BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Cuka didefinisikan sebagai larutan yang mengandung 4% asam asetat

yang dihasilkan dari suatu proses fermentasi alkoholik menggunakan bahan-bahan

yang mengandung gula (Joyeux et al., 1984, Drydale dan Fleet, 1985, Kocher et

al., 2006). Saat ini industri cuka di dunia telah berkembang, terbukti dengan

diproduksinya cuka dari berbagai sumber gula sebagai bahan baku. Di Indonesia

sendiri telah tersedia cuka dari buah apel dan bunga rosella (Anonima, 2010).

Keduanya mempunyai khasiat yang baik untuk kesehatan. Produksi cuka ini

memanfaatkan bakteri asam asetat hasil isolasi atau secara alami (Drydale dan

Fleet, 2010).

Bakteri asam asetat terdiri dari suatu kelompok bakteri gram negatif,

bersifat aerob, dan kapasitasnya mampu mengoksidasi berbagai jenis alkohol dan

gula menjadi asam asetat sebagai bahan baku komersil yang penting untuk

industri cuka. Kelompok bakteri asam asetat yang banyak diteliti dan digunakan

dalam industri adalah genus Gluconobacter dan Acetobacter sp.

Genus Acetobacter adalah genus utama yang terlibat dalam industri

fermentasi cuka (Sokollek, 2008). Genus Acetobacter adalah gram negatif, aerob,

berbentuk batang, dengan ukuran 0,6-0,8 x 1,0-4,0 μm (Joyeux, 1984). Pada

umumnya Acetobacter terdapat di beberapa buah seperti anggur dan buah-buah

yang telah membusuk. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa genus

Acetobacter mampu diisolasi dari suspensi campuran berupa buah cherry, apel,

kurma, palm, kelapa, beberapa bunga dan masih berpotensi pada bahan-bahan lain

yang bersifat asam (pH dibawah 5), termasuk kulit pisang. Kulit pisang selain

berpotensi sebagai habitus Acetobacter ternyata terbukti dapat dijadikan sumber

gula dalam pembuatan cuka, produknya dinamakan cuka pisang (Susanto, 2009).

Khasiat dari kulit pisang tidak kalah dengan buahnya. Hasil penelitian dari tim

Universitas Kedokteran Taichung Chung Shan, Taiwan, memperlihatkan bahwa

ekstrak kulit pisang ternyata berpotensi mengurangi gejala depresi dan menjaga

retina mata dari kerusakan cahaya akibat regenerasi retina. Selain kaya vitamin

1

B6, kulit pisang juga ternyata banyak mengandung serotonin yang sangat vital

untuk menyeimbangkan mood (Anonimb, 2010).

Isolasi Acetobacter dari kulit pisang dilakukan dengan memisahkan dan

menumbuhkannya pada medium selektif berupa mannitol agar. Pengujian

Acetobacter yang didapat dilakukan dengan uji morfologi meliputi uji makro dan

mikroskopik, reaksi gram, pewarnaan acid fast dan uji rDNA, kemudian diuji

kadar asam asetat yang dihasilkan dengan metode titrasi asam basa (Utomo,2010).

Menurut Maal . (2010) perlakuan penambahan alkohol pada medium

tumbuh Acetobacter sebesar 5%, 7%, dan 9% serta peningkatan suhu tumbuh dari

26-27oC menjadi 36-40oC dapat meningkatakan produktivitas asam asetat karena

memperpanjang fase lag. Semakin besar kadar asam asetat yang dihasilkan dalam

waktu yang singkat, akan mengefektifkan produksi cuka. Selain itu, Acetobacter

yang digunakan lebih murni sehingga berpotensi menghasilkan cuka dengan rasa

dan nutrisi yang baru dan lebih baik (Maal, 2010).

Mengingat bahwa kulit pisang terbukti dapat menjadi sumber gula pada

pembuatan cuka, akan sangat menarik apabila bakteri Acetobacter juga dapat

diisolasi dari kulit pisang tersebut. Penggunaan isolat Acetobacter indigenous dari

kulit pisang mungkin dapat meningkatkan produksi cuka pisang karena ada

kesesuaian habitus antara bakteri Acetobacter dengan kulit pisang (Musa

paradisiaca).

