laporan-bahan-alam-nureee.docx

AKTIVITAS ANTIBOTIK DARI BAHAN ALAM

I. KOMPETENSI UMUMUntuk mengetahui dan memahami cara pengujian aktivitas

antimikroba dari bahan alsam terhadap mikroorganisme tertentu.

II. KOMPETENSI KHUSUS1. Menjelaskan latar belakang dasar pemilihan tanaman yang diujikan

2. Menjelaskan metode kerja uji skrining, KHM dan KBM secara

skematik

3. Menjelaskan metode kerja uji difusi agar secara skematik

4. Menjelaskan metode kerja uji KLT-Bioautografi secara skematik

5. Menjelaskan hasil pengujian aktivitas antimikroba dari sampel

tanaman yang diuji.

III. PRINSIP PERCOBAANPrinsip percobaan adalah melakukan pengujian uji aktivitas

antimikroba dari bahan alam dengan menggunakan dua metode yaitu

metode difusi agar dengan prinsip mengamati zona hambatan dengan

konsentrasi yang berbeda dan metode KLT bioatografi dengan

menggunakan medium NA yang telah disuspensikan dengan bakteri

menggunakan sampel daun Jati.

IV. TINJAUAN PUSTAKAPengujian mikrobiologi memanfaatkan mikroorganisme

sebagai indikator pengujian. Dalam hal ini mikroorgnisme digunakan

sebagai penentu konsentrasi komponen tertentu pada campuran

kompleks kimia, untuk mendiagnosis penyakit tertentu, serta untuk

menguji bahan kimia guna menentukan potensi mutagenik atau

karsinigeneik suatu bahan. Macam-macam uji yang dapat dilakukan

SURYA BULANDARI R NASRUL HAQ S.Farm15020130270


adalah uji antibiotik/antimikroba, bioautografi, uji vitamin dan asam

amino, uji Ames dan penggunaan mikroorganisme sebagai model

metabolisme obat mamali (Pratiwi, 2008).

Bioautografi berasal dari kata bio=mahluk hidup,

autografi=melakukan aktivitas sendiri. Menurut Betina (1972),

bioautografi adalah suatu metode pendeteksian untuk menemukan

suatu senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan cara

melokalisir aktivitas antimikroba tersebut pada suatu kromatogram.

Metode ini memanfaatkan pengerjaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

Pada bioautografi ini didasarkan atas efek biologi berupa antibaketri,

antiprotozoa, antitumor dan lain-lain dari substansi yang diteliti. Ciri

khas dari prosedur bioautografi adalah didasarkan atas teknik difusi

agar dimana senyawa antimikrobanya dipndahkan dari lapisan KLT ke

medium agar yang telah diinokulasikan dengan merata bakteri uji

yang peka. Dari haasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan

terlihat zona hambatan disekeliling dari spot dari KLT yang telah

ditempelkan pada media agar. Zona hambatan ditampakkan oleh

aktivitas senyawa akrif yang terdapat di dalam bahan yang diperiksa

terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji (Djide, 2006).

Bioatografi dapat dibedakan atas 3 kelompok (Djide, 2006) :

1. Bioautugrafi langsung, yaitu dimana mikroorganisme tumbuh

secara langsung diatas lempeng KLT. Prinsip kerja dari metode ini

adalah suspensi mikroorganisme uji yang peka dalam medium cair



dsemprotkan pada permukaaan kromatografi Lapis Tipis yang telah

dihilangkan sisa-sisa eluen yang menempel pada lempeng

kromatogram. Setelah itu dilakukan inkibasi pada suhu dan waktu

tertentu.

2. Bioautografi kontak, dimana senyawa antimikroba dipindahkan

darilempeng KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan bakteri

uji yang peja secara merata dan melakukan kontak langsung.

Metode ini didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah

dipisahkan dengan KLT atau kromatografi kertas. Lempeng

kromatogram tersebut ditempatkan diatas permukaan medium NA

yang telah diinokulasikan dengan mikroorganisme yang sensitif

terhadap senyawa anitimikroba yang dianalisis.

