UJI AKTIFITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID DARI BERAS HITAM (Oryza sativa L) DAN BERAS MERAH (Oryza sativa L) DENGAN

METODA SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS /PEREAKSI DPPH

Futri Mayanksari1, Adek Zamrud Adnan2, Yenni Sri Wahyuni1

1STIFI Bhakti Pertiwi, Palembang2Fakultas Farmasi Universitas Andalas, PadangEmail address: futri_mayanksari@ymail.com

ABSTRAK

Telah dilakukan penelitian uji aktivitas antioksidan dari beras hitam (Oryza sativa L) dan beras merah (Oryza sativa L) menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Identifikasi senyawa metabolit sekunder menggunakan kromatografi lapis tipis dan aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH. Hasil dari percobaan menunjukkan bahwa pada fraksi etil asetat dan metanol positif mengandung flavonoid. Berdasarkan spektrum UV didapat panjang gelombang maksimum 289 nm dan 650 nm disimpulkan senyawa hasil isolasi adalah antosianin dan memiliki aktivitas antioksidan yang kuat.

Kata Kunci : Antosianin, Oryza sativa, Akrtivitas antioksidan

ABSTRACT

A research of antioxidant activity from black rice (Oryza sativa L) and red rice (Oryza sativa L) use n-hexane, ethyl acetate, and methanol as solvent have been done. The secondary metabolites compounds identified by thin-layer chromatography and it’s antioxidant activity used DPPH method. From the experiments showed that ethyl acetate and methanol fractions are positive flavonoid. According to UV spectra have maximum wavelength 289 nm and 650 nm is concluded the isolated compound is Anthocyanin and hase strong antioxidant activity.

Keywords : Antosianin, Oryza sativa, Aktivitas antioksidan

PENDAHULUANAntioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menghambat atau

mencegah proses oksidasi senyawa lain yang diakibatkan oleh adanya suatu radikal bebas. Antioksidan dapat mencegah terjadinya kerusakan pada sel terutama pada bagian-bagian sel DNA. Antioksidan dapat berupa enzim yang terdapat didalam tubuh seperti superoksida dismutase, glutation peroksidase, dan katalase. Antioksidan ini didapat dari asupan makanan yaitu dari antioksidan alami yang terkandung di dalam makanan maupun antioksidan sintetik yang sengaja ditambahkan pada suatu makanan (Sunarni, 2007).

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan kebanyakan senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami adalah berasal dari tumbuhan. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak

selalu dari bagian yang dapat dimakan. Antioksidan alami tersebar di beberapa bagian tanaman, seperti pada kayu, kulit kayu, akar, daun, buah, bunga, biji, dan serbuk sari (Juliani, 2002).

Pigmen antosianin yang merupakan salah satu metabolit sekunder pada beras hitam dan beras merah dapat berperan sebagai antioksidan. (Riyanto, 2008). Beras merupakan bahan makanan pokok penduduk Asia, termasuk Indonesia. Beras yang berwarna mulai dari warna merah hingga hitam dianggap sebagai makanan yang sangat bermanfaat bagi kesehatan atau disebut makanan fungsional. Beras hitam dan beras merah belum menjadi bahan pangan pokok seperti halnya beras putih, meskipun dua macam beras berwarna ini mempunyai nilai gizi yang tinggi.

Berdasarkan literatur di dapatkan informasi bahwa beras hitam dan beras merah memiliki kandungan antosianin yang sangat besar. Sehubungan dengan itu pada penelitian ini akan dilakukan uji aktivitas antioksidan flavonoid dengan metoda DPPH yang akan membandingkan efek antioksidan dari beras hitam dan beras merah yang akan diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis dan untuk hasil dengan aktivitas antioksidan tertinggi akan dilanjutkan dengan percobaan pemurnian menggunakan metode kromatografi kolom yang akan diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

METODOLOGI PENELITIANWAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN

Penelititan ini dimulai pada bulan Maret sampai Mei 2012, bertempat di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Laboratorium Analisa Fisiko Kimia Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang dan Laboratorium Kimia Bahan Alam Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Bhakti Pertiwi Palembang.

