LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SPORA

Kamis, 12 Maret 2015

Kelompok I

Kamis, Pukul 10.00 – 13.00 WIB

Nama NPM

Oryza Sativa Sinuhaji 260110130006

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

PEWARNAAN SPORA

I. TUJUAN

Mengamati endospora bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan

spora (pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia

yang terjadi dalam prosedur tersebut.

II. PRINSIP

2.1 Pewarnaan Spora

Pewarnaan spora yaitu mengenal dasar- dasar kimiawi pada pewarnaan

spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk

vegetatif.

2.2 Teknik Aseptis

Teknik aseptis adalah suatu metode atau teknik didalam memindahkan

atau menstranfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis

agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur. Teknik

transfer aseptis ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur microbial

yang harus diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis

mikrobiologi.

2.3 Impermeabilitas Spora

Dinding spora bersifat impermeabel, tetapi zat-zat warna dapat diserap

kedalamnya dengan jalan memanaskan preparat. Sifat impermeabel ini

mencegah dekolorisasi spora oleh alkohol bila diperlakukan dalam waktu yang

sama seperti pada dekolorisasi sel- sel vegetatif.

2.4 Penetrasi Zat Warna

Ketahanan endospora disebabkan adanya selubung spora yang keras dan

tebal. Sifat tersebut menyebabkan diperlukan perlakuan yang keras untuk

mewarnainya. Hanya dengan perlakuan panas yang cukup, pewarna yang

sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna tersebut memasuki

maka sukar dihilangkan.

III. TEORI DASAR

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha

mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri

mempunyai fungsi yang sama sepertti kristal amoeba, sebab bakteri dalam

bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kristal merupakan suatu fase di mana

kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap

faktor luar yang tidak menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada

bakteri merupakan tubuh dinding yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat

resisten. Dihasilkan oleh semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina.

Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi

selama banyak generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan

di dalam pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma

vegetatifnya yang di maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar, 2007).

Ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus

Bacillus dan genus Clostridium. Struktur spora yang terbentuk di dalam tubuh

vegetatif bakteri disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora)

yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, endospora

merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami

penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan. Dengan adanya

kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat bertahan pada

kondisi yang ekstrim. Bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat

hidup dan mengalami tahapan- tahapan pertumbuhan sampai beberapa

generasi, dan spora terbentuk melalui sintesis protoplasma baru didalam

sitoplasma sel vegetatifnya (Saman, 2013).

Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan

zat warna kepermukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan

membiasakan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya

ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat

warna basa, bagian yang berperan memberikan warna disebut Kromotor

bermuatan positif, zat warna asam yang berperan memiliki muatan negatif.

Zat warna basa lebih banyak digunakan karena memiliki muatan positif

antara lain Eosin, Congo Red dll. Contoh warna asam yaitu Crystal violet,

methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite green, dll (Hermawan,

2015).

Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar- dasar kimiawi pada

pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri

dan bentuk vegetatif. Prinsip pada pewarnaan ini pemanasan akan

mengembangkan lapisan luar spora sehingga berwarna hijau. Melalui

pendinginan utama akan terperangkap didalam spora dengan pencucian zat

warna utama yang da pada sel vegetatif akan terlepas, sehingga pada

pewarnaan yang kedua (safranin) sel vegetatif akan berwarna merah. Fungsi

zat warna malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat

berpenetrasi kedalam endospora (Dwidjoseputro, 2005).

Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat

apusan preparat. Kemudian preparat diberikan malakit hIjau yang berfungsi

sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas.

Preparat diuapkan diatas air mendidih dengan tujuan untuk memperbesar

pori- pori bakteri agar pada saat pewarnaan dapat menembus dinding

endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci

dengan air dialirkan dari atas, yang bertujuan untuk menghilangkan malacite

green dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaan safranin bertujuan untuk

counterstein yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain

dari pada endospora. Hasil uji bakteri Bacillus sp menghasilkan bakteri gram

positif. Prinsip pewarnaan spora didasarkan pada penggunaan zat warna

malachite green dan safranin dimana pada hasil pewarnaan akan

menghasilkan warna hijau pada spora dan warna merah pada sel vegetatifnya

(Lay 1994).

