larutan sukrosa 0,5 M dingin. Kemudian disentrifugasi lagi selama 10

menit. Cairan yang dihasilkan dibuang dan endapannya diambil.

3.2.2.2. Ekstraksi DNA dari Inti Sel Hewan

Endapan inti sel ditambah dengan 20 ml NaCl 1 M dingin dan 0,2 ml larutan “sunlight”

10%. Campuran tersebut diaduk dalam baskom berisi es batu hingga mengental.

Kemudian ditambah 0,2 ml kloroform. Disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan

maksimal. Cairan yang didapat dipindah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan etanol

sebanyak 2 kali volume cairan tersebut. Perubahan yang terjadi diamati.

3.2.3. Sel Kultur

3.2.3.1. Isolasi Inti Sel Kultur Bakteri

20 ml kultur bakteri Acetobacter xylinum diambil lalu disentifugasi selama 30 menit.

Endapan dipisahkan, kemudian ke dalam endapan ditambahkan 30 ml larutan sukrosa

0,5 M dingin. Filtrat disentrifugasi selama 30 menit. Cairan yang dihasilkan dibuang

sedangkan endapannya diambil.

3.2.3.2. Isolasi Inti Sel Kultur Yeast

20 ml kultur yeast Saccharomyces cerevisae diambil lalu disentifugasi selama 30 menit.

Endapan dipisahkan, kemudian ke dalam endapan ditambahkan 30 ml larutan sukrosa

9

0,5 M dingin. Filtrat disentrifugasi selama 30 menit. Cairan yang dihasilkan dibuang

sedangkan endapannya diambil.

3.2.3.3. Ekstraksi DNA dari Inti Sel Kultur

Endapan inti sel ditambah dengan 20 ml NaCl 1 M dingin dan 0,2 ml larutan “sunlight”

10 %. Campuran tersebut diaduk dalam baskom berisi es batu hingga mengental.

Kemudian ditambah 0,2 ml kloroform. Disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan

maksimal. Cairan yang didapat dipindah ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan etanol

sebanyak 2 kali volume cairan tersebut. Perubahan yang terjadi diamati.

10

4. HASIL PENGAMATAN

Kelompok Bahan Gambar DNA Warna Bentuk Jumlah

1 Sel Tumbuhan

(Kecambah kacang

hijau)

+++ Titik dan serabut ++++

2 Sel Tumbuhan

(Kecambah kacang

hijau)

++ Serabut +++++

3 Sel Hewan

(Hati sapi)

+++++ Titik dan serabut ++

4 Sel Hewan

(Hati sapi)

++++ Serabut ++

5 Bakteri

(Acetobacter

xylinum)

+ Titik dan serabut +

6 Bakteri

(Acetobacter

xylinum)

+ Titik dan serabut +

7 Yeast

(Sacharomyces

cereviseae)

+++ Titik dan serabut ++

11

Keterangan warna:

+ = bening sekali

+ + = bening

+ + + = agak keruh

+ + + + = keruh

+ + + + + = keruh sekali

Keterangan jumlah:

+ = sedikit sekali

+ + = sedikit

+ + + = agak banyak

+ + + + = banyak

+ + + + + = banyak sekali

Pada kelompok 1 dan 2 dilakukan percobaan dengan bahan sel tumbuhan yaitu kecambah

kacang hijau. DNA yang telah diisolasi kelompok 1 mempunyai warna yang agak keruh

pada larutan, berbentuk titik dan serabut, dengan jumlah yang banyak. Sedangkan pada

kelompok 2 DNA yang telah diisolasi berwarna bening pada larutannya, berbentuk

serabut, dan mempunyai jumlah yang sangat banyak. Pada kelompok 3 dan 4 dilakukan

percobaan dengan bahan sel hewan yaitu hati sapi. DNA yang telah diisolasi kelompok 3

mempunyai warna yang sangat keruh pada larutannya, berbentuk titik dan serabut,

dengan jumlah yang sedikit. Sedangkan pada kelompok 4 DNA yang telah diisolasi

mempunyai larutan yang berwarna keruh, berbentuk serabut, dan mempunyai jumlah

yang sedikit. Pada kelompok 5 dan 6 dilakukan percobaan dengan bahan berupa kultur

