The MLC was defined as the lowest concentration showing 100% growth inhibition, resulting from the subculture of MIC plates. All the experiments were performed in duplicate and repeated independently three times.

Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasi. Suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya diambil 1 ml dengan menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks hingga homogen. Selanjutnya tabung tersebut diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam pada inkubator kemudian diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol. Konsentrasi terendah dari larutan sampel yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri (ditandai dengan mulai adanya kejernihan secara visual oleh tiga pengamat secara independen) ditentukan sebagai Kadar Hambat Minimum (KHM).

Penentuan KBM dengan perhitungan jumlah koloni metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi diatas diambil 50μl untuk tiap konsentrasi kemudian diteteskan pada MHA sebanyak 6 replikasi. Spesimen didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 370C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit)/ ml cairan (suspensi).Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengencerandan faktor pengali. Pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50μl, maka perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil yang sesuai standar (CFU/ml).

3.8 Analisis DataData hasil penelitian diperoleh dengan cara mengamati KHM dan KBM bahan coba pada berbagai konsentrasi. Konsentrasi bahan coba yang mulai jernih pada konsentrasi terkecil sebagai KHM sedangkan konsentrasi bahan coba yang sudah mampu membunuh bakteri atau tidak menunjukkan adanya pertumbuhan koloni ditandai sebagai KBM.

Uji daya hambat1. Persiapkan 6 buah cawan petri steril2. Ketiga cawan petri tersebut diisi dengan medium NA yangtelah disterilkan. Tunggu medium hingga memadat3. Ambil isolate murni yang telah dipersiapkan dengan menggunakan ose bulat. Kemudian dimasukkan kedalam tabung yang berisi aquadest steril.4. Isolat yang telah bercampur dengan aquadest tersebut kemudian digoreskan ke medium NA dengan menggunakan cotton buds5. Lakukan hal yang sama pada cawan petri kedua sampai keenam6. Ambil beberapa paper disk dan kemudian direndam pada tabung yang berisi konsentrasi ekstrak buah yang berbeda7. Untuk cawan petri pertama sampai cawanpetri ketiga masing–masing diberikan paper disk yang telah direndam dengan ekstrak buah kaktus pada konsentrasi 2,5% sampai 100%8. Masukkan kedalam inkubator selama 1x24 jam

Daya hambat diketahui berdasarkan pengukuran diameter Zona inhibisi (zona bening) yang terbentuk disekitas paper disc. Pengukuran tersebut menggunakan jangka sorong. Daya hambat minimal diketahui dari konsentrasi terkecil yang sudah dapat menghambat pertumbuhan streptoccus mutans secara nyata.

Pengujian daya anti bakteri ekstrak propolis terhadap pertumbuhan bakteri campur karies dentin profunda dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode kontak langsung (Fitriannur, 2009). Dengan metode ini

terjadi kontak langsung antara bakteri uji dengan ekstrak. Metode ini dilakukan dengan cara sebagai berikut:a. Lakukan pengenceran pada ekstrak propolis. b. Sebanyak 0,7 ml suspensi bakteri ditanam dalam 5 ml ekstrak propolis berbagai konsentrasi uji. Kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.c. Setelah diinkubasi, lakukan strik subkultur pada media Mueller Hinton agar. Masing-masing kultur bakteri pada media BHIB diambil sebanyak 0,1 ml inokulum suspensi dari ekstrak propolis kemudian distrik pada media Mueller Hinton agar. d. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian amati pertumbuhan bakteri hasil strik. Hasil strik yang tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri di jadikan sebagai dugaan KHM. e. Ambil 0,1 ml inokulum dari 2 tabung diatas dugaan KHM, tabung dugaan KHM dan 2 tabung dibawah dugaan KHM kemudian masing-masing diratakan dengan cara swabpada media Mueller Hinton agar yang berbeda. f. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian amati jumlah koloni yang tumbuh. g. Kontrol positif dibuat dengan media padat Mueller Hinton agar yang ditambah dengan 0,1 ml suspensi bakteri bakteri uji tanpa penambahan ekstrak propolis. h. Kontrol negatif dibuat dengan media padat Mueller Hinton agar tanpa penambahan bakteri uji dan ekstrak propolis. i. Konsentrasi hambat minimal (KHM) dan konsentrasi bunuh minimal

(KBM) ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media Mueller Hinton agar secara manual yang dinyatakan dengan colony forming unit(CFU) dan dibandingkan dengan kontrol positif dan kontrol negatifnya. Perhitungan tersebut diulang tiga kali oleh tiga pengamat yang berbeda