LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

ROLENS F.M. BANI

1209017041

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS NUSA CENDANA

KUPANG

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Dasar TeoriELISA adalah suatu metode yang dikerjakan sebagai sarana mengukur kadar antigen atau

antibodi dalam suatu medium cair, seperti serum atau organ yang telah dicairkan/dilarutkan.

Metode ELISA yang dilakukan dalam praktikum ini merupakan metode untuk mengukur kadar IL-

6 dalam serum pasien. Prinsipnya adalah adanya ikatan antigen-antibodi yang akan dibaca

dengan reaksi enzimatis yang dapat mengakibatkan terjadinya perubahan intensitas warna pada

larutan. Intensitas warna ini kemudian akan diukur pada ELISA reader.

Metode ELISA dengan cara diatas adalah model ELISA indirek atau tidak langsung. Metode

ini menggunakan ikatan antara antibodi primer dengan antibodi sekunder yang telah

dikonjugasikan dengan biotin dan biotin ini akan diikat oleh enzim SAHRP yang akan bereaksi

dengan substrat TMB. Penggunaan model ELISA ini bertujuan supaya terjadi amplifikasi reaksi

enzimatis yang sehingga intensitas warna yang terjadi akan lebih kuat dan pembacaannya juga

lebih mudah.

Secara umum, proses pelaksanaan langkah-langkah ELISA sudah diterapkan dengan benar

dibawah bimbingan laboran dar Lab.Biomedik, dan semua peserta mengikuti dengan antusias

prosesnya mulai dari awal, namun karena memang keterbatasan alat, tidak semua mahasiswa

mencoba dari awal sampai akhir, dan dilakukan prosesnya secara bergantian pada tiap-tiap

proses.

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau ‘penetapan

kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai

laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang

relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan

pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi

antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor

(reporter label).

Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan

konjugat antigen–enzim atau konjugat antibodi–enzim, dan non-competitive assay yang

menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan

dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai

"Sandwich" ELISA.

Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik

"Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:

1. Well dilapisi atau ditempeli antigen.

2. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.

3. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti

peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya.

4. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi.

5. Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA reader

hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata kontrol

negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-negatif

suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif, dan

demikian juga sebaliknya.

Agar terjadi suatu reaksi warna pada elisa, maka dibutuhkan suatu antibodi yang dilabel

enzym, dan substrat yang diberi indikator warna yang dikenal dengan kromogen

Enzym yang digunakan untuk melabel antibodi antara lain :

Sedangkan substrat yang digunakan :

1. Alkalin fosfatase Alkali fosfat

2. Horseradish peroxidase peroksidase

3. Beta- galaktosidase Beta- galaktosa

Pada elisa ada beberapa metoda antara lain :

1. Direct elisa

2. Indirect elisa

3. Sandwich elisa

4. Compettitive elisa.

1.2 Alat dan Bahan

1. Komputer dan Printer

2. Elisa reader

3. Finntip 100 µl, 1000 µl

4. Plat mikrotiter

5. Multichannel pipet

6. Mikropipet multichannel 10-100ul

7. Tabung ukur

8. Tippipet

9. Glass ukur

10. Reservior

11. Aquades.

1.3 Bahan-bahan yang dibutuhkan :

ELISA Kit Hog Cholera yang terdiri dari larutan pengencer

Larutan pencuci

Larutan substrat TMB

Larutan stop

Control serum positif

Control serum negatif

Larutan conjugat (HRPO anti CSFV konjugat)

Antigen

Aquades

1.4 Waktu Praktikum

Hari / tanggal : Senin, 16 Desember 2013

Waktu : Pkl 10.00-15.00

1.5 Tempat Praktikum

Laboratorium Upt Veteriner

2.4 Prosedur Kerja

a) Menyiapkan sampel serum. Serum yang ditampung dalam volume kecil pada tabung mikro

eppendorf atau Nunc (1,5 ml) dan beku dekeluarkan dari freezer. Biarkan serum mencair.

b) Pada mikrotiter plat yang sudah dilapis antigen (CSFV E2) diteteskan 50 μl larutan pengencer

sampel, setelah itu ditambahkan 50 μl sampel serum (1:2) pada pada semua lubang plat

mikro kecuali lubang G11-12 ditambahkan 50 μl kontrol serum positif dan lubang H11-12

ditambahkan 50 μl kontrol serum negatif (1:2)

c) Plat ditutup dengan penutup plat dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit.

d) Plat dicuci sebanyak tiga kali dengan larutan pencuci buffer (300 μl tiap lubang) dan sisa

buffer dibuang bersih.

e) Pada semua lubang plat ditambahkan 100 μl konjugat dan plat diinkubasi kembali pada suhu

37oC selama 30 menit.

f) Plat dicuci tiga kali dengan larutan pencuci dengan menambahkan masing-masing lubang

plat 300 ul.

g) Pada semua lubang plat ditambahkan 100 μl larutan substrat TMB.

h) Plat diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit setelah itu reaksi distop dengan

menambahkan 50 ul larutan penyetop.

i) Reaksi dibaca pada Elisa reader menggunakan filter 450 nm.

