ANALISIS KUALITAS SPERMA IKAN

Oleh :

Nama : Wina Pratiwi NugrahaniNIM : B1J011019Rombongan : IKelompok : 4Asisten : Muhimatul umami

LAPORAN PRAKTIKUM STRUKTUR DAN PERKEMBANGAN HEWAN II

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERALSOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2012

I. PANDAHULUAN

A. Latar Belakang

Spermatozoa merupakan sel gamet jantan yang sangat terdeferensiasi. Fungsinya

adalah untuk mengantarkan material genetis jantan ke betina dan mengaktifkan program

perkembangan telur. Analisis sperma dilakukan untuk mengetahui proses pada

pembuahan, waktu pada setiap tahapan dan mengetahui serta menentukan rasio

spermatozoa dan ovum dalam pembuahan. Analisis sperma yang dimaksud meliputi

pemeriksaan jumlah milt yang dapat distriping dari seekor ikan jantan masak kelamin,

kekentalan sperma, warna, bau, jumlah spermatozoa hidup, jumlah spermatozoa mati,

motilitas, morfologi (ukuran dan bentuk kepala, ukuran ekor, berbagai penyimpangan)

(Yatim,1982).

Analisis sperma pada ikan Nilem dapat diaplikasikan pada spesies lain,

contohnya pada mamalia, termasuk manusia, ikan mas, ikan paus, atau pada kelas

lainnya. Kriteria kesuburan pria secara umum didasarkan pada jumlah spermatozoa

motil per ml ejakulat. Spermatozoa diperoleh dari sperma hasil masturbasi atau dari

koilus interuptus. Pria yang akan diperiksa biasanya dianjurkan untuk puasa tidak

melakukan hubungan intim selama 3 hari sebelumnya dan harus segera diperiksa setelah

ejakulasi (Yatim,1982).

Ikan Nilem (Osteochilus hasselti) dipilih sebagai bahan praktikum mengenai

analisis sperma karena ukurannya yang relatif lebih kecil dibandingkan dengan ikan

tawes dan ikan mas sehingga dapat dirawat dan dipelihara dalam aquarium. Selain itu

ikan nilem juga mudah diamati, mudah didapatkan dan harganya tidak terlalu mahal.

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk analisis sperma dan menentukan

kualitas spermatozoa hewan uji.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Ikan Nilem (Osteochilus hasselti) termasuk ke dalam keluarga Cyprinidae

seperti ikan mas dan ikan tawes. Bentuk badan mirip ikan mas, tetapi badannya lebih

memanjang dengan sirip punggung relatif lebih panjang. Ikan nilem mempunyai dua

pasang kumis (barbels) di bagian luar mulutnya. Umumnya ikan nilem mempunyai

panjang sekitar 25 cm dengan berat badan 150 gram. Ikan nilem biasanya memijah pada

akhir musim penghujan di perairan bebas dan pada daerah pesisir. Ikan nilem hidup

pada ketinggian 150-800 m dpl. Ukuran tubuh ikan dewasa antara 15-20 cm dengan

berat berkisar antara 100-200 gram. Ikan Nilem merupakan salah satu sumber protein

bagi manusia (Yatim,1982).

Ikan Nilem mempunyai organ reproduksi yaitu testis yang berwarna putih.

Testis terdapat sepasang yang digantungkan oleh jaringan ikat yang disebut

meserchium, terletak pada rongga perut di depan gelembung renang. Testis mempunyai

struktur yang terdiri dari saluran berongga (tubulus longitudinalis) yang banyak sekali

terdapat pada ciste seminiferus. Ciste tersebut memiliki dinding yang berisi sel-sel

spermatogonium yang disebut primordial germinal cell. Di luar tubulus terdapat sel

interstitial (sel leydig) sebagai penghasil hormone androgen (hormon jantan). Hormon

androgen yang paling kuat pengaruhnya adalah hormon testosteron yang berfungsi

menentukan tanda-tanda kelamin jantan, menentukan tingkah laku kelamin jantan dan

merangsang spermatogenesis (Partodihajo, 1990).

