7 pembelajaran 6.docx

77Modul Teknik Analisis Biologi Molekuler

http://file.upi.edu/Direktori/FPMIPA/JUR._PEND._BIOLOGI/196305011988031-

Setelah mengikuti pembelajaran 6 ini Anda diharapkan mampu:

1. Menjelaskan prosedur analisis hasil PAGE menggunakan GENPOP.

2. Menghitung nilai frekuensi alel, heterozigositas, dan PIC.

3. Menjelaskan makna analisis hasil PAGE (frekuensi alel, heterozigositas, dan PIC)

dengan GENPOP pada suatu populasi.

Kerbau lokal di Kabupaten Sleman telah diteliti keragaman genetiknya, yaitu pada

Kecamatan Seyegan dan Kecamatan Gamping. Primer yang digunakan dalam PCR adalah

HEL009, INRA023, dan INRA032. Primer tersebut dipilih berdasarkan penelitian

sebelumnya terkait mikrosatelit pada kerbau. Primer inilah yang menunjukkan lokus DNA

kerbau yang diteliti.

Analisis data dilakukan setelah diperoleh data dari hasil elektroforesis gel

poliakrilamid. Diperlukan keahlian khusus dalam membaca data pada gel hasil

elektroforesis agar data benar-benar valid. Hal ini dikarenakan pembacaan data pada gel

sangat dipengaruhi oleh interpretasi masing-masing orang, sehingga rawan terjadi

perbedaan interpretasi antara satu orang dengan orang lain.

Gel hasil elektroforesis akan menghasilkan pita-pita DNA yang menggambarkan

keanekaragaman genetik individu tersebut. Data pita-pita DNA yang diperoleh dari penanda

Pembelajaran 6: ANALISIS HASIL PAGE MENGGUNAKAN GENPOP

A. ANALISIS HASIL ELEKTROFORESIS MENGGUNAKAN GENPOP

PEMBELAJARAN 6

ANALISIS HASIL PAGE MENGGUNAKAN GENPOP

TUJUAN

URAIAN MATERI

http://file.upi.edu/Direktori/FPMIPA/JUR._PEND._BIOLOGI/196305011988031-

78 Modul Teknik Analisis Biologi Molekuler

mikrosatelit harus dirubah dahulu ke dalam bentuk ukuran pasangan basa (base pair) atau

berupa pasangan alel, setelah itu baru dapat dimasukkan dalam proses analisis.

Proses analisis dapat menggunakan bantuan computer dengan beberapa program

seperti popgen, genpop, dan NTSYS. Pada pembahasan kali ini hanya akan diuraikan tentang

penggunaan program genpop yang dapat diakses di internet dan digunakan secara online.

Genpop merupakan program untuk analisis genetika populasi yang dikembangkan oleh

Michel Raymond dan Francois Rousset dari Laboratorie de Genetique et Environment,

Montpellier, Perancis.

Data yang digunakan adalah data dari gel elektroforesis poliakrilamid. Dari data

tersebut diamati ada beberapa alel. Kemudian ukurannya dilihat dan dibandingkan dengan

marker yang ada (alel tersebut berada pada berapa pasang basa). Untuk dapat menentukan

berapa alel dalam setiap sampel memerlukan kejelian dan pengalaman. Agar hasil lebih

akurat dapat meminta bantuan peneliti yang lebih ahli. Selanjutnya data berupa angka

pasang basa dimasukkan dalam program dan dianalisis.

Contoh hasil elektroforesis gel poliakrilamid lokus INRA032 yang menunjukkan posisi

ukuran alel.

Gambar 6.1. Gel hasil elektroforesisHasil penelitian dan analisis oleh dosen ahli diperoleh banyaknya alel pada lokus


B. KEGIATAN

Marker Sy1 Sy2 Sy3 Sy4 Sy5 Sy6 Sy7 Sy8 G1

100 bp

Alel 50bp


HEL009, INRA023, dan INRA032 seperti ditunjukkan pada tabel-tabel berikut:

Tabel 6.1 Ukuran Alel Sampel Kerbau di Kabupaten Sleman Menggunakan Primer HEL009Kec Seyegan Ukuran Alel (bp) Kec. Gamping Ukuran Alel (bp)