3. Bioautografi pencelupan, dimana medium agar telah diinokulasikan

dengan suspensi bakteri dituang diatas lempeng KLT. Pada

prakteknya metode ini dilakukan sebagai berikut yaitu bahwa

lempeng kromatografi yang telah diilusi, diletakkan dalam cawan

petri, sehingga permukaannya tertutup oleh medium agar yang

berfungsi sebagai "base layer". Setlah medium agar memadat,

selanjutnya dituangi medium yang telah disuspensikan dengan

kultur mikroba yang telah disuspensikan mikroba uji yang berfungsi

sebagai "seed layer" kemudian diinkubasikan pada suhu dan waktu

yang sesuai.



Metode Difusi (Pratiwi, 2008) :

1. Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan

aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba

diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme

yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih

mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan

mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media

agar.

2. E-test

Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC

(minimum inhibitory concentration) atau KHM (kadar hambat

minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba

untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.

Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung

agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan

diletakkan pada permukaan agar yang telah ditanami

mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang

ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang

menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.

3. Ditch-plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang

diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media

agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur



dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan kea rah parit

yang berisi agen antimikroba.

4. Cup-plate technique

Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, dimana dibuat

sumur pada media agar yang telah ditanami dengan

mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba

yang akan di uji

5. Gradient-plate technique

Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar

secara teoritis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar

dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian

dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring.

Nutrisi kedua selanjutnya dituang diatasnya.

Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen

antimikroba berdifusi dan permukaan media mongering. Mikroba

uji (maksimal 6 macam) digireskan pada arah mulai dari

konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai

panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang

mungkin dibandigkan dengan panjang pertumbuhan hasil

goresan.



V. METODE KERJA

a. Alat

Adapun alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu

bunsen, cawan petri, gelas erlenmeyer, ose bula, pipa kapiler dan

vial.

b. Bahan

Adapun bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu air

steril, ekstrak jati, medium GNA, dan lempeng KLT.

c. Cara Kerja

1. Pengujian Skrining Antimikroba

Ekstrak daun jati dilarutkan dalam DMSO (200µl = 0,2 mL)

ditambahkan 9,8 mL Glukosa Nutrien Agar (GNA) yang telah

dicairkan dengan konsentrasi sampel 1 mg/mL media. Campuran

tersebut dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat.

biakan yang telah diencerkan diratakan dengan menggunakan

metode surface plate. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37oC

selama 24 jam.

2. Uji KLT-Bioautografi

Hasil identifikasi KLT dengan eluen yang terbaik dilanjutkan

dengan uji KLT Bioautografi langsung dengan cara media GNA

steril sebanyak 10 mL dituang ke dalam cawan petri steril,

lempeng KLT yang telah dielusi dengan eluen yang cocok

diletakkan di atas permukaan medium agar yang telah diinokulasi



dengan mikroba uji dan dibiarkan selama 30 menit setelah itu

lempeng tersebut diangkat dan dikeluarkan. Selanjutnya media

diinkubasi pada suhu 37oC selama ± 24 jam (bakteri) dan 27oC

selama ± 72 jam (jamur).

3. Uji Difusi Agar

Hasil penyarian tumbuhan dibuat variasi konsentrasi tertentu

untuk dilakukan pengujian menggunakan mikroba uji yang telah

ditentukan. Dibuat based layer dan seed layer pada cawan petri,

setelah setangah memadat dimasukkan pencadang, kemudian

diisi sampel tanaman tersebut. Diinkubasi 1 x 24 jam untuk bakteri

pada suhu 37oC dan 3 x 24 jam untuk jamur pada suhu kamar.

Setelah dinkubasi, dilakukan pengukuran diameter hambatan.



