Pengaruh HPC (HypoxicPreconditioning) pada Aktivitas Enzim Antioksidandi HI (Hypoxic Ischemic) Penyebab Kerusakan Otak dengan Sampel TikusABSTRAKAIM: HI (hipoksia-iskemik) adalah penyebab utama cedera otak pada kematian neonatal dan morbiditas neurologis jangka panjang. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki efek dari HPC (HypoxicPreconditioning) pada oksidatif-antioksidan dalam HI neonatal model otak. BAHAN dan METODE: Lima puluh lima tikus tua ditempatkan selama 7 hari, Pengendalian, HPC, HPC + HI insult , dan HI kelompok insult . HPC, The HPC + HI kelompok insult menjadi sasaranhipoksia (37 C, 8% O2) dan kelompok yang mengontrol normoxia selama 2,5 jam. Dua puluh empat jam kemudian, tikus di HPC + HI insult dan kelompok insult HI yang tersambung HI diproduksi oleh oklusi unilateral kanan karotid umum (CCA) arteri kemudian dikombinasikan selama 90 menit dengan hipoksia. Empat jam setelah pemulihan, tingkat malondialdehid (MDA) dan aktivitas superoxide dismutase (SOD), dan glutation peroksidase (GPX) ditentukan dalam jaringan otak tikus.HASIL: Temuan dari penelitian ini menunjukkan peroksidasi lipid meningkat dan terjadi penurunan aktivitas antioksidan HI dalam otak tikus.

KESIMPULAN: HPC (Hypoxic Precondition) memberikan dampak dalam perubahan aktivitas antioksidan. KATA KUNCI: Enzim antioksidan, kerusakan otak hipoksia iskemik, lipid peroxidation,pelindung saraf, preconditionin.PENDAHULUAN

Konsep preconditioning iskemik diperkenalkan pada akhir 1980-an. Konsep ini memaksa neuron menjadi lebih tahan terhadap iskemik insult. Bagaimana modifikasi neuron beradaptasi dengan iskemik selanjutnya tidak sepenuhnya dipahami, tetapi melibatkan beberapa mekanisme perlindungan. Ada banyak studi yang menyelidiki efek dari iskemia hipoksia pada otak tikus neonatal dan hasilnya telah memberikan informasi mengenai mekanisme yang mungkin terlibat. Sarco et al menyatakan bahwa otak neonatal lebih rentan dan selektif terhadap tekanan oksidatif. Beberapa mekanisme yang terkait dengan spesies metabolisme reaktif oksigen akan diubah dengan meningkatnya kerentanan. Ini merupakan akumulasi peningkatan hidrogen peroksida dengan neurotoksisitas . Meningkatnya neurotoksisitas dari akumulasi H2O2 berkaitan dengan kemampuan pengambilan dari sistem saraf yang belum sempurna, seperti aktivitas glutation peroksidase rendah. Berperan dalam perkembangan enzim yang bekerja pada system saraf. Sistem saraf tersebut meliputi zat besi yang lebih bebas. Sehingga H2O2 terakumulasi karena rusaknya mekanisme besi bebas yang ada. Hal ini menyebabkan paparan dalam OH di radikal bebas dapat merusak. Perubahan cepat H2O2 ke OH dalam pengaturan dari besi bebas, membangunnya sistem saraf yang belum sempurna untuk peningkatan cytotoxicity (8, 25, 26). Mishra et al, menyatakan peran oksigen radikal bebas (OFR) dalam menginduksi iskemia reperfusi. Hal ini menunjukkan bahwa hasil OFR melalui peroxidation lipid dari membran sel, kerusakan subselular DNA organel lainnya. Neonatal otak sangat rentan terhadap kerusakan oksidatif karena tinggi konsentrasi asam lemak tak jenuh, rendah konsentrasi antioksidan, tingginya tingkat konsumsi oksigen dan ketersediaan redoks-aktif besi (5, 8, 13). Peristiwa hipoksia biasanya terjadi pada bayi baru lahir, tetapi pada perkembangan otak belum dibuktikan. Mekanisme yang mendasari (s) untuk pelindung saraf dari preconditioning hipoksia (HPC) pada tikus dewasa belum dijelaskan tapi mungkin melibatkan induksi gen atau protein positif yang mempengaruhi energi oksidatif dan peristiwa metabolisme yang terjadi selama hipoksia iskemia, yang berakhir pada kerusakan otak (11, 26, 29). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek HPC pada antioksidan oksidatif- dalam hipoksia neonatal iskemik (HI) pada otak dan untuk mengetahui hubungan antara system antioksidan pada peningkatan perlindung saraf.BAHAN dan METODE

Penelitian ini telah disetujui oleh Komite Etika Uludag Universitas dan semua prosedur penggunaan hewan dilakukan sesuai aturan. Selama 7 hari anak tikus dari kedua jenis kelamin lebih berat dari 12g digunakan dalam eksperimen, ditempatkan diwadah di bawah jam 12:12 selama 24 jam, dengan makanan dan air yang tersedia pada libitum selama penelitian. Hewan-hewan dibagi menjadi 4 kelompok. Kelompok I - kontrol, Kelompok II - HPC saja, Kelompok III-HPC + HI, Grup IV - HI saja:1. Tabel I: SOD jaringan Neonatal otak anak tikus, GPX dan MDA tingkat dalam 4 kelompok. Kelompok I - kontrol, Kelompok II - HPC saja, Kelompok III-HPC + HI, Grup IV - HI saja. Kelompok 1, kontrol (n: 13) Bukan HPC atau HI insult yang digunakan. Mengatur hewan pada suhu 37 C dalam kondisi normoxic.2. Kelompok 2, HPC (n: 14) 150 min preconditioning hipoksia diproduksi dengan metode yang dijelaskan di bawah. Sebuah hipoksik iskemik insult tidak digunakan.3. Kelompok 3, HPC + HI insult (n: 14) Pada P6, 150 min preconditioning hipoksia diproduksi oleh metode yang dijelaskan di bawah ini. Sebuah iskemik hipoksia insult digunakan pada P7.4. Kelompok 4, HI insult (n: 14) sebuah iskemik hipoksia insult digunakan pada P7.