ALAT DAN BAHANPeralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain lumpang agate,

pipet tetes, gelas ukur 10 ml, 100 ml, 250 ml, beker glass 50 ml, 100 ml, 250 ml, cember, labu ukur 100 ml, erlenmeyer, pipet gondok 1 ml, 5 ml, 10 ml, buret 10 ml, labu destilasi, timbangan analitik, timbangan neraca, lampu UV BETRACHTER @CAMAG, oven Multi King MK 16, seperangkat alat destilasi, seperangkat alat Rotary Evaporator @EYELA, UV-1700 PharmaSpec UV-VIS SPECTROPHOTOMETER @SHIMADZU dan Spektrofotometri IR iS10 @Nicolet.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain beras hitam dan beras merah, kloroform, kloroform amoniak, H2SO4 2N, H2SO4 P, HCl P, FeCl3, Pereaksi Mayer, Etanol 96%, Metanol destilasi, Serbuk Mg, KBR murni, asam asetat anhidrat, aquadest, heksan destilasi, etil asetat destilasi, Na2SO4

eksikatus, norit, asam asetat, pasir bersih, plat KLT silika gel 60 F254, serbuk DPPH.

PROSEDUR PENELITIANPENGAMBILAN TUMBUHAN

Sampel diambil di kota Tangerang, Banten.

PENYIAPAN SAMPELSampel yang akan digunakan yaitu beras hitam dan beras merah yang

sudah bersih ditimbang sebanyak ½ kg.

PENGUJIAN FITOKIMIAPemeriksaan Alkaloid (Culvenor And Fitzgerald, 1963), Uji Identifikasi

Flavonoida (Simes, 1959), Uji Terpenoid, Pemeriksaan Saponin, Steroid, Saponin dan Senyawa Fenol (Simes, 1959).

Hasil Uji Pendahuluan Kandungan Kimia Beras Hitam dan Beras Merah

Metabolit Sekunder

PereaksiHasil

Beras Hitam Beras MerahAlkaloid Pereaksi Mayer - -

Flavonoid Mg/HCl + +Fenolik FeCl3 + +

TerpenoidLiebermann-Bourchard

- -

SteroidLiebermann-Bourchard

- -

Saponin Kocok- (tidak

berbusa)- (tidak

berbusa)

METODA EKSTRAKSI MASERASIMasing-masing sebanyak ½ kg beras hitam dan beras merah dimasukkan

kedalam botol coklat, kemudian diekstraksi tiga kali selama tiga hari dengan 300 ml heksan destilasi, ekstrak heksana disaring dengan kertas saring. Ampas sampel (Ampas 1) diekstraksi tiga kali selama tiga hari dengan 300 ml etil asetat destilasi, ekstrak etil asetat disaring dengan kertas saring. Kemudian, ampas (Ampas 2) diekstraksi tiga kali selama tiga hari dengan 300 ml metanol destilasi, ekstrak metanol disaring dengan kertas saring. Kumpulan ekstrak heksan, etil asetat dan metanol masing-masing diuapkan pada suhu dan tekanan yang rendah dengan rotary evaporator sampai didapatkan ekstrak kering heksan, etilasetat, dan metanol lalu ditimbang. Didalam ekstrak heksan diperkirakan mengandung bagian yang lipofil seperti Rice Wax, sedangkan ekstrak etil asetat dan metanol diperkirakan mengandung senyawa flavonoid.

IDENTIFIKASI FLAVONOID DARI EKSTRAKEkstrak dilarutkan dengan pelarut masing-masing lalu ditotolkan pada plat

KLT silika gel F254 dengan ukuran panjang 5 cm dan lebar 1 cm. Fase gerak yang digunakan ialah BAA (4:1:5) dalam 10 ml. (Djamal, 2010).

Pengujian menggunakan pereaksi warna menggunakan sitrusborat, iodium dan FeCl3 dengan plat KLT. Plat KLT yang sudah ditotol dimasukkan kedalam cember yang telah terisi fase gerak, biarkan terjadi elusi sampai batas atas lalu diangkat. Setelah kering disemprot dengan sitrus borat. Positif flavonoid ditunjukkan dengan adanya bercak warna kuning hingga orange. (Djamal, 2010).

Pengujian yang sama juga digunakan untuk penampak warna dengan iodium. Plat kering yang telah di elusi dengan fase gerak dimasukkan dalam gelas bersih dan kering yang telah dijenuhkan dengan iodium. Dilihat penampak warna yang timbul positif flavonoid timbul bercak kuning hingga orange. Setelah itu pengujian juga dilakukan dengan menggunakan logam Mg/HCl pekat. Masing-masing ekstrak kering diambil sedikit dan dilarutkan dengan pelarutnya, dimasukkan dalam tabung reaksi. Positif flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna orange. (Djamal, 2010).