VI. HASIL PRAKTIKUM

a. Data Pengamatan

1. Tabel Uji Skeining

Klp Sampel [ ]Bakteri Uji

EC ST SM SA PA SE VC SD

1Ekstrak

gamal0,1% - - - - - - + -

2Ekstrak

Pulai0,1% - - - - - - + +

3Ekstrak Jati

Etanol

0,1% - - - - - + - -

1% - - - - - - - -

4

Ekstrak

daun jambu

mente

0,1% - - + - - - - -

1% - - + + - - + -

5

Ekstrak

Daun jati

metanol

0,1% + - - - - + + -

1% + - - - + - - -



2. Tabel Uji Aktivitas Antibiotik

Kel. Sampel Bakteri uji Konsentrasi

Zona hambat

I II III RATA-RATA

1 Ekstrak daun gamal

0,1 %1 %

10 %

2 Ekstrak Daun Pulai

VC0,1 %1 % 0 0 0 0

10 % 0 0 0 0

EC0,1 %1 %

10 %

3 Ekstrak Daun Jati SE

0,1 % 15 17 16 161 % 23 20 22 21,67

10 % 22 24 25 23,67

4 Ekstrak Daun Jambu mente

SA0,1 % 0 0 0 01 %

10 %

SM0,1 % 0 0 0 01 %

10 %

5 Ekstrak Daun Jati

PA0,1 % 9 9 10 9,31 % 15 19 15 16,3

10 % 24 23 21 22,6

SE0,1 % 10 11 10 10,31 % 12 11 14 12,3

10 % 23 24 24 23,6

3. Tabel Bioautografi KLTKlp Sampel Bakteri Uji Jarak Noda Nilai Rf

1 Ekstrak gamal VC - -

2 Ekstrak Pulai VC 4,2 0,76EC 3,5 0,64

3 Ekstrak Jati Etanol SA

3,2 0,582,3 0,411 0,18

4 Ekstrak daun jambu mente

SM - -SA - -

5 Ekstrak Jati metanol

SE 5,1 0,972

PA 2,5 0,4545,1 0,972



b. Foto pengamatan- Uji Skrining

Laboratorium MikrobiologiFakultas Farmasi UMI

Medium PDA 1 %


Jamur

Medium dan ekstrak jati


Medium PDA 0,1%

Jamur

Medium dan ekstrak jati



Medium NA 0,1 % (1)


Medium NA 1 % (1)


koloni

Medium

medium

koloni



Medium NA 0.1 % (2)


Medium NA 1 % (2)


medium

koloni

medium

koloni


- Uji Difusi Agar


Medium NA 0,1 %


Medium NA 1 %


medium

zona hambat

medium

zona hambat


- Uji Bioutografi


Medium NA 0,1 %


Medium NA 1 %

VII. PEMBAHASAN


Koloni

zona hambat

Koloni

zona hambat


Pada pengujian dari aktivitas antibiotic dari bahan alam berupa

Uji yang dilakukan pada percobaan ini adalah uji Skrining, uji Difusi

Agar, dan uji KLT-Bioautografi.

Sampel yang digunakan yaitu ekstrak daun jati karena jati

diduga memiliki efek sebagai antibiotik oleh karena itu dilakukan uji

pada tanaman jati berfungsi sebagai antibiotik yang dapat mencegah

pertumbuhan bakteri dan jamur tertentu atau tidak.

Pada uji skrining, bakteri atau jamur pada daun jati dilakukan uji

apakah dapat menghambat pertumbuhan. Pertama ekstrak dilarutkan

dengan DMSO sebanyak 0,2 mL dan ditambahkan 9,8 mL medium

NA untuk pertumbuhan bakteri dan medium PDA untuk pertumbuhan

jamur. Setelah itu dihomogenkan dan setelah homogen dituang ke

dalam cawan petri steril lalu didiamkan dan dibiarkan memadat.

selanjutnya diambil 1 ose bakteri lalu digoreskan ke medium NA dan

1 ose suspensi jamur digoreskan pada medium PDA. Kemudian

diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37oC untuk bakteri dan 3 x

24 jam pada suhu kamar untuk jamur.