I.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana metodologi isolasi dan identifikasi Acetobacter indigenous

dari kulit pisang (Musa paradisiaca) ?

2. Bagaimana potensi bakteri Acetobacter indigenous dari kulit pisang (Musa

paradisiaca) dalam menghasilkan asam asetat sehingga mengefektifkan

produksi cuka pisang?

I.3 Tujuan

1. Mengetahui metodologi isolasi dan identifikasi Acetobacter indigenous

dari kulit pisang (Musa paradisiaca).

2

2. Mengetahui potensi bakteri Acetobacter indigenous dari kulit pisang

(Musa paradisiaca) dalam menghasilkan asam asetat sehingga

mengefektifkan produksi cuka pisang.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Bakteri Asam Asetat

Secara alamiah bakteri asam asetat terdiri dari suatu kelompok bakteri

gram negatif, bersifat aerob, dan kapasitasnya mampu mengoksidasi berbagai

jenis alkohol dan gula menjadi bahan-bahan komersil yang penting untuk

makanan dan bahan kimia. Kelompok bakteri asam asetat yang banyak diteliti dan

digunakan dalam industri adalah genus Gluconobacter dan Acetobacter sp

(Sokollek , 1998). Perbedaan dari kedua genus terletak pada bentuk flagella dan

kemampuan mengoksidasi asam asetat menjadi CO2 dan air (tabel 1). Genus

Acetobacter menggunakan alkohol sebagai sumber karbon yang lebih disukai dan

ditingkatkan pada proses fermentasi (Joyeux, 1984). Sehingga genus Acetobacter

adalah genus utama yang terlibat dalam industri fermentasi cuka.

Tabel 1. Perbedaan Genus Acetobacter dan Gluconobacter

Karakter Acetobacter Glucanobacter

Flagella Peritrichous Polar

Tumbuh pada pH 4,5 + +

Oksidasi alkohol menjadi asam

asetat pada pH 4,5

+ +

Kemampuan oksidasi asam asetat

menjadi CO2 dan air

+ -

DNA (mol % GC) 53-56 56-54

Jumlah spesies 7 3

(sumber : Brock et al., 1994)

Secara morfologi, Gangwar (2009) melaporkan bahwa karakter koloni dari

bakteri-bakteri asam asetat yang dihasilkan dari tebu dan gandum adalah seperti

yang disajikan dalam tabel di bawah.

Tabel 2. Morfologi Koloni Bakteri Asam Asetat

Isol

at

Warna Koloni Topografi Bentuk Gram Cara Gerak

1 Transparan Bulat kecil Koma - Motil

2 Transparan Bulat Koma - Motil

3 Putih agak Pekat Teratur Batang - Non-Motil

4 Putih krim Bulat Batang - Non-Motil

4

5 Putih Krim Bulat Batang - Motil

6 Putih keabu-abuan Tidak Teratur Bulat Batang + Motil

(sumber : Gangwar, 2009)

II.2 Genus Acetobacter

Gambar berikut menunjukkan koloni Acetobacter :

Gambar 1 dan 2 - Koloni Acetobacter pada Metode Cawan Gores

Genus Acetobacter adalah gram negatif, aerob, berbentuk batang (rod) dengan

ukuran 0,6-0,8 x 1,0-4,0 μm (Joyeux, 1984). Alat gerak berupa motil atau non

motil dan mempunyai flagel pada seluruh permukaan tubuhnya (peritrik) . Pada

umumnya Acetobacter terdapat dibeberapa buah seperti anggur dan buah-buah

yang telah membusuk. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa genus

Acetobacter mampu diisolasi dari suspensi campuran berupa buah cherry, apel,

kurma, palm, kelapa, beberapa bunga dan masih berpotensi pada bahan-bahan

yang lain. Secara morfologi genus Acetobacter mempunyai koloni berwarna putih

krim dengan topografi bulat dan berbentuk batang (rod) (Gangwar, 2009).