Sy1 220 G1 200Sy2 200 G2 075 dan 200Sy3 200 dan 220 G3 075 dan 200Sy4 075 dan 200 G4 075 dan 200Sy5 075 dan 220 G5 075Sy6 200 G6 075 dan 200Sy7 200 G7 075 dan 200Sy8 200 G8 075 dan 200

G9 075 dan 200G10 075 dan 200

Tabel 6.2 Ukuran Alel Sampel Kerbau di Kabupaten Sleman Menggunakan Primer INRA023Kec Seyegan Ukuran Alel (bp) Kec. Gamping Ukuran Alel (bp)

Sy1 100 G1 100 dan 170Sy2 100 G2 500Sy3 100 G3 200 dan 500Sy4 100 G4 500Sy5 170 dan 200 G5 500Sy6 100 G6 500Sy7 100 G7 500Sy8 100 G8 500

G9 500G10 500

Tabel 6.3 Ukuran Alel Sampel Kerbau di Kabupaten Sleman Menggunakan Primer INRA032Kec Seyegan Ukuran Alel (bp) Kec. Gamping Ukuran Alel (bp)

Sy1 400 G1 400Sy2 400 G2 150 dan 400Sy3 400 G3 050Sy4 400 G4 400Sy5 050 dan 400 G5 150 dan 400Sy6 050 G6 150 dan 170Sy7 050 G7 170Sy8 400 G8 150 dan 70

G9 170G10 170

Selanjutnya, data alel tersebut dianalisis dengan GENPOP. Format input data pada

genpop adalah:

Baris pertama adalah banyak populasi dan loci (lokus).

Baris kedua adalah nama lokus, dalam hal ini adalah primer mikrosatelit. Misalnya INRA

32.

Baris selanjutnya adalah nama populasi, yaitu dengan mengetik “POP” atau “pop” untuk

membedakan populasi satu dengan yang lain.

Dibawah nama populasi adalah alel data mikrosatelit dengan menuliskan nama individu



dilanjutkan dengan nilai ukuran alel mikrosatelit seperti “indv1, (3 spasi) 100100.

Perhatikan contoh format input data berikut ini:

input file (2 pop, 3 loci)loc HEL09loc INRA23loc INRA32

popIndv1, 220220 100100 400400Indv2, 200200 100100 400400Indv3, 200220 100100 400400Indv4, 075200 190200 400400Indv5, 075220 170200 050400Indv6, 200200 100100 050050Indv7, 200200 100100 050050pop1, 200200 100100 400400

popIndv1, 200200 100170 400400Indv2, 075200 500500 150400Indv3, 075200 200500 050050Indv4, 075200 500500 400400Indv5, 075075 500500 150400Indv6, 075200 500500 150170Indv7, 075200 500500 170170Indv8, 075200 500500 150170Indv9, 075200 500500 170170pop2, 075200 500500 170170

Selanjutnya, lakukan analisis data menggunakan GENPOP dengan cara:

Masuk ke laman genpop di alamat http://genpop.curtin.edu.au/.

Klik option ke 5 (Basic information, Fis and gene diversities).

Pada suboption & parameters perhatikan Gene diversities & Fis, pilihlah yang

diploid.

Masukkan data yang sudah diketik di Ms. Word seperti data pada contoh diatas,

masukkan pada kolom input data dengan cara mengcopy-paste.

Klik submit data untuk memulai analisis.

Dari data yang didapatkan berikut, kemudian dianalisis nilai frekuensi alel, heterozigositas,

dan PIC.

============================================= Pop: pop1 Locus: loc HEL09----------------------------------------- Genotypic matrix:


http://genpop.curtin.edu.au/


75 200 220 ____________ 75 0 200 1 4 220 1 1 1 Genotypes Obs. Expected 75 , 75 0 0.0667 200 , 75 1 1.3333 200 , 200 4 3.0000 220 , 75 1 0.5333 220 , 200 1 2.6667 220 , 220 1 0.4000 Expected number of homozygotes : 3.4667 Observed number of homozygotes : 5 Expected number of heterozygotes: 4.5333 Observed number of heterozygotes: 3

Allele frequencies and Fis: (Mencari Frekuensi Alel) ------------------------------------------------------- Fis ---------------- Allele Sample count Frequency W&C R&H 75 2 (A) 0.1250 -0.0769 200 10 0.6250 0.5172 220 4 0.2500 0.3913 Tot 16 0.3538 0.2321 -------------------------------------------------------Pop: pop1 Locus: loc INRA23-----------------------------------------