IV. ALAT DAN BAHAN

4.1 Alat

4.1.1 Bak pewarna

4.1.2 Botol semprot

4.1.3 Kaca objek

4.1.4 Kapas

4.1.5 Kertas saring

4.1.6 Korek api

4.1.7 Mikroskop

4.1.8 Ose

4.1.9 Pembakar spirtus

4.1.10 Penangas air

4.1.11 Penjepit kayu

4.1.12 Tabung reaksi

4.2 Bahan

4.2.1 Alkohol 70%

4.2.2 Aquades

4.2.3 H2SO4 1%

4.2.4 NaCl fisiologis

4.2.5 Suspensi padat bakteri Bacillus subtilis berumur 72 jam

4.2.6 Zat warna biru metilen

4.2.7 Zat warna karbol fuchsin

4.3 Gambar alat

Bak pewarna Botol Semprot Kaca objek Kapas

Kertas saring Korek Mikroskop Ose

Pembakar Spirtus Penangas air Penjepit kayu Tabung Rx

V. PROSEDUR KERJA

Semua alat dan bahan disiapkan, yaitu zat pewarna, pembakar spritus dan

korek api, ose, kaca objek, kapas, kertas saring, tabung reaksi dan waterbath.

Suspensi bakteri dibuat dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis dimasukkan

kedalam tabung reaksi dan ditambahkan karbol fuchsin dengan perbandingan

1:1. Campuran tersebut dipanaskan dalam waterbath suhu 80oC selama 10

menit. Kemudian kaca objek diambil dan dibersihkan menggunakan alkohol

70% sampai berdecit menggunakan kapas. Pembakar spritus kemudian

dinyalakan, ose diambil dan di fiksasi diatas pembakar spritus dan didinginkan

dekat api. Ose yang sudah dingin digunakan untuk mengambil suspensi

bakteri dengan cara membuka sumbat kasa dari tabung reaksi dekat dengan

api, kemudian ose dicelupkan dan diambil keluar, lalu mulut tabung reaksi dan

sumbatnya difiksasi dan ditutup. Suspensi bakteri diambil dan dibuat olesan

pada kaca objek, kemudian dilewatkan diatas api 3-5 kali dan diberi tanda

lingkaran pada sisi yang lain kaca objek. Kemudian olesan dilewatkan H2SO4

1% dan dibilas dengan aquades. Selanjutnya, zat pewarna biru metilen

diteteskan diatas kaca objek dan didiamkan 5 menit kemudian dibilas dengan

aquades dan dikeringkan menggunakan kertas saring. Kemudian kaca objek

diberi minyak imersi untuk dilihat dibawah mikroskop.