II.3 Isolasi Mikrobia

Isolasi berarti mengidentifikasi, mengambil, memisahkan, dan

menumbuhkan mikrobia tertentu untuk mendapatkan biakan murninya. Biakan

murni yang didapatkan kemudian ditumbuhkan dalam media yang cocok untuk

diambil manfaatnya. Manfaat yang bisa diambil tergantung kapasitas mikrobia

yang diisolasi. Berbagai mikrobia terlibat dalam proses fermentasi dalam industri

manufaktur, farmasi, pertambangan, bahan kimia, serta pengolahan limbah dan

menghasilkan produk- produk yang berguna bagi kesejahteraan umat manusia

(Pelczar, 1988) .

5

II.4 Medium Agar

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara

(nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Banyak sekali medium yang

tersedia, yang dipakai bergantung pada beberapa faktor salah satu diantaranya

adalah jenis mikroba yang akan ditumbuhkan (Pelczar, 1988). Medium-medium

tersebut dikelompokkan berdasarkan susunan kimia, wujud, dan fungsi. Medium

berdasarkan susunan kimianya terdiri dari medium anorganik, organik, sintetik,

dan non sintetik. Berdasarkan wujudnya, medium dapat berupa cair, padat, atau

padat yang dicairkan. Sedangkan media berdasarkan fungsinya, terdiri dari dua

jenis yaitu medium diperkaya dan medium selektif ( Hidayat, 2006). Salah satu

medium agar yang dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri

Acetobacter adalah mannitol agar. Komposisinya adalah : mannitol 5

gram, agar 8 gram, yeast extract 5 gram, peptone 3 gram, dan air suling 1.000 ml.

Penambahan etanol sebesar 5%, 7%, dan 9% dapat meningkatkan produktivitas

asam asetat karena memperpanjang fase lag (Maal, 2010).

II.5 Suspensi Campuran Mikrobia

Pengambilan isolat mikrobia membutuhkan suatu suspensi campuran

yang diduga menjadi habitatnya. Bakteri Acetobacter terdapat dibeberapa buah

seperti anggur dan buah-buah yang telah membusuk serta di lingkungan manapun

di bawah pH 5 (Maal, 2010).

II.6 Metode Isolasi Mikrobia

Berdasarkan bentuk media dan cara menumbuhkan media aerob

dibedakan menjadi tiga metode, yaitu metode cawan tuang, cawan gores, dan agar

miring (Sutedjo, 1998).

Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat dan bahan-

bahan dari segala macam bentuk kehidupan (kontaminan), terutama mikroba.

Metodenya adalah : (1) sterilisasi dengan pemijaran, (2) sterilisasi dengan udara

kering panas, (3) sterilisasi dengan uap air panas, (4) sterilisasi dengan uap panas

bertekanan, (5) sterilisasi dengan bahan-bahan kimia (Susanto, 2009).

6

Cawan Tuang

Mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh biakan yang dapat

dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang tampak pada cawan

tersebut setelah diinkubasi berasal dari satu sel tunggal. Proses pengenceran

penting dilakukan karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam eksperimen pada

umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan

beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu diantara cawan-cawan tersebut

mengandung koloni yang terpisah baik di permukaan agar maupun di dalamnya

(Pelczar, 1988).

Cawan Gores

Koloni bakteri digoreskan di permukaan medium agar nutrien dalam

cawan petri dengan jarum pindah mengikuti suatu gambar tertentu. Tujuan utama

dari penggoresan cawan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni yang

terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat. Metode ini sekarang banyak

digunakan, karena tidak memakan banyak waktu tetapi tidak bisa digunakan untuk

bakteri anaerob (Dwidjoseputro, 2003).

Agar Miring

Agar miring adalah media agar dalam tabung reaksi yang diletakkan

miring pada waktu pendinginan. Isi tabung yang diletakkan demikian akan

mengeras dengan permukaan miring. Sehingga mudah menanamkan bakteri di

dalamnya dengan jarum ose (Susanto, 2009).

II.7 Metode Identifikasi

Pengujian Acetobacter yang didapat dilakukan dengan uji morfologi

meliputi uji makroskopik dan mikroskopik, reaksi gram, pewarnaan acid fast dan

uji rDNA (Maal, 2010).