Genotypic matrix: 100 170 190 200 ________________ 100 6 170 0 0 190 0 0 0 200 0 1 1 0 Genotypes Obs. Expected 100 , 100 6 4.4000 170 , 100 0 0.8000 170 , 170 0 0.0000 190 , 100 0 0.8000 190 , 170 0 0.0667 190 , 190 0 0.0000 200 , 100 0 1.6000 200 , 170 1 0.1333 200 , 190 1 0.1333 200 , 200 0 0.0667

Expected number of homozygotes : 4.4667 Observed number of homozygotes : 6 Expected number of heterozygotes: 3.5333 Observed number of heterozygotes: 2

Allele frequencies and Fis:



------------------------------------------------------- Fis ---------------- Allele Sample count Frequency W&C R&H 100 12 0.7500 1.0000 170 1 0.0625 0.0000 190 1 0.0625 0.0000 200 2 0.1250 -0.0769 Tot 16 0.4510 0.0714 -------------------------------------------------------Pop: pop1 Locus: loc INRA32----------------------------------------- Genotypic matrix: 50 400 ________ 50 2 400 1 5

Genotypes Obs. Expected 50 , 50 2 0.6667 400 , 50 1 3.6667 400 , 400 5 3.6667 Expected number of homozygotes : 4.3333 Observed number of homozygotes : 7 Expected number of heterozygotes: 3.6667 Observed number of heterozygotes: 1

Allele frequencies and Fis: ------------------------------------------------------- Fis ---------------- Allele Sample count Frequency W&C R&H 50 5 0.3125 0.7407 400 11 0.6875 0.7407 Tot 16 0.7407 0.8312 -------------------------------------------------------Pop: pop2 Locus: loc HEL09----------------------------------------- Genotypic matrix: 75 200 ________ 75 1 200 8 1

Genotypes Obs. Expected 75 , 75 1 2.3684 200 , 75 8 5.2632 200 , 200 1 2.3684

Expected number of homozygotes : 4.7368 Observed number of homozygotes : 2 Expected number of heterozygotes: 5.2632 Observed number of heterozygotes: 8

Allele frequencies and Fis:



------------------------------------------------------- Fis ---------------- Allele Sample count Frequency W&C R&H 75 10 0.5000 -0.5652 200 10 0.5000 -0.5652 Tot 20 -0.5652 -0.5778 -------------------------------------------------------Pop: pop2 Locus: loc INRA23----------------------------------------- Genotypic matrix: 100 170 200 500 ________________ 100 0 170 1 0 200 0 0 0 500 0 0 1 8 Genotypes Obs. Expected 100 , 100 0 0.0000 170 , 100 1 0.0526 170 , 170 0 0.0000 200 , 100 0 0.0526 200 , 170 0 0.0526 200 , 200 0 0.0000 500 , 100 0 0.8947 500 , 170 0 0.8947 500 , 200 1 0.8947 500 , 500 8 7.1579 Expected number of homozygotes : 7.1579 Observed number of homozygotes : 8 Expected number of heterozygotes: 2.8421 Observed number of heterozygotes: 2

Allele frequencies and Fis: ------------------------------------------------------- Fis ---------------- Allele Sample count Frequency W&C R&H 100 1 0.0500 -0.0000 170 1 0.0500 -0.0000 200 1 0.0500 -0.0000 500 17 0.8500 0.6400 Tot 20 0.3077 0.0349 -------------------------------------------------------Pop: pop2 Locus: loc INRA32----------------------------------------- Genotypic matrix: 50 150 170 400 ________________ 50 1 150 0 0 170 0 2 3 400 0 2 0 2 Genotypes Obs. Expected 50 , 50 1 0.0526 150 , 50 0 0.4211



150 , 150 0 0.3158 170 , 50 0 0.8421 170 , 150 2 1.6842 170 , 170 3 1.4737 400 , 50 0 0.6316 400 , 150 2 1.2632 400 , 170 0 2.5263 400 , 400 2 0.7895 Expected number of homozygotes : 2.6316 Observed number of homozygotes : 6 Expected number of heterozygotes: 7.3684 Observed number of heterozygotes: 4