bakteri yaitu Acetobacter xylinum. DNA yang telah diisolasi kelompok 5 mempunyai

warna larutan yang sangat bening, berbentuk titik dan serabut, dengan jumlah yang

sangat sedikit. Sedangkan pada kelompok 6 DNA yang telah diisolasi berwarna sangat

bening, berbentuk titik dan serabut, dan mempunyai jumlah yang sangat sedikit. Pada

kelompok 7 digunakan kultur yeast yaitu Saccharomyces cereviseae. DNA yang telah

diisolasi berbentuk titik dan serabut dengan jumlah yang sedikit. Warna larutan pun agak

keruh.

12

5. PEMBAHASAN

Percobaan yang dilakukan diatas merupakan percobaan isolasi DNA dari sel tumbuhan

yang diambil dari kecambah kacang hijau, DNA sel hewan yang diambil dari hati sapi,

dan DNA kultur yeast dan bakteri yang diambil dari Acetobacter xylinum dan

Saccharomyces cerevisae. DNA sendiri merupakan asam nukleat yang mengandung

materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk

kehidupan secara seluler (Klug & Cummings, 1994). Dengan mengisolasi DNA dari

berbagai macam sel tersebut praktikan dapat mengetahui bentuk DNA dari berbagai

macam sel.

DNA biasanya terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang terdapat

pada nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon. DNA

yang terdapat pada mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi

dengan protein histon. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda

dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan

berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein

histon (Klug & Cummings, 1994). Setelah dilakukan isolasi DNA, pada DNA sel tidak

terdeteksi bentuk DNA secara jelas, hanya berupa serabut dan titik. Sehingga tidak dapat

diketahui asal dan jenis DNA (prokariot atau eukariot).

Proses isolasi DNA melalui beberapa tahap, antara lain :

1. Isolasi jaringan yang diinginkan.

Jaringan merupakan bagian dari makhluk hidup yang merupakan gabungan dari banyak

sel. Pada tahap ini jaringan yang digunakan adalah bagian kecambah dari tanaman

kacang hijau, bagian hati dari sapi, kultur bakteri dari Acetobacter xylinum, dan kultur

yeast dari Saccharomyces cerevisae. Pengisolasian jaringan hanya dilakukan dengan

menghancurkan bahan dan penambahan sukrosa dingin.

2. Dinding dan membran sel dilisiskan

Proses ini digunakan untuk mendapatkan inti sel yang nantinya akan menghasilkan DNA

yang diperoleh dari dalam sel. Proses ini menggunakan larutan pelisis yang merupakan

13

larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Setelah

jaringan diisolasi, cairan dan endapan dipisahkan dengan sentrifugasi. Endapan yang

terbentuk adalah inti sel.

3. Diekstraksi dalam larutan

Setelah dilakukan inkubasi, inti sel yang telah bercampur dengan larutan pelisis (larutan

sukrosa 1 M dingin) tersebut disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm.

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di

dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleusnya.

4. Dipurifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan jaringan dari zat-zat lainnya. Larutan yang

digunakan adalah NaCl 1 M dingin yang mendenaturasi protein sehingga larutan lebih

murni.

5. Dipresipitasi

Tahap terakhir ini, bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai

DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang

menyebabkan DNA menjadi terlihat. Untuk menguraikan DNA digunakan larutan

“sunlight” 10%. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung

berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik dengan gerakan angka 8. Pemberian

isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Larutan isopropanol yang digunakan dalam

praktikum ini adalah khloroform. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5

menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA

pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali.

Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya.

Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan

kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung.

Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk

melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi (Harley, 2005).