Pengujian Makro dan mikroskopik

Sifat-sifat koloni yang tumbuh pada metode cawan tuang dikelompokkan

berdasarkan (1) bentuk koloni, (2) permukaan koloni, dan (3) tepi koloni.

Sedangkan sifat-sifat koloni yang tumbuh pada metode agar miring

dikelompokkan berdasarkan : (1) bentuk pertumbuhan koloni, (2) elevasi, (3)

7

kilat, (4) bentuk permukaan (topografi), (5) warna, (6) ciri-ciri optik, (7) bau, (8)

konsistensi, dan (9) warna medium (Sutedjo, 1998).

Gambar 3 dan 4 - Bentuk dan Tepi Koloni pada Cawan Tuang dan Gores

(sumber : Dwidjoseputro, 2003)

Gambar 5 dan 6 - Permukaan dan Bentuk Koloni pada Cawan Tuang, Gores, dan Agar

Miring (sumber : Dwidjoseputro, 2003)

Mikroskop adalah instrumen ykang paling banyak digunakan dan sangat

bermanfaat di laboratorium mikroskopi (Pelczar, 1988). Dengan alat ini diperoleh

perbesaran sehingga memungkinkan untuk melihat organisme dan struktur yang

tidak tampak dengan mata telanjang. Setiap tipe instrumen yang digunakan untuk

kerja mikroskopi berguna untuk pemeriksaan beberapa ciri morfologi khusus

(Pelczar, 1988, Sutedjo, 1998).

Uji Biokimia

Uji biokimia meliputi pewarnaan gram, pewarnaan endospora, IMVIC

(indole, methyl red, voger, preskaur, dan citrat). Uji pewarnaan gram bertujuan

untuk mengetahui ketebalan peptodoglikan, yang ditunjukkan dengan parameter

positif (+) dan negatif (-). Untuk positif mempunyai ketebalan 30 lebih tebal

daripada negatif. Pewarnaan endospora menunjukkan ada atau tidak adanya

endospora. Uji IMVIC adalah salah satu uji biokimia fenotipik berdasarkan

produk suatu metabolisme.

II.8 Uji Potensi Pengukuran Persentase Asam Asetat

Metode uji kadar asam asetat adalah titrasi (Utomo, 2010, Maal, 2010).

Semakin besar kadar asam asetat yang dihasilkan bakteri Acetobacter dalam

waktu yang singkat, akan mengefektifkan produksi cuka (Maal, 2010).

8

Tabel 3. Bakteri Asam Asetat Hasil Isolasi dan Asam Asetat yang Dihasilkan

Sumber Isolat Suhu Inkubasi Waktu (hari) Kemampuan

Produksi Asam

Asetat ( % )

Potensi

Produksi

Acetobacter aceti

dari tebu

30oC 28 5.9 – 6.7 Cuka Tebu

Bakteri asam

asetat dari kelapa

40oC - - -

Bakteri

Acetobacter dari

buah cherri

36-40oC 14 9.5 Cuka Cherry

(sumber : Maal, 2010)

9

BAB III

PROSEDUR

Langkah-langkah dalam penelitian ini adalah:

Tahap Persiapan :

1. Pembuatan Media Tumbuh Bakteri (Jenis Mannitol Agar)

2. Sterilisasi Alat dan Bahan

Tahap Isolasi

1. Pengenceran

2. Metode Cawan Tuang

3. Metode Cawan Gores

4. Metode Agar Miring

Tahap Identifikasi1. Uji Morfologi dan Biokimia

a) Uji Makro dan Mikroskopik

b) Uji Pewarnaan Gram

c) Uji Endospora

d) Uji Katalase

e) Uji Oksidasi

f) Uji indol

g) Uji H2S

Tahap Uji Potensi

10

BAB IV

PEMBAHASAN

Tahap Persiapan

Pada tahap persiapan dilakukan beberapa langkah untuk mempersiapkan

segala keperluan yang diperlukan dalam tahap isolasi, meliputi determinasi kulit

pisang, penyediaan alat dan bahan, dan sterilisasi. Langkah kerja pada tahap ini

adalah :

Pembuatan Media Tumbuh Bakteri (Jenis Mannitol Agar)

Metode pembuatan mannitol agar sama seperti yang digambarkan dalam

metode.