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDANMetoda yang digunakan pada uji aktivitas antioksidan adalah metoda

spektofotometri dengan radikal bebas DPPH (diphenyl picrylhydrazil).

PEMBUATAN LARUTAN DPPHSerbuk DPPH ditimbang lebih kurang 9,8575 mg menggunakan

timbangan analitik dimasukkan ke dalam gelas ukur 250 ml, lalu dilarutkan dalam 100 ml metanol destilat dikocok hingga serbuk DPPH larut dan ditambahkan metanol destilat hingga 250 ml. Selanjutnya labu ditutup rapat dan dikocok secara bolak bali sampai larutan homogen berwarna violet dan pengerjaannya dilakukan ditempat gelap sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 µM.

PENENTUAN PANJANG GELOMBANG SERAPAN MAKSIMUM DPPHLarutan DPPH yang telah dibuat dipipet sebanyak 3,8 ml dan ditambahkan

0,2 ml metanol destilat mengunakan pipet mikro. Larutan DPPH dikocok pelan hingga homogen dan dibiarkan selama 30 menit ditempat yang terlindung dari cahaya. Larutan uji dimasukkan ke dalam kuvet dan diukur serapannya menggunakan alat spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 400-800 nm. Dari pengukuran akan didapatkan serapan panjang gelombang maksimum larutan adalah 516,5 nm.

PENENTUAN AKTIVITAS ANTIOKSIDANPEMBUATAN LARUTAN SAMPEL

Ekstrak beras hitam dan beras merah masing-masing ditimbang sebanyak 50 mg di dalam labu ukur 50 ml yang telah dinolkan pada timbangan analitik. Setelah itu dilarutkan dengan metanol lebih kurang 25 ml, labu ukur digoyang sampai larutan uji telah homogen. metanol diteteskan ke dalam labu ukur hingga 50 ml yang segera ditutup rapat. Labu ukur dikocok secara bolak balik sampai larutan telah homogen secara visual. Dilakukan pemipetan kedua sebanyak 25 ml, larutan uji tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur kedua dan dilarutkan dengan metanol hingga 50 ml. Dilakukan pemipetan ketiga 25 ml larutan uji kedua dan dimasukkan ke dalam labu ukur ketiga yang dilarutkan dengan metanol hingga 50 ml. Hal yang sama dilakukan sebanyak lima kali.

Konsentrasi larutan uji yang didapatkan dari kelima pengenceran tersebut adalah sebesar 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, dan 0,0625 mg/ml. Pada masing-masing konsentrasi dilakukan pemipetan sebanyak 0,2 ml dengan pipet mikro yang ditambahkan dengan 3,8 ml DPPH 100 µM dengan konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, dan 62,5 ppm.

Campuran larutan dihomogenkan, kemudian diukur serapannya dalam 30

menit. Serapan diukur dengan spektrofotometer UV-VIS Pharmaspec 1700 pada panjang gelombang 516,5 nm. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan secara duplo (dua kali pengulangan) sehingga serapan yang diperoleh merupakan hasil rata-rata.

PERHITUNGAN PERSENTASE INHIBISIMenurut Ariyanto cit. Armala (2009), tingkat kekuatan antioksidan

senyawa uji menggunakan metode spektofotometri dengan pereaksi radikal bebas DPPH dapat digolongkan menurut nilai IC50.

Hasil Perhitungan IC50 Ekstrak Kering Etil Asetat dan Metanol dari Beras Hitam dan Beras Merah

Kurva Hubungan Antara Konsentrasi dengan Persen Inhibisi Hasil Pengujian Antioksidan dari Ekstrak Beras Hitam dan Ekstrak Beras Merah

0 2000 4000 6000 8000 1000005

1015202530354045

39.907

30.90125.621

17.547

2.639

f(x) = 0.00407155913978495 x + 10.7011666666667R² = 0.771894404432417

Konsentrasi (ppm)

% In

hibi

si

IC50 = 9825 ppm

Kurva hubungan antara konsentasi ekstrak etilasetat beras hitam dengan persen inhibisi

Sumber tumbuhan Ekstrak IC50 (ppm)

Beras Hitametil asetat 9825

metanol 381,5

Beras Merahetil asetat 12.404

metanol 340,6

0 200 400 600 800 1000 12000

102030405060708090

10093.478

75.155

45.556

28.416

11.646

f(x) = 0.0829283655913978 x + 18.7154583333333R² = 0.893028144599558

Konsentarsi (ppm)