Ikan Nilem jantan masak kelamin setelah berumur 8 bulan. Berat testis lebih

ringan dibanding berat ovarium pada ikan yang sama umurnya. Sepasang testis dapat

menghasilkan sekitar 1-1,5 ml milt dalam keadaan ejakulasi alami, tetapi pada striping

hanya 1 ml. Setiap 1 ml milt mengandung 200-300 juta spermatozoa. Milt Ikan Nilem

setelah diejakulasikan dan bersentuhan dengan air lalu menggumpal. Milt harus

diencerkan dengan larutan NaCl sampai 1000 kali. Pengenceran ini dapat

memperpanjang daya hidup spermatozoa Ikan Nilem (Partodihajo, 1990).

Pengamatan mikroskopis sperma diantaranya adalah penghitungan jumlah

spermatozoa. Hemositometer merupakan gelas objek yang berbentuk persegi panjang

memiliki kotak-kotak berukuran dimana terdapat dua liang sebagai tempat cairan

sperma. Haemositometer sangat diperlukan dalam praktikum analisis sperma karena

dapat digunakan dalam menghitung jumlah sperma yang normal dan abnormal dan juga

sperma yang motil dan non motil (Yatim, 1982).

Sperma ikan terdiri dari tiga komponen utama yaitu kepala, leher dan ekor.

Kepalanya terutama terdiri dari suatu nukleus padat yang dimahkotai dengan akrosom

kecil berbentuk bulan sabit. Akrosomnya mengandung sejumlah enzim hidrolitik dan

dianggap berperan dalam penembusan telur oleh spermatozoa (Paxton, 1986).

Syarat hewan uji yang digunakan dalam analisis sperma menurut Yatim (1982)

persyaratannya adalah:

1. Proses pembuahan yang terjadi diluar tubuh ikan betina.

2. Terdapat pada ikan atau katak.

3. Hewan yang mudah disadap telur maupun sperma masaknya.

4. Mudah dibedakan antara jantan dan betina.

5. Telurnya bersifat transparan.

6. Mudah dioviposisikan.

7. Siklus hidup ikan pendek.

8. Telur maupun sperma yang dihasilkan setiap siklus reproduksi cukup

banyak.

III. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah object glass, cover glass,

cavity slide, pipet tetes, mikroskop, kertas tissue, tusuk gigi, pengukur waktu,

haemositometer, mikrometer, spuit 1 mL, beaker glass 50 mL, well plate, dan pengukur

waktu.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum analisis kualitas sperma pada ikan

adalah larutan NaCl fisiologis atau larutan ringer, akuades dan pewarna giemsa atau

eosin.

B. Metode

1. Sperma Ikan Nilem dikeluarkan dengan cara stripping.

2. Milt ikan keluar disedot dengan alat suntik dan diletakkan dalam cawan Petri.

3. Kemudian dilakukan pemeriksaan Makroskopis

Warna:

a. Diperhatikan warna sperma yang sudah didapat dengan mata talanjang.

b. Dicatat warna sperma.

Bau:

a. Sperma ikan dalam cawan Petri dipegang dengan tangan kiri dan tangan kanan

dikipas-kipaskan agar bau sperma tercium.

b. Dicatat bau yang tercium.

Volume:

a. Milt yang keluar diukur volumenya dengan gelas ukur 10 ml.

b. Dicatat volumenya.

pH:

a. Sepotong kertas pH diambil dan dicelupkan pada sperma.

b. Setelah beberapa saat dicocokkan dengan tabel indikator.

c. pH dicatat.

Viskositas:

a. Diletakkan sperma diatas object glass

b. Digerakkan seperti menyendok dengan tusuk gigi

4. Dilakukan pemeriksaan mikroskopis

Menilai Motilitas Sperma:

a. Diambil sperma 0,1 ml diencerkan 100 kali dalam larutan NaCl

b. Diteteskan beberapa tetes dengan pipet di atas gelas objek dan ditambah akuades lalu

ditutup dengan gelas penutup.

c. Dilihat dengan perbesaran 400 kali, dicatat motilitas sperma yang terlihat.

Pemeriksaan Morfologi Spermatozoa

a. Dibuat sediaan apus sperma.

b. Diteteskan sperma pada gelas objek disalah satu ujungnya.

c. Digunakan tepi ujung gelas objek yang lain yang diberdirikan dengan sudut 30

derajat.

d. Dibiarkan kering udara selama 5 menit.

e. Ditirsasi dengan larutan methanol (1:1) selama 5 menit.

f. Ditetesi pewarna larutan eosin (pengencer 20 kali) selama 30 menit.

g. Dibiarkan kering udara kemudian diamati di bawah mikroskop.