VI. DATA PENGAMATAN

Perlakuan Pengamatan

Biakan bakteri dan NaCl fisiologis

dimasukkan kedalam tabung reaksi

dan ditambahkan karbol fuchsin,

dipanaskan dalam waterbath suhu

80oC selama 10 menit

Diperoleh suspensi bakteri yang

telah diberi zat pewarna dalam

tabung reaksi ditutup sumbat kasa

Kaca objek dibersihkan dengan

menggunakan alkohol sampai

berdecit

Kaca objek bebas lemak

Ose difiksasi menggunakan

pembakar spirtus dan didinginkan

dekat api

Ose steril yang siap pakai

Suspensi bakteri dalam tabung

reaksi diambil menggunakan ose

dekat dengan api

Diperoleh suspensi bakteri pada ose

Fiksasi mulut tabung reaksi dan Tabung reaksi tetap steril

sumbat kapasnya kemudian ditutup

Suspensi dioleskan pada kaca objek

dan dilewatkan diatas api 3-5 kali

Olesan suspensi bakteri yang

menempel pada kaca objek

Kaca objek diberi lingkaran pada

salah satu sisi lain menggunakan

spidol

Terdapat daerah pengamatan

berbentuk lingkaran

Olesan dilewatkan H2SO4 1%,

dibilas dengan aquades

Olesan berwarna merah muda pucat

Genangi olesan dengan zat pewarna

biru metilen selama 5 menit, dibilas

dengan aquades

Olesan menjadi biru pucat hasil

bilasan

Kaca objek dikeringkan dan diberi

minyak imersi, diamati dibawah

mikroskop perbesaran tertentu

Terlihat sel vegetatif berwarna biru

dan sel spora bakteri berwarna

merah

Perbesaran 10 x 10

Perbesaran 10 x 100

VII. PEMBAHASAN

Praktikum Mikrobiologi Farmasi kali ini berjudul Pewarnaan Spora

dengan tujuan untuk mengamati endospora bakteri dengan menggunakan

prosedur pewarnaan spora (pewarnaan Klein) serta memahami setiap langkah

dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. Prinsip yang

berpengaruh pada praktikum ini adalah pewarnaan spora yaitu dasar kimiawi

pewarnaan spora dan kinerja prosedur untuk membedakan spora dan bentuk

vegetatif bakteri, teknik aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba

lain, sifat impermeabel spora yang mencegah dekolorisasi spora oleh alkohol

bila diperlakukan dalam waktu yang sama seperti pada dekolorisasi sel- sel

vegetatif, dan ketahanan endospora disebabkan adanya selubung spora yang

keras dan tebal. Dalam praktikum ini zat pewarna yang akan digunakan adalah

karbol fuchsin dan biru metilen serta asam sulfat dengan sampel berupa

suspensi bakteri Bacillus subtilis. Selain itu juga digunakan aquades untuk

membilas zat pewarna, dan minyak imersi untuk memperbesar penampakan

bakteri saat diamati menggunakan mikroskop. Alat- alat yang digunakan

antara lain, bak pewarna untuk menampung air bilasan zat pewarna, botol

semprot yang akan mengalirkan aquades, kaca objek untuk meletakkan sampel

diatas daerah pengamatan, kapas bebas lemak untuk membersihkan kaca

objek, kertas saring untuk mengeringkan kaca objek setelah pembilasan, korek

api untuk menyalakan pembakar spirtus, mikroskop untuk mengamati sampel

pada kaca objek, ose yang difiksasi untuk mengambil sampel, tabung reaksi

yang disumbat dengan kapas dan kasa berisi suspensi bakteri, waterbath untuk

memanaskan sampel, dan pembakar spirtus sebagai media pensterilisasi alat.

Langkah pengerjaannya dimulai dengan menyiapkan semua zat pewarna,

sampel suspensi bakteri dan alat- alat yang akan digunakan. Biakan bakteri

dan NaCl fisiologis dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan

karbol fuchsin, dipanaskan dalam waterbath suhu 80oC selama 10 menit,

maka akan diperoleh suspensi bakteri yang telah diberi zat pewarna dalam

tabung reaksi ditutup sumbat kasa dan siap digunakan. Ketahanan endospora

disebabkan adanya selubung spora yang keras dan tebal. Sifat tersebut

menyebabkan diperlukan perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya

dengan perlakuan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus

endospora. Tetapi sekali pewarna tersebut memasuki maka sukar dihilangkan.

Sehingga dilakukan pemanasan saat pencampuran antara suspensi bakteri

dengan karbol fuchsin dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya kaca objek