% In

hibi

si

IC50 = 381,5 ppm

Kurva hubungan antara konsentasi ekstrak metanol beras hitam dengan persen inhibisi

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 90000

5

10

15

20

25

30

35

4036.335

21.273

15.528

1.8630.155

f(x) = 0.00472556720430108 x + 0.381541666666671R² = 0.93573845438717

Konsentrasi (ppm)

% In

hibi

si

IC50 = 12.404 ppm

Kurva hubungan antara konsentasi ekstrak etilasetat beras merah dengan persen inhibisi

0 200 400 600 800 1000 12000

20

40

60

80

100

120

97.05

75.621

46.571

32.764

17.547

f(x) = 0.0812793978494624 x + 22.4148333333333R² = 0.924014484297178

Konsentrasi (ppm)

% In

hibi

si IC50 = 340,6 ppm

Kurva hubungan antara konsentasi ekstrak metanol beras merah dengan persen inhibisi

Data Aktivitas Antioksidan Beras Hitam dan Beras Merah

No SampelKonsentras

i (ppm)

Beras Hitam Beras Merah

Inhibisi (%)

Y R2Inhibisi

(%) y R2

1Ekstrak

etil asetat

5001000200040008000

2,639 17,547 25,621 30,901 39,907

0,0041x + 10,701

0,7719

0,155 1,863 15,528 21,273 36,335

0,0047x + 0,3815

0,9357

2Ekstrak metanol

62,51252505001000

11,646 28,416 45,556 75,155 93,478

0,082x + 18,71

0,893

17,547 32,764 46,57175,62197,05

0,081x + 22,41

0,924

IDENTIFIKASI FLAVONOID FRAKSI METANOL BERAS MERAH DENGAN KROMAROGRAFI KOLOM DAN KLT

Isolasi senyawa dilakukan terhadap ekstrak metanol beras merah dengan menggunakan metoda kromatografi kolom, yang sebelumnya dianalisa dengan KLT menggunakan penyangga silika gel GF 254, fasa gerak BAA dengan perbandingan tertentu. Sebagai penampak noda digunakan lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm. Setelah didapatkan pelarut yang cocok untuk memisahkan komponen-komponen yang ada dalam senyawa tersebut, selanjutnya

dilakukan pemisahan secara kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah butanol, asam asetat, dan air.

Identifikasi flavonoid fraksi metanol beras merah dengan kolom kromatografi dengan perbandingan 1:100, yaitu 1g ekstrak kering : 100g silika gel GF60. Fraksi metanol beras merah sebanyak 1 gram dikromatografi vakum cair (flash chromatography) dengan fase diam silika gel 60 ukuran 43-60 µm dan fase geraknya BAA. Silika gel disuspensikan dengan BAA. Suspensi silika gel dimasukkan kedalam kolom berupa tabung kaca yang ujungnya terdapat alas berserta penyaring dan pastikan silika di dalam kolom menjadi padat sambil diketok-ketok dan tidak ada rongga udara. Sampel disiapkan secara preabsorbsi dengan melarutkannya dalam BAA. Sampel yang telah larut dimasukkan merata ke dalam kolom kromatografi kemudian dielusi dengan fase gerak BAA (4:1:5). Fraksi yang keluar ditampung dalam vial, lalu masing-masing pelarut diberi label.

Pengujian selanjutnya adalah dengan metoda KLT. Masing-masing vial ditotolkan pada plat KLT dan fase gerak BAA. Selanjutnya Perhitungan Rf. Bercak yang mempunyai nilai Rf yang sama dapat digabungkan dan dirotari hingga mendapat ekstrak kering. Dari Rf senyawa akan dapat diketahui kelompok senyawa, apakah flavon termetilasi, flavon/flavonol, flavonol 3-glikosida, glikoflavon atau antosianin. Percobaan yang sama dilakukan tetapi sebagai trager digunakan Plat KLT GF 254. Deteksi dilakukan dengan sinar tampak, lampu UV 254 dan 360 nm dan setelah diuapi dengan amoniak pekat. Ekstrak yang didapat diKLT kembali hingga mendapatkan satu bercak.

Hasil isolat ekstrak beras merah akan dibandingkan dengan pembanding vitamin C.