Sterilisasi Alat dan Bahan

Metode yang digunakan untuk mensterilkan alat dan bahan adalah

sterilisasi dengan pemijaran dan sterilisasi dengan uap panas bertekanan yang

menggunakan instrument berupa otoklaf, dan bunsen. Otoklaf diatur pada suhu

121oC selama 15-20 menit pada tekanan 15 lbs. 11

Tahap isolasi

Pada tahap isolasi dilakukan tiga metode secara berurutan yaitu metode

cawan tuang, cawan gores, dan agar miring. Langkah-langkah pada tahap isolasi

adalah :

Pengenceran

Gambar 8. Metode pengenceran

Pertama dilakukan pengenceran hingga 8 kali, yaitu pengenceran 10 -1 sampai 10-8.

Metode pengenceran mengikuti metode Lister (1865) seperti gambar (atas).

Metode Cawan Tuang

Ketiga mannitol agar dicairkan dan masing-masing dimasukkan ke dalam

petridisk kira-kira seperempat dari tingginya. Suspensi yang telah diencerkan 10 -8

11

dimasukkan ke dalam masing-masing petridisk sebanyak 1ml menggunakan pipet

syrink. Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 36-40oC.

Metode Cawan Gores

Koloni bakteri Acetobacter hasil cawan tuang digoreskan di permukaan

mannitol agar yang telah memadat dalam cawan petri dengan jarum pindah

mengikuti suatu gambar tertentu. Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu

36-40oC.

Metode Agar Miring

Menggoreskan koloni bakteri Acetobacter paling ujung dari hasil metode

cawan gores pada mannitol agar padat yang dimiringkan. Kemudian diinkubasi

selama 48 jam pada suhu 36-40oC.

Tahap IdentifikasiPengujian Acetobacter yang didapat dilakukan dengan uji morfologi meliputi uji

makroskopik dan mikroskopik, dan uji biokimia.`

Uji Morfologi dan Biokimia

a. Uji Makro dan Mikroskopik

Identifikasi dilakukan pada hasil dari metode cawan tuang, cawan gores,

dan agar miring. Pada cawan tuang dan cawan gores koloni diidentifikasi sifat-

sifatnya berdasarkan bentuk, permukaan, dan tepi koloni. Sedangkan sifat-sifat

koloni yang tumbuh pada metode agar miring diidentifikasi berdasarkan bentuk

pertumbuhan koloni, elevasi, kilat, bentuk permukaan, warna, ciri-ciri optik, bau,

konsistensi, dan warna medium. Sifat-sifat tersebut mengacu pada Petunjuk

Praktek Mikrobiologi Hasil Pertanian Depdikbud-1979 dalam Sutedjo (1998).

Identifikasi mikroskopik dilakukan dengan menggunakan instrumen berupa

mikroskop elektron (Olympus® CX21) untuk membantu menguji beberapa ciri

morfologi khusus yang tidak bisa diperiksa secara makroskopi.

b. Uji Pewarnaan Gram

Koloni Acetobacter yang didapat diuji sifat gramnya melalui tahapan-tahapan

pewarnaan sebagai berikut :

- Pewarnaan sel dengan menggunakan kristal violet 30 detik

- Pemberian mordan pada sel dengan larutan yod selama 30 detik

- Pencucuian dengan zat pelarut yaitu alkohol 95% selama 10-20 detik

- Pemberian zat warna penutup yaitu safranin selama 30 detik

12

c. Uji Endospora

Uji endospora diawali dengan menggoreskan bakteri Acetobacter pada

kaca preparat yang terbasahi air suling, untuk selanjutnya preparat ini dinamakan

preparat ulas. Preparat ulas kemudian ditutup dengan kertas saring whittman dan

dibasahi zat pewarna hijau malakit. Dilakukan pemanasan dan didinginkan setelah

5 menit. Selanjutnya kertas saring dibuang dan preparat diwarnai dengan safranin.

