PEMBAHASAN

Pembuatan Medium

Untuk mengembang-biakkan mikroorganisme seperti kapang, khamir, jamur

ataupun yang lainya diperlukan medium. Medium merupakan suatu media untuk

menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi

dan perhitungan jumlah mikroba. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan

mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan

kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. untuk menumbuhkan

mikroorganisme yang kita inginkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami

kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan

digunakan.

Berdasarkan konsistensi ataupun kepadatannya, medium terbagi tiga bagian, yaitu :

1. Medium cair/broth/liquid yaitu media yang tidak mengandung agar,

contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).

2. Medium setengah padat (semi solid medium) yaitu media yang mengandung

agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair.

Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat

menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna

jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free

Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah

permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah

hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen,

misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen

meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh

merata diseluruh media.

3. Medium padat (solid medium) yaitu media yang mengandung agar 15%

sehingga setelah dingin media menjadi padat..

Contoh : endo agar, PDA, Nutrient agar

Pebrin Manurung

24021090132

Berdasarkan komposisi medium dapat di bagi tiga bagian, yaitu :

1. Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan

takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

2. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui

secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar,

dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat

mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

3. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak

dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan

dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar,

Pancreatic Extract.

Berdasarkan fungsinya, medium terbagi menjadi empat bagian, yaitu :

1. Medium umum, yaitu medium yang dapat ditumbuhi berbagai jenis

mikroorganisme. Contoh : NA (nutrient agar) umum untuk bakteri, PDA

(potato dextrose agar) dan toge umum untuk jamur.

2. Medium selektif, yaitu medium yang hanya ditunbuhi jenis mikroba tertentu.

Contoh : medium SSA untuk bakteri Salmonella dan Shigella.

3. Medium diferensial, yaitu medium yang hanya ditumbuhi berbagai jenis

mikroba, salah satu jenis memberikan cirri yang khas sehingga dapat segera

diketahui berbeda dari yang lain. Contoh : Blood Agar, EMB agar, dll.

4. Medium pengaya, yaitu medium yang kaya akan nutrient tertentu sehingga

dapat menumbuhkan dan memperbanyak sel dengan cepat. Contoh: medium

Tetrathionat Broth, dll.

Medium untuk menumbuhkan mikroorganisme ada berbagai macam.

Mikroorganisme dapat tumbuh sesuai dengan medium yang digunakan. Berikut

adalah berbagai medium yang sering digunakan :

Nutrien Agar(NA)

Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga

digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif,

dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang

dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang

umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage,

produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji

bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Pada pembuatan

medium NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung

banyak N2 (Dwidjoseputro, 1994). Agar yang digunakan dalam proses ini untuk

mengentalkan medium sama halnya dengan yang digunakan pada medium PDA yang

juga berperan sebagai media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel, 1993). Agar

dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama

15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.

Dalam percobaan warna NA sebelum dilarutkan dalam aquades adalah coklat, dan

setelah dilarutkan dalam aquades berubah menjadi kekuning-kuningan dan terdapat

endapan. Jadi untuk menghilangkan endapan tersebut maka dipanaskan dalam

penangas air dengan tabung Erlenmeyer disumbat dengan alat penyumbat. Setelah

sterilisasi warna medium menjadi agak coklat

Potato Dextrose Agar (PDA)

PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang.

Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau

produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu

terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan

kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat

PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi.

Tetapi pada praktikum kali ini PDA dilarutkan pada 50mL air dengan perhitungan :

391000

= x50

39x50 = 1000x

x = 39 x 501000

x = 1,95gr

jadi PDA yang digunakan untuk 50 ml aquades adalah 1,95gr.

Serbuk PDA berwarna kuning karena merupakan ekstrak kentang yang pada dasarnya

berarna kuning. serbuk dicampur dan dipanaskan serta aduk. Didihkan selama 1

menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121°C selama

15 menit. setelah disterilisasi dalam autoklaf medium berwarna kecoklatan dan

didapat endapan berwarna putih. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang dalam

cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.).Setelah didinginkan, medium dapat ditanami

bakteri (Schegel, 1993)

Plate Count Agar (PCA)

PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di

atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic

hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L

kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media PCA ini

baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya

mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino

dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B

kompleks.

Selain medium di atas masih terdapat medium lain yang juga memiliki fungsi untuk

menumbuhkan kultur mikroorganisme, yaitu :

Lactose Broth

Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform

dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment

broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri

pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk

memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat

difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas

adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3%

ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.

Nutrient Broth (NB)

Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair.

Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut.

1. Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades.

2. Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama.

3. Atur pH sampai 7,0.

4. Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.

5. Sterilisasi dengan autoklaf.

EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)

Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa

dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S.

aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa

menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan

mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen

blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini

digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa

dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat

baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB

(levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis

bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan

eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara

koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa

karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa.

Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih

dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan

terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli

dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air.

MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)

MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan

Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis

Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat, asetat,

magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor

pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat

selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis

bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung:

1. Protein dari kasein 10 g/L

2. Ekstrak daging 8,0 g/L

3. Ekstrak ragi 4,0 g/L

4. D (+) glukosa 20 g/L

5. Magnesium sulfat 0,2 g/L

6. Agar-agar 14 g/L

7. dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L

8. Tween 80 1,0 g/L

9. Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L

10. Natrium asetat 5 g/L

11. Mangan sulfat 0,04 g/L

MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk cair/broth.

Trypticase Soy Broth (TSB)

TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan

penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi

bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas

bakteri patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang

menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi

media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi

dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat

ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH.

APDA

Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan

yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan

optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka

pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1

jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam

agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah

asam tartarat.