Bilik Hitung (Haemositometer)

a. Bilik hitung ditempatkan pada meja mikroskop

b. Digunakan lensa objektif perbesaran 400 kali.

c. Diperhatikan 9 kotak besar.

d. Diperhatikan kotak yang ditengah-tengah.

e. Fokus ke dalam 5 kotak dan sperma yang terlihat ditandai binti-bintik dihitung

dengan hand counter

f. Dari kelima data dirata-rata dan ditambah data dari kelompok lain

rumus: ΣTotal spermatozoa = rata-rata 5 kotak x 2,5. 105 x fp sel/ml

.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

1. Volume : 1,26 ml/2 ekor ikan

2. Viskositas : 10 menit

Table 1. Akumulasi Data Pengamatan Viskositas Rombongan I

Kelompok Viskositas (menit)

1 10

2 10

3 12

4 10

5 21,11

6 28

3. Bau : amis

4. Warna : Putih susu

5. pH : 8,5

6. Motilitas : a. sperma motil 0%

b. sperma non motil 100%

Table 2. Akumulasi Data Pengamatan Motilitas Spermatozoa Rombongan I

K1 K2 K3 K4 K5 K6 Rata-

rata

Presentase sperma motil (%) 75 10 100 0 60 70 52,5

Presentase sperma non motil (%) 25 90 0 100 40 30 47,5

Keterangan:K=kelompok

7. Pengamatan bilik hitung

Gambar 1. Bilik Hitung Haemocytometer

8. Jumlah total spermatozoa

Table 3. Akumulasi Data Pengamatan ΣTotal Spermatozoa Rombongan I

K1 K2 K3 K4 K5 K6 Rata-

Rata

ΣTotal spermatozoa/ml 44,5.

109

39. 109 4,9.

109

2. 109 61,5.

109

7,5.

109

26,57.

109

Keterangan:K=kelompok

Perhitungan: Diketahui:

kotak 1 = 2

kotak 2 = 0

kotak 3 = 0

kotak 4 = 2

kotak 5 = 0

rata-rata = 4/5= 0,8

jawab:

ΣTotal spermatozoa = rata-rata 5 kotak x 2,5. 105 x fp sel/ml

= 0,8 x 2,5.105 x 104

= 2 x 109 sel/ml

(A) (B)

Keterangan Gambar :

A. Gambar Skematis Morfologi Sperma

B. Gambar Mikroskopis Morfologi Sperma

1. Kepala sperma

2. Ekor sperma

9. Kesimpulan/ diagnosa

Volume milt ikan yang dihasilka pada praktikum adalah 1,26 ml/2 ekor ikan.

Viskositas dari milt ikan terjadi setelah pengamatan selama 10menit. Milt ikan memiliki

bau amis, berwarna putih susu dan memiliki pH 8,5. Motilitas milt ikan yang diperoleh

adalah presentase sperma motil sebesar 0% dan presentase sperma non motil sebesar

100%. Hal ini terjadi karena selama melakukan pengenceran waktu yang diperlukan

terlalu lama dan milt ikan juga sudah terjadi kontak dengan cahaya, yang

mengakibatkan spermatozoa dalam milt ikan mati.

B. Pembahasan

Normal Tidak Normal

Volume milt ikan yang dihasilkan pada praktikum adalah 1,26 ml/2 ekor ikan.

Viskositas dari milt ikan terjadi setelah pengamatan selama 10 menit. Milt ikan

memiliki bau amis, berwarna putih susu dan memiliki pH 8,5. Motilitas milt ikan yang

diperoleh adalah presentase sperma motil sebesar 0% dan presentase sperma non motil

sebesar 100%. Hal ini terjadi karena selama melakukan pengenceran waktu yang

diperlukan terlalu lama dan milt ikan juga sudah terjadi kontak dengan cahaya, yang

mengakibatkan spermatozoa dalam milt ikan mati.