Allele frequencies and Fis: ------------------------------------------------------- Fis ---------------- Allele Sample count Frequency W&C R&H 50 2 0.1000 1.0000 150 4 0.2000 -0.2000 170 8 0.4000 0.6170 400 6 0.3000 0.5610 Tot 20 0.4706 0.5540 -------------------------------------------------------

Untuk mencari frekuensi alel

Untuk mencari heterozigositas

Frekuensi Alel

Secara ringkas, frekuensi alel tiap lokus mikrosatelit pada sampel kerbau lokal

Kabupaten Sleman adalah berikut:

Tabel 6.4 Frekuensi Alel Tiap Lokus Mikrosatelit pada Sampel Kerbau Lokal Kabupaten Sleman

LokusAlel (base pair/bp)

Frekuensi AlelSampel Kerbau

Kecamatan SeyeganSampel Kerbau

Kecamatan Gamping

HEL 00975

200220

0,12500,62500,2500

0,50000,5000

-

INRA 023

100170190200500

0,75000,06250,06250,1250

0,05000,0500

-0,05000,8500

INRA 032

50150170400

0,3125--

0,6875

0,10000,20000,40000,3000

Berdasarkan hasil perhitungan frekuensi alel dan jumlah alel yang tampak pada tiap

lokus mikrosatelit pada sampel kerbau di Kabupaten Sleman (Tabel 6.4), dapat diketahui



bahwa lokus HEL 009, INRA 023, dan INRA 032 bersifat polimorfik. Lokus termasuk

polimorfik apabila terdapat dua atau lebih alel yang tampak dalam suatu populasi dan

umumnya memiliki frekuensi alel sama atau kurang dari 0,99. Nilai frekuensi alel ini

selanjutnya digunakan untuk menghitung nilai heterozigositas.

Heterozigositas

Setelah diketahui nilai frekuensi alel, maka analisis dilanjutkan dengan

menentukan nilai heterozigositas. Heterozigositas terdiri atas observed

heterozigosity (heterozigositas yang teramati) dan expected heterozigosity

(heterozigositas yang diharapkan). Keduanya dihitung dengan cara:

Lokus Hel 09, populasi kerbau Kecamatan Seyegan

Observed Heterozigosity = Jumlah individuheterozigot (lihat padahasil genpop)

jumlah keseluruhan individu

x100%

= 38

= 0,375 X100%= 37,5%

Expected Heterozigosity = nn−1

(1 – Σpi2) x100%

= 87

(1 - (0,1252 + 0,6252 + 0,252) x 100%

= 1,14 (1 – (0,0156 + 0,3906 + 0,0625) x100%= 1,14 (1-0.4687) x100%= 1,14 x 0,5313 x100%= 0,606 x 100%= 60,6%

Setelah dilakukan penghitungan untuk semua lokus, akan diperoleh hasil seperti pada Tabel

6.5.

Tabel 6.5 Nilai Heterozigositas Tiap Lokus Mikrosatelit pada Sampel Kerbau Lokal Kabupaten Sleman

LokusSampel kerbau Kecamatan

SeyeganSampel kerbau Kecamatan

GampingObs. Het* Expc. Het** Obs. Het* Expc. Het**

HEL 009 37,5% 60,6% 80% 55%INRA 023 25 % 47,2% 20% 30%INRA 032 12,5% 49% 40% 35,7%Rata-rata 25% 52,3% 46,7% 40,2%

Keterangan:*Observed Heterozygosity**Expected Heterozygosity



Rata-rata nilai heterozigositas teramati pada sampel kerbau Kecamatan

Seyegan menunjukkan nilai yang lebih rendah dari pada Kecamatan Gamping.

Berarti variasi genetik kerbau di Kecamatan Gamping lebih tinggi dibandingkan

Kecamatan Seyegan. Namun, nilai heterozigositas teramati di Kecamatan Seyegan

masih lebih dari 20% sehingga masih dibatas kewajaran untuk populasi kerbau

lokal. Populasi yang diamati adalah populasi kerbau lokal yang didomestikasi,

sehingga besar kemungkinannya terjadi persilangan satu pejantan untuk banyak

betina, akibatnya keragamannya rendah. Bila nilai heterozigositas teramati kurang

dari 20%, dimungkinkan telah terjadi inbreeding (perkawinan sedarah). Perkawinan

ini menyebabkan menurunya sifat fenotip seperti ukuran tubuh, fertilisasi, dan daya

tahan tubuh. Nilai rerata heterozigositas teramati di Kecamatan Seyegan lebih

rendah dibandingkan dengan heterozigositas yang diharapkan. Hal ini terjadi karena

kurangnya sampel kerbau dari Kecamatan Seyegan.