Kurva Hubungan Antara Konsentrasi dengan Persen Inhibisi Beras Merah Hasil Kromatografi Kolom dan Pembanding Vitamin C

0 50 100 150 200 250 3000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

5.908

15.20821.663

42.129

88.293f(x) = 0.343591311827957 x + 1.35479166666666R² = 0.99592544833714

Konsentrasi

% In

hibi

si

IC50 = 141,8 ppm

Kurva hubungan antara konsentasi ekstrak metanol beras merah hasil isolasi dengan persen inhibisi

0 50 100 150 200 250 3000

20

40

60

80

100

120

96.82787.41700000000

02

62.36353.719

36.98

f(x) = 0.237049806451613 x + 44.497R² = 0.848970225639751

Konsentrasi

% In

hibi

si

IC 50 = 23,25

Kurva hubungan antara konsentasi vitamin C dengan persen inhibisi

Hasil Perhitungan IC50 Senyawa Isolasi dari Beras Merah (O. sativa L) dengan Pembanding Vitamin C

IDENTIFIKASI FLAVONOID ANTOSIANIN HASIL ISOLASI DENGAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

Sebanyak 1 mg flavonoid murni dilarutkan dalam 10 ml metanol, kemudian diukur serapannya dengan Spektrofotometri dengan panjang gelombang 200 sampai 800 nm. Dari pengukuran akan diketahui λmaks senyawa flavonoid.

HASIL DAN PEMBAHASANIdentifikasi ekstrak heksan, etil asetat dan metanol beras hitam dengan

menggunakan KLT, metoda penampak bercak dan Mg/HCl, ternyata menunjukkan hasil yang positif mengandung flavonoid pada ekstrak etil asetat dan metanol. Identifikasi ekstrak heksana, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol beras merah dengan menggunakan KLT, metoda penampak bercak dan Mg/HCl, ternyata menunjukkan hasil yang positif mengandung flavonoid pada ekstrak etil asetat dan metanol. Uji aktifitas antioksidan ekstrak etil asetat dan metanol beras hitam dengan metoda Spektrofotometri VIS dengan pereaksi radikal bebas DPPH menunjukan aktivitas antioksidan dengan IC50 9825 dan 381,5 ppm, sedangkan Uji aktifitas antioksidan ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol beras merah dengan metoda Spektrofotometri VIS dengan pereaksi radikal bebas DPPH

IC50 (ppm)

Senyawa Hasil Isolasi 141,8

Vitamin C 23,25

menunjukan aktivitas antioksidan dengan IC50 12.404 dan 340,6 ppm. Ekstrak metanol beras merah (O. sativa) hasil isolasi yang diuji aktivitas antioksidannya dengan metoda Spektrofotometri VIS dengan pereaksi radikal bebas DPPH menunjukan aktivitas antioksidan dengan IC50 141,8 ppm, sedangkan vitamin C sebagai pembanding yang diuji aktivitas antioksidannya dengan metoda Spektrofotometri VIS dengan pereaksi radikal bebas DPPH menunjukan aktivitas antioksidan dengan IC50 23,25 ppm. Dengan menggunakan metoda spektrofotometri menggunakan pereaksi DPPH dapat dilakukan uji aktivitas antioksidan serta dengan percobaan isolasi menggunakan metoda kromatografi kolom didapatkan senyawa yang diduga antosianin.

DAFTAR PUSTAKA

Ardiansyah, 2007, Antioksidan dan Peranannya Bagi Kesehatan, http://www. beritaiptek.com/zberita-beritaiptek-2007-01-23-Antioksidan-dan peranannya-Bagi-Kesehatan.html diakses tanggal 10 feb 2007.

Armala, M. M.. 2009. Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir (Cosmos caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, 39, Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

Culvenor, C. C. J, dan J. S, Fitzgerald. 1963. A Field Method for Alkaloid Screening of Plant. J. Pharm Sci.

Djamal Rusjdi.2009. Prinsip – prinsip dasar isolasi dan identifikasi. Universitas Baiturrahmah. sumatera barat.

Harborne, J.B., 1987, Phytochemical Methods (Metoda Fitokimia), diterjemahkan oleh K. Padmawinata dan Iwang Soediro, Terbitan II, ITB, Bandung.

Kumalaningsih, Sri. 2007. Antioksidan Alami. Surabaya: Trubus Agrisarana.

Markham, K. R. .1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Penerjemah: K. Padmawinata. Bandung: ITB Press. Hal. 5-6, 16-27, 32-33, 38, 42-47.

Simes, J. JH, et al. 1959. An Australian Phaytochemical Survey Saponins and Easter Australian Flowering Plant, Commonwealth Scintific and Industrial Research Organization. Australia