VRBA (Violet Red Bile Agar)

VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri

Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa,

sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati.

Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan

untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral

red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air

yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan

hingga 50-60°C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4.

Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast

ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri.

Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar

merupakan agen pemadat.

PGYA

Media ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Dengan

adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGYA dapat digunakan untuk

mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk membuatnya, semua bahan

dicampur dengan ditambah CaCO3 terlebih dahulu sebanyak 0,5 g lalu dilarutkan

dengan akuades. Kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disumbat dengan

kapas lalu disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.

STERILISASI MEDIUM DAN KEMASAN

Agar biakan bakteri dapat dibuat, maka medium dan alat-alat yang diperlukan

harus disterilisasi sebelum inokulasi. Sterilisasi yaitu suatu proses untuk mematikan

semua organisme yang dapat menjadi kontaminan.

Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

1. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang

dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan

berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara

panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170o

– 180oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk

peralatan gelas).

2. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan

alkohol, larutan formalin).

3. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat

pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya

adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain

adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini

adalah mikroba) (Suriawiria, 2005).

Metode yang lazim digunakan untuk mensterilisasikan media dan alat-alat ialah

dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut

sterilisasi basah (menggunakan autaklaf), sedangkan jika tanpa uap air disebut

sterilisasi kering (menggunakan oven).

Pengenalan Autoclave

Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat maupun medium mikroorganisme.

Gambar di bawah adalah contoh

jenis autoclave yang paling

sederhana. Prinsip kerja alat ini sama

dengan prinsip kerja kukusan (alat

sederhana untuk menanak nasi)

hanya saja memiliki tekanan

sehingga menghasilkan panas yang

lebih tinggi. Hal ini bertujuan untuk

lebih menyempurnakan proses

sterilisasi. Tahap sterilisasi

sebenarnya cukup singkat yaitu

dengan suhu 121 derajat celsius selama 15 menit. Namun waktu keseluruhan mulai

dari pemanasan awal (kenaikan suhu) sampai pendinginan (penurunan suhu) bisa

mencapai kurang lebih 2 jam-an. Yang perlu diperhatikan selama mengoperasikan

alat ini adalah tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi

botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer

menunjukkan angka 0. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka

setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat

tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah

dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994). Dan jangan lupa tulis siapa pengguna

(nama, waktu dan lab.) sebelum start, selalu memakai sarung tangan tahan panas,

isilah air sesuai ukuran yang ditentukan sebelum start, jangan membuka autoclave

sebelum suhu dingin (dibawah 60 derajat celcius).

KESIMPULAN

Medium merupakan suatu media untuk menumbuhkan mikroba, isolasi,

memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah

mikroba.

Untuk mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya

dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan.

Medium berdasarkan bentuk terbagi tiga bagian, yaitu: medium cair, semi cair,

dan padat

Berdasarkan komposisinya medium juga terbagi tiga bagian, yaitu : medium

alami, medium semisintetk, dan medium sintetik

Medium berdasarkan fungsinya terbagi empat, yaitu : medium umum, medium

selektif, medium diferensial, medium pengaya.

Sebelum membiakkan mikroorganisme, terlebih dahulu alat dan medium

disterilisasi supaya tidak terjadi kontaminasi bahan lain.

Sterilisasi yang umum dilakukan dalam laboratorium mikrobiologi adalah

dengan cara pemanasan, yaitu dengan penggunaan oven dan autoclave.

Oven merupakan alat sterilisasi kering sedangkan autoclave merupakan alat

sterilisasi basah dengan prinsip yang sama dengan pengukusan tetapi

menggunakan tekanan uap.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

enidchemicals.com

LAMPIRAN JAWABAN DAN PERTANYAAN

1. Setelah saudara pelajari dan dipraktekkan, jelaskan fungsi penambahan beef

extract pada pembuatan media NA dan fungsi penambahan kentang pada

pembuatan media PDA! Mengapa berbeda?

Jawab : Fungsi penambahan beef extract pada pembuatan media NA adalah

untuk menumbuhkan bakteri

panambahan kentang berfungsi sebagai sebagai sumber karbohidrat dalam

jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga

baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk

pertumbuhan bakteri.

Berbeda karena NA lebih dominan untuk pertumbuhan Bakteri sedangkan

PDA untuk pertumbuhan kapang dan khamir.

2. Jelaskan fungsi dari larutan pengencer? Mengapa harus menggunakan

KH2PO4? Dapatkah digantikan dengan senyawa kimia lain?

Jawab : Fungsi dari larutan pengencer adalah untuk mengencerkan contoh

pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh contoh

dengan jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai

300 sel mikroba per ml. Larutan pengencer harus menggunakan KH2PO4

karena kalium dan fosfatnya berguna untuk memberi nutrisi sel

mikroorganisme. Larutan pengencer dapat diganti dengan air sadah air sadah

umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada

medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air

sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium

fosfat.

BAB III

ALAT DAN BAHAN

3.1 Pembuatan Medium

PCA (Plate Count Agar)

PDA (Potato Dextrose Agar)

NA (Nutrient Agar)

Aquades

Spatula

Timbangan analitik

Erlenmeyer

Kapas

Batang pengaduk

3.2 Sterilisasi Peralatan dan Kemasan

Oven

Kompor

Panic

Botol

Kain saring

Tabung reaksi

Cawan petri

Erlenmeyer

Gelas ukur

Lap

Detergen

Autoclave

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PANGAN I

“Pembuatan Medium Dan Sterilisasi”

KELOMPOK 8

S. Salwa Rijadiputri 240210090122

Raditya Indirwan 241210090123

Bhakti Darmawan 240210090124

Anisa Rizky Fauzia 240210090125

Pebrin Manurung 240210090132