Berdasarkan dengan hasil praktikum yang telah dilakukan, volume sperma yang

dihasilkan sebanyak 1,26 ml dan hal ini sama dengan pustaka, menyatakan bahwa

sperma yang normal (normospermia) volumenya antara 1 s.d. 6 ml. Sehingga sperma

yang dihasilkan ikan nilem tergolong hypospermia karena volumenya kurang dari 1 ml.

Konsentrasi sperma sangat dipengaruhi oleh asupan nutrisi dan frekuensi pengambilan

sperma. menyatakan bahwa protein yang tinggi dalam pakan dapat meningkatkan

volume, konsentrasi dan jumlah spermatozoa yang hidup. Konsentrasi sperma yang

rendah disebabkan kebutuhan nutrisi dalam sel sperma belum mencukupi karena nutrisi

yang tersedia lebih banyak dipakai untuk kebutuhan pertumbuhan dan perkembangan

tubuh. Frekuensi pengambilan sperma mempengaruhi konsentrasi sperma, karena

spermatozoa memiliki waktu tertentu untuk proses spermatogenesis sehingga jumlah

spermatozoa berkurang jika frekuensi pengambilan sperma terlalu dekat (Condro,2012).

Berdasarkan dengan hasil praktikum yang telah dilakukan, viskositas yang

dihasilkan adalah 10 menit. Menurut pustaka, bahwa durasi motilitas terjadi dalam

periode yang sangat pendek pada ikan air tawar, Pergerakan aktif spermatozoa ikan

sekitar 1-2 menit dan tak ada lagi pergerakan setelah 5 menit. Semakin kental sperma

tersebut semakin besar vikositasnya. Hal ini mungkin disebabkan karena sperma terlalu

banyak, cairannya sedikit, gangguan liquedaction, perubahan komposisi plasma sperma,

dan pengaruh obat-obatan (Condro,2012).

Berdasarkan dengan hasil praktikum yang telah dilakukan, bau yang dihasilkan

adalah bau amis, warna putih susu dan pH 8,5. Berdasarkan pustaka, bau dan warna

sudah sesuai. Namun ada perbedaan pada pH. Sperma yang normal mempunyai pH

antara 7,2-7,8. pH lebih dari 8 menunjukkan adanya radang akut kelenjar kelamin atau

epididymis. pH kurang dari 7,2 menunjukkan adanya penyakit kronis pada kelenjar atau

epididymis. pH rendah sekali menunjukkan adanya gangguan atau aplasia pada

vesicular seminalis atau ductus ejaculatorius. pH dapat berubah satu jam sesudah

ejakulasi (Meirnawati, 2011).

Berdasarkan dengan hasil praktikum yang telah dilakukan, motilitas sperma ikan

Nilem adalah 0% untuk motil dan 100% untuk nonmotil. Hasil pengamatan tersebut

menunjukkan sperma tidak memiliki kualitas yang baik secara mikroskopis. Menurut

pustaka, sperma segar yang akan digunakan untuk pembekuan harus memiliki motilitas

minimal 70%. Penggunaan hemositometer untuk menentukan jumlah spermatozoa

dalam semen menurut pendapat terbaru dianggap kurang praktis, karena kecuali

memerlukan sedikit keahlian dalam menghitung juga memerlukan waktu dalam

menghitung dengan mikroskop. Sperma yang diteteskan di atas kotak hemositometer

ditutup dan dihitung, hasilnya dicatat misalnya y. Y ini adalah jumlah sel-sel

spermatozoa yang mati dan yang terlihat tidak bergerak dalam kotak-kotak.

Spermatozoa yang tidak bergerak belum tentu mati Hal ini disebabkan selama

melakukan pengenceran waktu yang diperlukan terlalu lama dan milt ikan juga sudah

terjadi kontak dengan cahaya, yang mengakibatkan spermatozoa dalam milt ikan mati

(Meirnawati, 2011).

Berdasarkan dengan hasil praktikum yang telah dilakukan, jumlah total

spermatozoa untuk rombongan I adalah 26,57.109 spermatozoa/ml. Sehingga menurut

Yatim (1982), konsentrasi spermatozoa tersebut termasuk dalam golongan

polyzoospermia karena jumlah spermanya lebih dari 250 juta/ml. Jumlah spermatozoa

normal (normozoospermia) berada pada rentang antara 40 sampai 200 juta/ml.

