Metode spektrofotometri derivative telah diaplikasikan secara luas di dalam kimia analisis kuantitatif, analisis lingkungan, farmasetik, klinik, forensik, biomedik, dan industri). Spektrofotometri derivatif merupakan metode manipulatif terhadap spektra pada spektrofotometri ultraviolet dan cahaya tampak. Pada spektrofotometri konvensional, spektrum serapan merupakan plot serapan (A) terhadap panjang gelombang (). Pada metode spektrofotometri derivatif, plot A lawan , ditransformasikan menjadi plot dA/d lawan e untuk derivatif pertama, dan d2A/ d2 lawan untuk derivatif kedua (Hayun, dkk, 2006). Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang biasa digunakan untuk analisa kimia kuantitatif, tapi dapat juga digunakan untuk analisa kimia semi kualitatif yang memiliki prinsip kerja berdasarkan fenomena penyerapan sinar oleh spesi kimia tertentu pada daerah ultraviolet dan sinar tampak (visibel). Meskipun analisa ini tidak sepeka dengan menggunakan teknologi nuklir, analisa dengan spektrofotometri sinar tampak (colourimetry) mudah dilakukan, karena warna adalah salah satu kriteria fisiko-kimia untuk mengidentifikasi suatu objek. Pada analisa spektrokimia, spektrum radiasi elektromagnetik digunakan untuk menganalisa spesies kimia. Sesuai dengan persamaan Planck, E = h v, dengan E adalah energi foton, h adalah tetapan Planck (6,62 x 10-34 J.s) dan v adalah frekuensi foton, di mana frekuensi tertentu memiliki energi tertentu. Karena setiap spesi kimia memiliki tingkatan energi tertentu, maka transisi energinya juga berbeda-beda (Huda, 2001). Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu yang digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blanko dengan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding. Monokromator pada spektrofotometer digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis dengan alat berupa prisma yang mengarahkan sinar monokromatis yang dinginkan dari hasil penguraian melalui celah, sehingga prisma yang dirotasikan dapat memperoleh panjang gelombang yang diinginkan (Khopkar, 2010). Pengukuran konsentrasi sampel dengan menggunakan metode metode ini berdasarkan hukum Lambert-Beer, yang menyatakan hubungan antara banyaknya sinar yang diserap sebanding dengan konsentrasi unsur dalam sampel yang secara matematis dijabarkan sebagai berikut : A = log I/Io atau A = a.b.c, di mana A adalah absorbansi, a merupakan koefisien serapan molar, b merupakan tebal kuvet yang dilewati oleh sinar, serta c merupakan unsur dalam sampel. Io menyatakan intensitas sinar mula-mula, I merupakan intensitas sinar yang diteruskan. Aplikasi persamaan tersebut juga menggunakan kurva kalibrasi dari hubungan konsentrasi larutan standar terhadap nilai absorbansinya dengan adanya persamaan regresi dari kurva kalibrasi tersebut (Fatimah, dkk, 2009). Analisa suatu sampel dengan spektrofotometri sinar tampak biasanya meliputi beberapa tahap, antara lain pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar tampak (pewarnaan), pemilihan panjang gelombang, pembuatan kurva kalibrasi, dan pengukuran absorban suatu sampel. Untuk keperluan analisa kuantitatif, pengukuran biasanya dilakukan pada panjang gelombang optimum yang dikarenakan pada panjang gelombang optimum, dihasilkan koefisien ekstrinski molar tertinggi sehingga diperoleh pengukuran yang lebih peka. Sampel dengan konsentrasi yang sama menghasilkan absorban yang lebih tinggi dan kurva di sekitar panjang gelombang optimum relatif landai sehingga pergeseran panjang gelombang optimum hanya sedikit berpengaruh pada absorban. Dengan demikian, kesalahan akibat pergeseran panjang gelombang dapat dihindari (Huda, 2001).

Metode spektrofotometri yang digunakan tersebut memiliki prinsip dasar penyerapan atau absorpsi cahaya dalam emisi radiasi oleh molekul atau unsur yang terdapat dalam senyawa yang diamati, sehingga dilakukan pengukuran terhadap banyaknya sinar yang diserap terhadap frekuensi atau panjang gelombang yang digunakan sinar dan dibaca oleh alat sebagai suatu spektra absorpsi. Jika suatu senyawa menyerap suatu radiasi maka akan terjadi pengurangan kekuatan energi radiasi yang mencapai detektor. Kekuatan energi radiasi yang diabsorpsi oleh molekul atau senyawa dalam sampel yang terbaca sebagai suatu absorbansi dalam batas konsentrasi tertentu memiliki nilai yang sebanding dengan banyaknya molekul untuk mengabsorpsi radiasi atau cahaya dan kemudian dapat dijadikan rujukan untuk menganalisis suatu senyawa baik secara kuantitatif, maupun secara kualitatif. Metode spektrofotometri ini dapat digunakan untuk mengukur atau mengidentifikasi suatu larutan berwarna. Sistem kalorimeter yang digunakan terdiri dari sumber sinar yang monokromatis. Komponen alatnya berupa monokromator yang menguraikan sinar polikromatis menjadi monokromatis, dapat berupa filter penyerap sinar atau biasa dikenal juga sebagai prisma. Terdapat juga photomultifier yang menghitung besarnya intensitas sinar yang ditransmisikan oleh larutan sampel yang sedang diidentifikasi tersebut. Dalam identifikasi suatu senyawa juga dikenal dengan senyawa yang memiliki gugus kromofor. Kromofor merupakan gugus yang terdapat pada suatu senyawa yang dapat menyerap atau mengabsorpsi radiasi ultraviolet dekat dan daerah sinar tampak. Senyawa-senyawa yang memiliki gugus kromofor memiliki kemampuan untuk menunjukkan transisi elektronik. Hampir semua kromofor mempunyai ikatan yang tidak jenuh. Pada kromofor tersebut, transisi yang terjadi menyebabkan penyerapannya pada maksimum