Dari hasil uji skrining yang tidak ada pertumbuhan koloni

dilanjutkan dengan uji Difusi Agar dan uji KLT-Bioautografi. Untuk uji

difusi agar, dilarutkan ekstrak dengan DMSO sampai larut kemudian

dicukupkan dengan air steril sampai 10 mL dan dibuat 3 konsentrasi,

konsentrasi 0,1%, 1%, dan 10%. Kedalam masing-masing

konsentrasi dimasukkan paper disk dan direndam selama 20 menit.



Langkah selanjutnya disiapkan medium. Medium NA dipipet

sebanyak 10 mL dan dimasukkan ke dalam vial lalu disuspensikan

dengan bakteri. Kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri steril

yang sudah dipatron dan dibiarkan memadat. Setelah memadat,

paper disk yang telah direndam dalam larutan ekstrak dimasukkan ke

dalam cawan petri berisi medium dan diinkubasi selama 1 x 24 jam

kemudian diamati dan diukur zona hambatnya.

Pada uji KLT Bioautografi lempeng ditotol dengan ekstrak yang

sudah dilarutkan dengan DMSO, selanjutnya lempeng dimasukkan

ke dalam chamber yang berisi eluen. Setelah eluen sampai batas

atas dari lempeng, lempeng dikeluarkan dari chamber dan dilihat

nodanya pada lampu UV. Selanjutnya disiapkan medium. Medium

NA dipipet sebanyak 10 mL dan dimasukkan ke dalam vial dan

disuspensikan dengan bakteri. Kemudian medium tersebut dituang

ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat. setelah memedat

lemprng yang sudah dielusi ditempalkan pada medium dan dibiarkan

selama 30 menit. Setelah 30 menit lampeng dicabut dan medium

diinkubasi selama 1 x 24 jam pada incubator kemudian diamati dan

diukur zona hambatnya.

Hasil yang diperoleh bahwa sampel ekstrak dapat

menghambat perumbuhan Vibrio cholera dengan konsentrasi 0,1%

dengan lebar zona hambat 8,3 mm, sedangkan pada konsentrasi 1%

dan 10 % tidak terdapat zona hambat yang muncul.



VIII. KESIMPULAN

Hasil dari percobaan dapat disimpulak bahwa sampel ekstrak

dapat menghambat perumbuhan Vibrio cholera dengan konsentrasi

0,1% dengan lebar zona hambat 8,3 mm.



X. LAMPIRAN

a. Uraian Bahan

1. Agar (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Agar

Nama lain : Agar-agar

Pemerian : Berkas potongan memanjang, tipis seperti

selaput dan berlekatan, atau berbentuk

keeping, serpih atau butiran; jingga lemah

kekuningan, abu-abu kekuningan sampai

kuning pucat atau tidak berwarna; tidak

berbau atau berbau lemah; rasa berlendir;

jika lembab liat; jika kering rapuh.

Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air; larut dalam air

mendidih.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

Kegunaan : Sebagai pemadat

2. Aquadest (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Aqua destillat

Sinonim : Aquades

RM / BM : H2O / 18,02

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau,

tidak berasa.

Kegunaan : Sebagai pembilas




3. Dekstrosa (Ditjen POM, 1979)

Nama resmi : Dextrosum

Nama lain : Dekstrosa, Glukosa

RM/BM : C6H12O6 / 180,16

Pemerian : Hablur tidak berwarna, serbuk hablur atau

serbuk granul putih; tidak berbau; rasa

manis.

Kelarutan : Mudah larut dalam air; sangat mudah larut

dalam air mendidih; larut dalam etanol

mendidih; sukar larut dalam etanol


Kegunaan : Sebagai sumber karbohidrat

4. Medium NA

Komposisi : Pepton, ekstrak Beff, agar, dan aquadest.

5. Medium PDA

Komposisi : Kentang, dekstrosa, agar, dan aquadest.


laporan-bahan-alam-nureee.docx

Documents