Konsentrasi spermatozoa yang tinggi akan dapat menghambat aktivitas spermatozoa,

yang disebabkan berkurangnya daya gerak sehingga spermatozoa sukar menemukan

atau menembus mikrofil sel telur yang mengakibatkan rendahnya fertilitas spermatozoa.

Namun dalam kepentingan pemijahan buatan konsentrasi spermatozoa tidak begitu

dipentingkan, tetapi yang sangat menentukan adalah motilitas spermatozoa dalam

menuju sel telur (Putra, 2010).

Pemeriksaan makroskopis sperma meliputi volume, warna, pH, viskositas dan

bau sedangkan mikroskopis sperma meliputi motilitas, morfologi dan jumlah total

spermatozoa (Melati, 2011). Penentuan jumlah total spermatozoa menggunakan

haemositometer, dengan pengenceran 0,1 ml sperma menggunakan NaCl fisiologis.

Pemeriksaan motilitas menggunakan mikroskop perbesaran 400 kali dengan meneteskan

sperma pada object glass dan ditambahkan aquadest. Penilaian motilitas dilakukan

dengan menduga persentase sperma yang pergerakannya progresif ke depan

dibandingkan dengan total sperma yang diamati. Penentuan viabilitas dilakukan dengan

pembuatan preparat ulas eosin negrosin, kemudian membandingkan jumlah sperma

hidup dengan total sperma yang diamati dan dinyatakan dalam persen. Pemeriksaan

morfologi menggunakan mikroskop dan melihat bentuk-bentuk dari sperma

(Meirnawati, 2011).

Banyak macam bentuk spermatozoa yang abnormal yang mungkin dapat dilihat.

Abnormalitas spermaatozoa dibagi menjadi 2 kelompok yaitu abnormalitas primer dan

sekunder. Abnormalitas primer yaitu abnormalitas yang terjadi selama proses

spermatogenesis. Sedangkan abnormalitas sekunder adalah abnormalitas yang terjadi

karena pengaruh lingkungan. Keberadaan abnormalitas spermatozoa dalam jumlah

tertentu (di bawah 5%) merupakan kondisi yang normal sebagai bentuk abnormalitas

primer. Enam kelainan kepala (kepala besar, kepala kecil, pyriform kepala, kepala

runcing, kepala ganda dan kepala amorf), dua kelainan dari bagian tengah (tetesan

sitoplasma dan leher bengkok) dan empat kelainan ekor (digulung ekor, ekor

membungkuk , ekor patah dan ekor ganda) dievaluasi dalam setiap kelompok laki-laki

(Venkatesh, 2009).

Penggunaan larutan fisiologis pada praktikum analisis kualitas sperma adalah

larutan NaCl fisiologis dan pewarna eosin. Larutan fisiologis dapat menambah daya

viabilitas dan motilitas spermatozoa. Penggunaan larutan fisiologis yang mengandung

NaCl dan urea dapat mempertahankan daya hidup spermatozoa antara 20-25 menit.

Larutan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain larutan NaCl yang digunakan

untuk pengenceran. Larutan eosin untuk mewarnai sediaan apus spermatozoa

(Partodihajo, 1990).

Faktor-faktor yang mempengaruhi kualitas dan kuantitas sperma adalah

temperature, kandungan zat makanan dan larutan fisiologis. Aktivitas metabolisme dan

gerakan spermatozoa akan normal pada suhu tubuh dan akan meningkat kecepatannya

jika suhunya meningkat. Kandungan zat makanan misalnya fruktosa merupakan substrat

energi utama di dalam plasma sperma. Larutan fiologis dapat menambah daya viabilitas

dan motilitas spermatozoa (Yatim, 1982)

Daya fertilisasi sangat ditentukan oleh kualitas telur, sperma, media dan

penanganan manusia. Telur yang terfertilisasi terlihat dari warna telur yang bening.