Dalam praktikum, dilakukan penyaringan ekstrak hati ayam dan ekstrak kecambah

kacang hijau. Menurut Zanta (2006), penyaringan tersebut dimaksudkan untuk

menghilangkan debris, seperti membran sel, protein yang mengendap, potongan-

14

potongan bahan yang tidak dapat dihancurkan seluruhnya dalam blender. Molekul DNA

yang larut air akan dapat melewati saringan. Selain itu, dalam praktikum digunakan pula

larutan “Sunlight” 10 %. Penambahan larutan sabun ini bertujuan untuk memecah lapisan

lemak bilayer dari membran sel dan nukleus. Larutan sabun tersebut juga mengandung

EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid), yang mengikat kation seperti Mg2+. Kation

bertindak sebagai kofaktor yang membantu enzim bekerja. Salah satu enzim yang

berperan ialah nuklease, yaitu dengan menguraikan DNA. Kutub positif dari NaCl (Na+)

mengarah ke DNA yang bersifat negatif. Hal ini menimbulkan shield di sekitar molekul

DNA dan menyebabkannya berkumpul (coalesce). Hal ini membuat DNA dapat

terpresipitasi ketika ditambahkan alkohol. Selain itu, garam juga menyebabkan protein

terdenaturasi (Kimball, 1992).

Dalam ekstraksi DNA, ditambahkan pula NaCl. Garam ini memiliki fungsi untuk

memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil. Penambahan kloroform

berfungsi untuk memvisualisasikan DNA dan menetralkan (desalted) sebab kloroform

tidak memiliki muatan, sedangkan DNA bermuatan negatif (-). Kemudian tabung

dibolak-balik untuk mendapatkan DNA) (Anonim, 2006).

Dalam percobaan ini dilakukan berulang kali proses sentrifugasi. Proses tersebut

merupakan proses fraksinasi sel yaitu upaya untuk memisahkan bagian sel dan dapat

mengambil organel yang diingini. Tujuan dilakukannya proses tersebut yaitu untuk

mendapatkan molekul DNA terpisah dari molekul – molekul zat yang lainnya (isolasi

DNA). Sentrifugasi sendiri memiliki pengertian yaitu pemusingan dengan kecepatan

tertentu terhadap homogenat. Adapun tahapan-tahapannya dibedakan berdasarkan tingkat

kecepatan yang digunakan, misal kecepatan 800g, kecepatan 1000g, kecepatan 10.000g,

dan sebagainya (Muslim, 2003).

Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul

dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan

berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Anonim,

15

2006). Proses ultrasentrifugasi adalah pemusingan dengan kecepatan yang amat tinggi

terhadap homogenat. Biasanya ultrasentrifugasi dilakukan secara bertahap, yaitu:

Sentrifugasi pada kecepatan 800 g untuk memisahkan bahan dari komponen

makro. Supernatan atau cairan dipisahkan dari debre yang mengendap. Pada

kecepatan 800 g sampai 1000 g, inti sel akan mengendap. Ini adalah sentrifugasi

tahap pertama.

Sentrifugasi bertahap, berturut-turut pada kecepatan yang berbeda (misal 20000 g,

100000 g dan 150000 g). Terhadap supernatan di atas kemudian dilakukan

sentrifugasi dengan kecepatan berbeda-beda secara bertahap yang bertujuan untuk

mendapatkan organel atau zat metabolik yang sedang diamati. Hasil isolasi organel

biasanya diperoleh dari sentrifugasi dengan kecepatan tertentu sebagai berikut:

- Pada kecepatan 20000 g sampai 30000 g organel mitokondria, kloroplas, lisosom

dan mikrobodi akan mengendap sebagai pelet.

- Pada kecepatan 50000 g sampai 80000 g retikulum endoplasma akan mengendap.

- Pada kecepatan 80000 g sampai 100000 g, retikulum endoplasma halus akan

mengendap.

- Adapun partikel kecil ribosom bebas dan partikel virus akan mengendap pada

kecepatan sentrifugasi 150000 sampai 300000 g.