PIC (Polymorphism Information Content)

Nilai polimorfisme dalam lokus dapat diketahui dengan melakukan penghitungan

PIC. Nilai PIC berbanding lurus dengan jumlah alel dalam setiap lokus. Semakin tinggi

jumlah alel, maka nilai PIC akan semakin tinggi pula. PIC ditentukan hasilnya menggunakan

nilai frekuensi alel dengan penghitungan berikut:

Lokus Hel 09, populasi Kerbau Kecamatan Seyegan

PIC = 1 – ∑i=1

k

pi2 - ∑i=1

k

2 Pi2Pj2

= 1 - (0,1252 + 0,6252 + 0,252) – ((2x0,1252 x 0,6252)+(2x0,6252x 0,252))= 1-0,4687-((2x0,0156x0,3906)+(2x0,3906x0,0625))= 1-0,4687-(0,0122+0,0488)=1-0,4687- 0,061= 0,470

Setelah semua nilai PIC dihitung, akan diperoleh hasil seperti pada Tabel 6.6.

Tabel 6.6 Nilai PIC Tiap Lokus Mikrosatelit pada Sampel Kerbau Lokal Kabupaten SlemanLokus Sampel kerbau Kecamatan

SeyeganSampel kerbau Kecamatan

GampingRata-rata

HEL09 0,470 0,375 0,332INRA023 0,409 0,266 0,370INRA032 0,337 0,240 0,286

Nilai PIC (Polymorphism Information Content) merupakan parameter

yang mengindikasikan derajat keinformatifan dari sebuah penanda genetik.



Berdasarkan hasil penelitian, diketahui bahwa pada populasi Kecamatan

Seyegan, lokus HEL009 memiliki nilai PIC (0,470) paling tinggi dibading

dengan lokus lain, yaitu INRA023 (0,409) dan INRA032 (0,337). Sama halnya

dengan populasi di Kecamatan Gamping, nilai PIC lokus HEL009 (0,375)

paling tinggi dibandingkan lokus INRA023 (0,266) dan INRA032 (0,240). Dari

kedua populasi tersebut, nilai PIC paling tinggi terdapat pada lokus HEL009.

Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa lokus HEL009 memiliki derajat

keinformatifan lebih tinggi dibandingkan lokus lain. Artinya, lokus HEL09

mampu menggambarkan tingkat keanekaragaman genetik pada kedua

populasi kerbau. Lokus dengan nilai PIC mendekati 1 merupakan lokus yang

sangat diinginkan. PIC merupakan sebuah parameter yang mengindikasikan

adanya variasi genetik. Penanda dengan nilai PIC yang tinggi merupakan

marker yang sangat informatif.

Gel hasil elektroforesis akan menghasilkan pita-pita DNA yang

menggambarkan keanekaragaman genetik individu tersebut. Data pita-pita DNA

yang diperoleh dari penanda mikrosatelit harus dirubah dahulu ke dalam bentuk

ukuran pasangan basa (base pair) atau berupa pasangan alel, setelah itu baru dapat

dimasukkan dalam proses analisis. Analisis dapat dilakukan menggunakan GENPOP.

Dari analisis yang dilakukan, akan menghasilkan nilai frekuensi alel, heterozigositas,

dan PIC.

Setelah membaca uraian materi di atas, sekarang saatnya Anda beraksi.

Carilah penelitian terkait variasi genetik kerbau lokal di Indonesi melalui jurnal-jurnal

penelitian, lalu kritisilah jurnal tersebut meliputi:


AKSI

RANGKUMAN


- Kerbau daerah mana yang diteliti?

- Apa manfaat penelitian tersebut?

- Informasi penting apa yang dapat kalian temukan?

- Hal baru apa yang menarik bagimu?