Telur yang perkembangannya sehat adalah berwarna transparan dan bersih, sehingga

mudah dibedakan dengan telur yang mati. Morfologi (bentuk dan struktur) sperma juga

tak kalah pentingnya dalam menentukan keberhasilan pembuahan. Bila sepertiga dari

jumlah sperma yang dihasilkan memiliki bentuk dan struktur yang normal maka

kemungkinan terjadinya pembuahan juga makin tinggi. Jika ada bagian dari sepasang

kromosom homolog tidak bergerak memisahkan diri pada waktu mitosis, satu gamet

menerima dua jenis kromosom yang sama dan gamet lainnya tidak mendapatkan

kromosom. Jika salah satu gamet yang menyimpang bersatu dengan gamet normal pada

waktu pembuahan, maka keturunannya akan memiliki jumlah kromosom yang

abnormal. Bila organisme tersebut mampu bertahan hidup, organisme tersebut akan

memperlihatkan sejumlah gejala yang disebabkan oleh abnormalnya jumlah gen yang

terletak pada kromosom tambahan atau kromosom yang hilang. Abnormalitas terjadi

diduga saat pemberian kejutan suhu panas ada sebagian telur yang belum bisa

mengembalikan jumlah kromosom yang berkurang pada saat proses perkembangan telur

yang diinginkan, yaitu menghasilkan sigot diploid (2n) dan telah mengalami modifikasi

kromosom, sehingga sebagian telur yang menetas pada tiap perlakuan ada yang

menghasilkan larva abnormal (Subekti,2009).

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Volume sperma yang dihasilkan adalah 1,26 ml.

2. Viskositas sperma yang dihasilkan adalah 10 menit

3. Bau sperma yang dihasilkan adalah bau amis

4. Warna sperma yang dihasilkan adalah putih susu

5. pH sperma 8,5 yang berarti basa.

6. Persentase sperma motil adalah 0 % dan sperma non motil adalah 100 %.

7. Jumlah total spermatozoa adalah 2x109 sel/ml.

8. Kualitas dan kuantitas spermatozoa kurang baik sebab berdasarkan pengamatan

terdapat beberapa hasil yang tidak sesuai dengan pustaka diantaranya yaitu persentase

spermatozoa motil dan non motil dan pH sehingga tingkat keberhasilan spermatozoa

untuk membuahi sel telurnya adalah kecil.

B. Saran

1. Sebaiknya pengamatan motilitas spermatozoa segera setelah dilakukan pengenceran

supaya masih dapat terlihat sperma yang motil.

2. Sebaiknya penghitungan jumlah total spermatozoa menggunakan alat bantu yang

lebih akurat sehingga tidak salah dalam penghitungannya.

DAFTAR REFERENSI

Condro, Herdianto Sapto. 2012. Pengaruh Penambahan Madu Pada Media Pengencer NaCl Fisiologis Dalam Proses Penyimpanan Sperma Terhadap Kualitas Sperma Ikan Komet (Carassius auratus auratus). Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga. Surabaya.

Meirnawati, setyana, dkk. 2011. Daya Fertilisasi Sperma Beku Ikan Tawes (Puntius javanicus) Setelah Disimpan Dengan Fruktosa Dan Tris Aminomethan. Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga. Surabaya.

Melati. 2011. Penggunaan Larutan Elektrolit Pada Suhu Yang Berbeda Untuk mempertahankan Motilitas dan viabiltas sperma Ikan Mas (Cyprinus carpio). IPB. Bogor.

Partodiharjo, Soebadi. 1990. Ilmu Reproduksi Hewan. Mutiara Sumber Widya, Surabaya.

Paxton, M. J. W. 1986. Endocrinology, Biologycal and Medical Prespective. Wm. C.

Putra, Ridwan Manda. 2010. Pengaruh Kombinasi Penyuntikan hCG Dan Ekstrak Kelenjar Hipofisa Ikan Mas Terhadap Volume Semen Dan Kualitas Serma Ikan Pantau (Rasbora lateristriata Blkr). Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Riau. Riau.

Subekti. 2009. Pengaruh Kejutan Suhu Panas Dan Lama Waktu Setelah Pembuahan Terhadap Daya Tetas Dan Abnormalitas Larva Ikan Nila (Oreochromis niloticus). Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga. Surabaya.

Venkatesh, S. Singh, G, Gupta N.P, Kumar. R, Deecaraman. M, Dada R. 2009. Correlation of sperm morphology and oxidative stress in infertile men. Iranian Journal of Reproductive Medicine. 7 (1): 29-34.

Yatim, W. 1982. Reproduksi dan Embriologi. Tarsito, Bandung.