Setelah melalui beberapa tahapan isolasi DNA, melalui hasil pengamatan dapat diketahui

bahwa DNA yang terbentuk adalah berbentuk titik dan serabut. Pada kelompok 1 dan 2

dengan bahan sel tumbuhan yaitu kecambah kacang hijau mempunyai bentuk titik dan

serabut, dengan jumlah yang banyak pada kelompok 1 dan berbentuk serabut, dengan

jumlah yang sangat banyak pada kelompok 2. Pada kelompok 3 dan 4 dengan bahan sel

hewan yaitu hati sapi didapati DNA yang berbentuk titik dan serabut, dengan jumlah

yang sedikit pada kelompok 3. Sedangkan pada kelompok 4 DNA yang telah diisolasi

berbentuk serabut, dan mempunyai jumlah yang sedikit. Pada kelompok 5 dan 6 dengan

bahan kultur bakteri yaitu Acetobacter xylinum hasil isolasi DNA mempunyai bentuk titik

dan serabut, dengan jumlah yang sangat sedikit pada kelompok 5. Sedangkan pada

kelompok 6 DNA yang telah diisolasi berbentuk titik dan serabut, dan mempunyai

jumlah yang sangat sedikit. Pada kelompok 7 digunakan kultur yeast yaitu

16

Saccharomyces cereviseae dengan bentuk DNA berupa titik dan serabut dengan jumlah

yang sedikit.

DNA tersebut dapat terlihat jika diterawang dibawah sinar lampu. DNA yang terbentuk

pada sel tumbuhan terdapat dalam jumlah yang banyak. Hal tersebut disebabkan karena

sebagian besar hewan dan tumbuhan adalah eukaryotik yaitu terdiri atas banyak sel,

sehingga molekul DNA yang dihasilkan juga sangat banyak (Kunihiro, 1987). Pada hasil

dari DNA sel hewan didapati jumlah DNA yang sedikit. Hal ini dapat terjadi karena

kesalahan praktikan pada saat pengambilan supernatan. Cairan yang terbuang bersama

supernatan akan mengurangi jumlah DNA pada hasil akhir. Teori Kunihiro juga

dikuatkan oleh Wirahadikusumah (1989), yaitu sel eukaryotik mengandung beberapa

kromosom dan mempunyai banyak molekul DNA dengan berat molekul yang sangat

besar.

Dengan menggunakan bahan yang berbeda, yaitu sel tumbuhan, sel kultur dan sel hewan,

dapat terlihat adanya perbedaan dalam jumlah. Dan secara keseluruhan DNA ini terlihat

berupa titik dan serabut yang terlihat di bawah sinar lampu dan berpendar dibanding

larutan sekelilingnya dan ada juga yang berbentuk seperti benang. Menurut Muslim

(2003), molekul DNA yang terbentuk berbeda–beda untuk tiap bahan dikarenakan pada

spesies yang berbeda jumlah kromosom yang dimiliki juga berbeda.

Pada hasil pengamatan, tampak adanya gumpalan putih kecil. Gumpalan kecil inilah yang

merupakan DNA. DNA dapat terlihat sebagai gumpalan karena merupakan kumpulan

dari ribuan molekul DNA. DNA yang terlihat berada dalam bentuk bergerombol karena

adanya shield di sekitar DNA akibat kation Na+ yang menuju ke DNA. Hal ini terjadi

akibat ketidaklarutannya dalam alkohol. Akibatnya, ketika DNA kontak dengan alkohol,

molekul DNA akan terpresipitasi dalam alkohol dan dapat terlihat secara visual. DNA

murni sebenarnya tidak berwarna. Warna yang tampak saat pengamatan berasal dari

pigmen bahan yang diekstrak DNA nya (Zanta, 2006). Oleh karena itu pada kelompok 1

dan 2 yang menggunakan bahan sel tumbuhan yaitu kecambah kacang hijau warna yang

didapat berturut-turut adalah bening dan agak keruh. Pada kelompok 3 dan 4 yang

17

menggunakan bahan sel hewan yaitu hati sapi, mempunyai warna yang sangat keruh dan

keruh pada kelompok 4. Pada kelompok 5 dan 6 yang menggunakan bahan berupa kultur

bakteri yaitu Acetobacter xylinum warna larutan yang sangat bening. Sedangkan pada

kelompok 7 digunakan kultur yeast yaitu Saccharomyces cereviseae yang berwarna

keruh.

18

6. KESIMPULAN

DNA (Deoxyribonucleic acid) merupakan informasi genetik utama pada sel hidup

dan organisme.

DNA berfungsi sebagai penyimpan dan pengorganisir informasi genetik total

dalam sel.

DNA terdapat pada nukleus, kloroplas dan mitokondria.