Tulislah hasil analisis kritismu dan saling bertukarlah dengan teman, sehingga banyak ilmu

yang Anda dapatkan.

SUDAH SIAPKAH ANDA MELAKUKAN ANALISIS HASIL PAGE MENGGUNAKAN GENPOP?

1. Perhatikanlah tabel berikut!

Desa A Ukuran Alel (bp) pada lokus HEL009

Ukuran Alel (bp) lokus INRA023

S1 100 dan 170 200S2 200 500S3 200 200 dan 500S4 100 500S5 170 dan 200 500S6 170 200 dan 500S7 100 500S8 100 500

Apabila hasil elektroforesis satu populasi diperoleh alel dengan berat molekul seperti pada

tabel tersebut, tulislah data tersebut dengan format yang benar agar dapat diinput dalam

program GENPOP! (skor 5)

2. Perhatikan hasil analisis 8 sampel menggunakan GENPOP berikut:

Detailed analyses============================================= Pop: pop1 Locus: loc HEL09----------------------------------------- Genotypic matrix: 40 50 70 80 ________________ 40 0 50 0 1 70 1 2 0 80 0 2 2 0 Genotypes Obs. Expected 40 , 40 0 0.0000 50 , 40 0 0.4000 50 , 50 1 1.0000 70 , 40 1 0.3333 70 , 50 2 2.0000


UJI PEMAHAMAN


70 , 70 0 0.6667 80 , 40 0 0.2667 80 , 50 2 1.6000 80 , 70 2 1.3333 80 , 80 0 0.4000 Expected number of homozygotes : 2.0667 Observed number of homozygotes : 1 Expected number of heterozygotes: 5.9333 Observed number of heterozygotes: 7

Allele frequencies and Fis: ------------------------------------------------------- Fis ---------------- Allele Sample count Frequency W&C R&H 40 1 0.0625 0.0000 50 6 0.3750 0.0000 70 5 0.3125 -0.4000 80 4 0.2500 -0.2727 Tot 16 -0.1951 -0.1667 -------------------------------------------------------

Berdasarkan hasil analisis dari 8 sampel menggunakan GENPOP tersebut, tentukanlah:

a. Nilai frekuensi alel (skor 1)

b. Nilai heterozigositas (heterozigositas teramati dan heterozigositas diharapkan) (skor 2)

c. Nilai PIC (skor 2)

3. Perhatikanlah tabel di bawah ini!

LokusAlel (base pair/bp)

Frekuensi AlelSampel Kerbau Desa A Sampel Kerbau Desa B

HEL 009

40507080

0,060,380,310,25

-0,880,13

-

INRA 023

190200220230

0,630,310,060,51

0,750,13

-0,13

Tabel diatas adalah nilai frekuensi alel populasi kerbau di Madura. Jelaskan makna dari nilai

frekuensi alel kedua populasi tersebut! (skor 5)


LokusSampel kerbau Desa A Sampel kerbau Desa B

Obs. Het Expc. Het Obs. Het* Expc. HetHEL 009 88% 79% 25% 25%INRA 023 75% 58% 38% 47%Rata-rata 82% 69% 32% 36%

Tabel diatas adalah nilai heterozigositas populasi kerbau di Madura. Jelaskan makna dari nilai

heterozigositas kedua populasi tersebut! (skor 5)




Lokus Sampel kerbau Desa A Sampel kerbau Desa B Rata-rataHEL09 0,70 0,30 0,50INRA023 0,10 0,25 0,18

Tabel diatas adalah nilai PIC populasi kerbau di suatu daerah. Jelaskan makna dari nilai PIC kedua

populasi tersebut! (skor 5)


UMPAN BALIK

Untuk mengetahui apakah Anda sudah memahami pembelajaran 6 atau belum, hitunglah

skor Anda dengan cara:

Skor = jumlah jawabanbenar

25 x 100

Ketentuan:

Bila skor ≥ 75, Anda boleh melanjutkan ke Evaluasi Akhir.

Bila skor < 75, Anda harus mengulangi belajar pada Pembelajaran 6 dan melakukan uji

pemahaman lagi.

Bila Anda telah mengulangi belajar Pembelajaran 6 namun tetap tidak mencapai nilai ≥

75, belajarlah bersama teman dan minta arahan dari dosen.

7 pembelajaran 6.docx

Documents