BAB II

HASIL DAN PEMBAHASAN

2.1 Hasil

10/BB/ST 03/BB/ST 14/BB/ST 16/BB/ST 24/BB/ST 15/BB/ST 07/BB/ST 25/BB/ST

103.7443 98.81279 101.5525 -10.0457 -22.8311 103.1963 98.63014 99.72603

+ + + - - + + +

Keterangan : (+) ada anti body ≤ 40%

(-) tidak ada anti body ≥ 40%

2.2 pembahasan

ELISA adalah suatu metode yang dikerjakan sebagai sarana mengukur kadar antigen

atau antibodi dalam suatu medium cair, seperti serum atau organ yang telah dicairkan/dilarutkan.

Metode ELISA yang dilakukan dalam praktikum ini merupakan metode untuk mengukur kadar IL-6

dalam serum pasien. Prinsipnya adalah adanya ikatan antigen-antibodi yang akan dibaca dengan

reaksi enzimatis yang dapat mengakibatkan terjadinya perubahan intensitas warna pada larutan.

Intensitas warna ini kemudian akan diukur pada ELISA reader.

Metode ELISA dengan cara diatas adalah model ELISA indirek atau tidak langsung. Metode ini

menggunakan ikatan antara antibodi primer dengan antibodi sekunder yang telah dikonjugasikan

dengan biotin dan biotin ini akan diikat oleh enzim SAHRP yang akan bereaksi dengan substrat TMB.

Penggunaan model ELISA ini bertujuan supaya terjadi amplifikasi reaksi enzimatis yang sehingga

intensitas warna yang terjadi akan lebih kuat dan pembacaannya juga lebih mudah.

Secara umum, proses pelaksanaan langkah-langkah ELISA sudah diterapkan dengan benar

dibawah bimbingan laboran dar Lab.Biomedik, dan semua peserta mengikuti dengan antusias

prosesnya mulai dari awal, namun karena memang keterbatasan alat, tidak semua mahasiswa

mencoba dari awal sampai akhir, dan dilakukan prosesnya secara bergantian pada tiap-tiap proses.

Karena prosesnya yang berganti-gantian, didapatkan ketidak akuratan pada hasil standart IL-

6,Kemungkinan penyebab dari ketidak akuratan standart bisa karena kekuatan pipetting dan akurasi

tiap mahasiswa yang tidak sama.Ada yang benar saat pippeting, dan mungkin saja ada yang kurang

benar saat melaksanakannya Oleh karena itu metode ELISA seharusnya dilakukan oleh 1 orang saja

sehingga keakuratan dan kekuatan dalam melaksanakan langkah-langkah ELISA akan konsisten.

Karena standart IL-6 yang kurang akurat, maka untuk melanjutkan pelatihan digunakan

standart sampel lain yaitu (uPAR) untuk menghitung kadar IL-6 dari sampel. Seharusnya standart

yang digunakan adalah standart yang di-running bersama dengan sampel pada saat yang sama.

Walaupun zat yang diukur sama, kita tidak boleh menggunakan standart suatu zat dari ELISA

sebelumnya untuk digunakan pada ELISA yang sedang di-running, apalagi menggunakan standart zat

yang berbeda. Kembal lagi pada tujuan pembelajaran praktikum ini, maka hal tersebut kami lakukan

agar proses pembelajaran berjalan sesuai, dan yang terpenting mahasiswa mengetahui mana yang

benar, dan mana yang salah, serta memahami solusi pemecahan masalahnya.

Untuk menghitung kadar dari IL-6 digunakan cara regresi linier, sama dengan cara yang

digunakan untuk elektroforesis, namun persamaan garis yang dipakai pada standart adalah

persamaan logaritma. Pertama, absorbansi IL-6 hasil spectrophotometri dibuat pada tabel pada Ms.

Exel. Kemudian dibuat logaritma dari data absorbansi tersebut dan dibuat logaritma dari

standart,lalu dibuatlah persamaan garis terhadap Log absorbansi dan Log konsentrasi dengan sumbu

X sebagai Log konsentrasi dan sumbu Y sebagai Log absorbansi. Absorbansi dari sampel selanjutnya

juga dibuat logaritmanya. Dengan persamaan garis tersebut, dapat dihitung dan diketahui logaritma

konsentrasi dari IL-6. Berikutnya dibuat anti-logaritma dari Log konsentrasi IL-6 yang sudah

didapatkan, sehingga akan diketahui konsentrasi IL-6. Namun konsentrasi IL-6 ini adalah konsentrasi

dalam pengenceran 25 kali, sehingga untuk mengetahui konsentrasi IL-6 sesungguhnya dalam

sampel, konsentrasi yang telah kita dapat ini dikali 25.

BAB IV

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan :Jumlah anti bodi

dalam spesimen Hog Cholera tinggi, sehingga anti gen dan konjugat ikatannya lebih

sedikit. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa spesimen tersebut positif (+) anti bodi

Hog Cholera, warnanya bening . Semakin sedikit anti bodi, maka semakin banyak ikatan

konjugat dengan anti gen yang terbentuk sehingga warnanya kuning yang berarti negatif

(-).

DAFTAR PUSTAKA

- PENUNTUN PRAKTIKUM VIROLOGI-ENZIM-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA).

- http://id.wikipedia.org/wiki/ELISA

- http://catatankuliah-heri.blogspot.com/2011/02/uji-elisa.html

- http://iasius.blogspot.com/2012/12/elisa.html