Tiap spesies memiliki jumlah kromosom dan berat molekul DNA yang berbeda-

beda.

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter

pada seluruh sistem kehidupan.

DNA pada nukleus berbentuk linear dan berikatan dengan protein histon (sama

dengan DNA pada organisme eukariot) sedangkan DNA pada kloroplas dan

mitokondria berbentuk sirkuler dan tidak berikatan dengan protein histon (sama

dengan DNA pada organisme prokariot).

Tahap isolasi DNA adalah : isolasi jaringan, dinding atau membran sel

dihancurkan (lisis), ekstraksi dalam larutan, tahap purifikasi dan terakhir adalah

presipitasi.

Fraksinasi sel adalah upaya untuk memisahkan sel sehingga diperoleh organel

yang diingini.

Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan prinsip sentrifugasi dan presipitasi.

Proses sentrifugasi dilakukan untuk memusingkan homogenat dengan kecepatan

tertentu sehingga diperoleh molekul DNA yang terpisah dari molekul lain.

Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan substansi berdasarkan berat jenis

molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal, sehingga substansi yang lebih

berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di

atas.

Ekstraksi DNA akan dihasilkan terdapat pada lapisan atas yang ditambahkan

ethanol, karena DNA tidak larut pada ethanol.

DNA yang tampak adalah berupa titik-titik yang berwarna putih.

19

Bila didiamkan beberapa saat maka titik-titik itu dapat membentuk untai (double

helix).

Larutan sukrosa dingin berfungsi melisiskan membran sel.

Larutan pencuci piring yang mengandung EDTA (ethylene diamine tetraacetic

acid) berfungsi memecah ikatan lapisan lemak bilayer dari membran sel dan

nukleus.

Kation dari garam NaCl mengarah ke kutub negatif DNA dan menyebabkan

terkumpulnya DNA dan terpresipitasi saat ditambah dengan alkohol.

Penambahan ethanol dimaksudkan untuk membantu mendeteksi adanya DNA.

Perbedaan DNA sel hewan dan tumbuhan dengan sel kultur adalah banyaknya

jumlah DNA pada sel hewan dan tumbuhan

Warna pada larutan DNA tergantung pada bahan yang digunakan dalam isolasi

DNA

Praktikan Asisten dosen:

- Ayu

- Hendri

Victoria Eduarty Mahu

08.70.0140

20

7. DAFTAR PUSTAKA

Anonim. (2006). Isolasi DNA. http://id.wikipedia.org/wiki/Isolasi_DNA.

Choirul. (2003). Biologi Molekuler Sel. Jurusan Biologi Universitas. Bengkulu.

Harley, J.T. (2005). Regulatory exercises in microbiology. 6th ed. McGraw-Hill Company, Boston: xiv + 466 hlm.

Kimball, J.W. (1992). Biologi jilid 1 edisi 5. Erlangga. Jakarta.

Klug, W.S. & M.R. Cummings. (1994). Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs: xvi + 779 hlm.

Kunihiro, Matsuda. (1987). Bioteknologi PT Elex Media Komputindu. Gramedia. Jakarta

Lewis, R. (2003). Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.

Mazmur, L. (1961). A Procedure for the Isolation of DNA from Microorganism. Journal of Molecular Biology. www.ncbe.reading.as.uk/NCBE/Protocols?PDF/PeaDNA.pdf

Muslim, C. (2003). Biologi Molekuler Sel. Jurusan Biologi Universitas Bengkulu. Bengkulu.

Skarger A. G, Basel C. H. 2001. Safety Consideration DNA in Foods. ILSI Press. Washington DC, USA.

Wirahadikusumah, M. (1989). Biokimia : Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. ITB. Bandung.

Zanta, C. A. (2006). Biotechnology in a Lunchbox: Extract DNA from fruit & make a smoothie!!! UIUC-Hughes Biotechnology Education and Outreach Program. Activity modified from lowa State University Biotechnology Center. http:// www.life.uiuc.edu/hughes/footlocker /Activities/Fruit_DNA.pdf

21

8. LAMPIRAN

8.1. Laporan Sementara

8.2. Jurnal

8.3. Review Jurnal

22