dibersihkan menggunakan kapas yang telah dibasahi dengan alkohol 70%

sampai berdecit yang menandakan bahwa pada kaca objek sudah tidak

terdapat lemak. Pembakar spirtus dinyalakan menggunakan korek api, ose

diambil dan difiksasi diatas pembakar spritus dan didinginkan dekat api

tujuannya untuk mensterilkan ose yang akan dipakai agar sampel tidak

tercampur dengan pengotor atau zat pencemar lainnya. Ose yang sudah dingin

digunakan untuk mengambil suspensi bakteri ke dalam tabung reaksi. Sampel

diambil dekat dengan api agar tidak ada sampel yang tercecer kemudian mulut

tabung reaksi dan sumbat kapas difiksasi dan ditutup dan dikemballikan ke

tempat semula. Sampel suspensi bakteri yang telah diambil menggunakan ose,

dioleskan pada bagian lingkaran pengamatan pada kaca objek dan dilewatkan

diatas api 3-5 kali agar sampel menempel pada kaca objek dan tidak ikut

terbilas saat pewarnaan. Ose yang telah digunakan kemudian difiksasi kembali

dan disimpan pada tempat semula agar rapi dan bersih. Kemudian salah satu

bagian kaca objek diberi tanda lingkaran menggunakan spidol yang

merupakan daerah pengamatan, sehingga akan memudahkan saat

menggunakan mikroskop. Kemudian, olesan dilewatkan H2SO4 1%, dan

segera dibilas dengan aquades sehingga warna olesan menjadi merah muda

pucat. H2SO4 1% menyebabkan terbentuknya pori-pori pada bakteri yang

memiliki banyak lapisan lemak (lipid larut dalam asam) sehingga warna dari

karbol fuchsin memudar dan zat pewarna tandingan dapat masuk

menggantikan. Kemudian, genangi olesan dengan zat pewarna biru metilen

selama 5 menit, dan dibilas dengan aquades sehingga olesan berwarna biru

pucat. Zat pewarna biru metilen merupakan pewarna tandingan, didiamkan

dalam waktu yang cukup lama karena sifat keras dari spora bakteri yang sulit

terwarnai. Kemudian, dilap dengan menggunakan kertas saring yaitu dengan

cara menepuk- nepuk kaca objek, kaca objek dilap bukan dengan digesek agar

sampel yang sudah menempel tidak ikut terangkat. Selanjutnya, ditetesi

minyak imersi agar diperoleh perbesaran yang lebih baik saat melakukan

pengamatan menggunakan mikroskop cahaya.

Hasil yang diperoleh dari pengamatan menggunakan mikroskop dengan

perbesaran 10 x 10 adalah terlihat bakteri berspora berwarna biru. Kemudian

dengan perbesaran 10 x 100 terlihat sel vegetatif dari bakteri berwarna biru

dan terlihat juga spora dari bakteri berwarna merah namun saling

bertumpukan karena ada kemungkinan saat pengolesan suspensi bakteri

kurang teliti dan tidak merata. Namun pada perbesaran 10 x 40 tidak terlihat

jelas penampakan spora bakteri maupun sel vegetatifnya.

Spora bakteri maupun sel vegetatifnya berwarna saat dilihat dibawah

mikroskop karena zat pewarna berhasil masuk dan menembus membran sel

dari bakteri tersebut. Saat melakukan pengamatan menggunakan mikroskop,

jumlah bakteri yang terlihat hanya sedikit, kemungkinan terjadi beberapa

kesalahan antara lain saat pengambilan sampel ose yang digunakan masih

cukup panas sehingga bakteri mati; zat pewarna yang terlalu cepat atau terlalu

banyak dibilas dengan aquades sehingga zat warna belum sempat masuk

kedalam sel bakteri; pengeringan bilasan zat warna terlalu ditekan; dan saat

melewatkan kaca objek diatas api terlalu lama menyebabkan bakteri mati.

VIII. KESIMPULAN DAN SARAN

8.1 Kesimpulan

Dari percobaan yang telah dilakukan diperoleh kesimpulan, yaitu metode

pewarnaan spora (pewarnaan Klein) terhadap suspensi bakteri Bacillus subtilis

dengan pewarna karbol fuchsin dan biru metilen dengan perbesaran mikroskop

10 x 10 dan 10 x 100 adalah sel vegetatif bakteri berwarna biru dan berbentuk

basil bercabang serta spora bakteri berwarna merah yang terletak pada tengah

sel bakteri dan ada juga yang menumpuk.

8.2 Saran

Untuk praktikum selanjutnya disarankan agar selama pengerjaan lebih

tenang dan tertib agar tidak mengganggu praktikan lain yang sedang bekerja.

Penggunaan ose setelah difiksasi harus didinginkan tersebih dahulu sebelum

mengambil sampel. Penggunaan suspensi bakteri dalam tabung reaksi kiranya

bergantian dan tidak egois. Dan setelah menggunakan alat dan bahan

dikembalikan ketempat semula agar tidak berantakan dan meja kerja tetap

bersih.

IX. DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Hermawan, M. 2014. Pewarnaan Gram available online at

http://www.academia.edu/6554037/5_Pewarnaan_Gram (diakses pada 13

Maret 2015).

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga

Grafindo Persada.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.

Saman, Andiesta. 2013. Pewarnaan Bakteri available online at

http://www.academia.edu/8884921/PEWARNAAN_BAKTERI (diakses

pada 17 Maret 2015).