Kemudian difiksasi dan diamati dimikroskop.

d. Uji Katalase

Uji katalase dilakukan dengan dilakukan penambahan H2O2 pada bakteri

Acetobakter. H2O2 yang merupakan produk antara pada respirasi aerob adalah

racun bagi sel, oleh karenanya perlu segera diuraikan. Pengujian positif H2O2

ditandai munculnya gelembung O2 di sekitar medium.

e. Uji Oksidasi

Diambil bakteri Acetobacter dan dimasukkan dalam tabung reaksi.

Kemudian ditambahkan p-amino dimetil anilin. Pengujian positif adanya enzim

oksidase ditandai dengan muncul warna ungu, sedangkan pengujian negatif

berwarna zmerah muda. Enzim oksidase adalah tanda bakteri aerob.

f. Uji indol

Uji indol dilakukan untuk mengidentifikasi adanya triptofan yang ada

hampir disemua jenis protein. Degradasi triptofan oleh triptofanase diperoleh

asam piruvat, dan amonia sebagai nutrisi sel bakteri Acetobacter. Sedangkan indol

terakumulasi di medium dan pada penambahan dengan reagen koval, indol

bereaksi membentuk warna merah di permukaan media.

g. Uji H2S

Uji H2S digunakan untuk menunjukkan adanya penguraian asam amino

yang mengandung sulfur. H2S dapat teridentifikasi pada medium polipeptida yang

kaya akan asam amino dan ion Fe2+. Medium polipeptida yang digunakan adalah

TSIA (Triple Sugar Ion Agar) yang mengandung glukosa, laktosa, sukrosa,

phenol-red dan Fe2SO4. Pengujian positif H2S ditandai dengan adanya endapan

berwarna hitam pada medium.

13

Tahap Uji Potensi

Tahap uji potensi dilakukan dengan metode titrasi. Uji potensi diawali

dengan tahap pembuatan starter bakteri yang ditumbuhkan di medium cair yang

biasa digunakan di industri cuka dengan 3 variasi penambahan etanol, yaitu 5%,

7%, dan 9%. Komposisi medium cair tersebut adalah yeast extract 2%, variasi

etanol, asam asetat (merck) 1%, dan air suling 1000mL. Starter umur 24 jam,

diinkubasi pada suhu 36-40oC dengan goyangan 110rpm selama 14 hari. Starter

sebanyak 5ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer, diencerkan hingga 20ml dan

ditambahkan pp (penolphtalein) 5 tetes kemudian dititrasi menggunakan larutan

NaOH 0,5N. Dengan metode ini didapatkan volume NaOH untuk perhitungan

konsentrasi asam asetat dengan rumus standar titrasi.

Kontrol pertumbuhan bakteri digunakan alat berupa spektrofotometer dengan

panjang gelombang 560 nm untuk mengetahui tingkat pertumbuhan bakteri.

14

BAB IV

KESIMPULAN

Dari pembahasan yang telah dipaparkan dalam makalah ini, dapat ditarik

kesimpulan, sebagai berikut :

1. Metodologi dalam isolasi dan identifikasi bakteri Acetobacter dari kulit

pisang (Musa paradisiaca) ada beberapa tahap. Pertama, tahap persiapan

yaitu mempersiapkan segala keperluan yang diperlukan dalam tahap

isolasi, meliputi determinasi kulit pisang, penyediaan alat dan bahan, dan

sterilisasi. Setelah itu, melakukan tahap isolasi dengan tiga metode secara

berurutan yaitu metode cawan tuang, cawan gores, dan agar miring.

Kemudian, tahap identifikasi, yaitu pengujian Acetobacter yang

dilakukan dengan uji morfologi meliputi uji makroskopik dan

mikroskopik, dan uji biokimia. Terakhir melakukan tahap uji potensi

dengan metode titrasi.

2. Bakteri Acetobacter indigenous dari kulit pisang (Musa paradisiaca)

mempunyai potensi dalam menghasilkan asam asetat sehingga

mengefektifkan produksi cuka pisang.

15

16