Hipoksia preconditioning dan Hipoksia-iskemia Model Preconditioning hipoksia dilakukan acak pada anak tikus :

1. digunakan 4 liter di P6 sebagai dijelaskan sebelumnya.

2. anak tikus ditempatkan di atmosfer lembab 8% O2 / 92% N2 disiapkan pada ruangan tertutu, sebagian terendam dalam wadah berisi air untuk mempertahankan gas campuran pada temperatur 37 C selama 2,5 jam. \

3. maksimal 3 dari hewan yang diperbolehkan per ruangan. digunakan modifikasi persiapan Levine yang dijelaskan oleh Rice et al. untuk menghasilkan HI.4. anak tikus itu dibius dengan isoflurane (4% dalam silinder diikuti oleh 2% oleh topeng).5. dibuat garis tengah suatu serviks sayatan dan double diligasi kanan karotid umum arteri (CCA) dengan 5-0 jahitan, mengentalkan dan memutus arteri antara dua ligatures.6. sepanjang prosedur tikus disimpan pada suhu 37C.7. mikroskop operasi ini digunakan untuk mengkonfirmasi prosedur bedah. Lamanya anestesi dan operasi tidak melebihi 5 menit perekor dengan 2,5 jam pada kondisi 8% oksigen.8. hewan-hewan itu diperbolehkan untuk pulih dalam stoples terbuka selama 15 menit sebelum dikembalikan ke wadahnya. Anak tikus diizinkan untuk pulih selama 2 jam.9. pada akhir pemulihan, otak dari anak tikus telah dihapus menjadi evaluasi untuk tingkat peroksidasi lipid dan antioksidan enzim (superoxide dismutase dan glutathione peroksidase aktif). Sebuah skema diagram langkah eksperimental ditunjukkan pada Gambar 1.Penentuan SOD dan aktivitas GPX

SOD dan GSH-Px ditentukan menggunakan kit Randox [Antrim, Inggris]. Secara singkat, penentuan aktivitas SOD didasarkan pada produksi O2-anion oleh xantine / xantine oksidase sistem. GSH-Px ini dikatalisis oleh oksidasi glutation tereduksi dengan adanya kumena hidroperoksida. Generasi nikotinamida adenin dinukleotida fosfat adalah diukur secara spektrofotometri pada 340 nm. Aktivitas dari GSH-Px dan SOD dinyatakan sebagai U / mg protein.Penentuan kegiatan MDA

Tingkat jaringan otak MDA ditentukan oleh Asam thiobarbituric metode, dan dinyatakan sebagai nmol MDA / mg protein. Otak homogenat jaringan yang dipersiapkan sebagai berikut :1. 0,25 g sampel jaringan adalah homogen dalam 2,5 ml air dingin buffer klorida kalium 1,15%.2. Aliquot dari homogenat tersebut kemudian digunakan untuk analisis peroksida lipid. Tingkat cedera iskemik hipoksia adalah diperiksa secara histopatologi untuk mengkonfirmasi kerusakan.3. Spesimen hippocampal ketebalan 1mm adalah diperoleh dari 2mm anterior dan 2mm posterior untuk bregma tersebut. Dari setiap spesimen, tebal 5 m bagian, diwarnai dengan Hematoksilin dan Eosin.4. Dihitung CA1-CA3, saraf berkurang dengan menghitung neuron yang abnormal di lima tingkat hippocampus.5. Diamati slide di bawah perbesaran 400x, neuron eosinofilic dihitung dalam lima bidang yang berbeda.6. Pemeriksaan mikroskopis cahaya dilakukan oleh pemeriksa buta untuk penelitian (Gambar 2 dan Gambar 3).

Statistical Analysis

Comparisons between groups were performed using the KruskalWallis H-test analysis of variance by ranks. In case of a significant H-value (significance level was set at p0.05), the

MannWhitney U-test was used for matched pairs post hoc comparisons.HASILHasil penelitian ini menunjukkan lipid peroksidasi ada yang meningkat dan ada yang menurun untuk aktivitas antioksidan HI dalam otak tikus. Selanjutnya, HPC bisa menimbulkan dampak protektif, karena kadar MDA dari kelompok + HPC HI tidak jauh lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol dan kelompok HPC. Meskipun perbedaan statistik tidak mencapai tingkat signifikansi, tingkat MDA lebih rendah di kelompok HPC dan + HPC HI ketika dibandingkan dengan kelompok kontrol dan HI masing masing, mungkin mencerminkan pelindung efek dari HPC mengenai situasi HI. Hal yang menguntungkan efek dari HPC mungkin tidak berhubungan dengan awal perubahan dalam kegiatan antioksidan, karena aktivitas SOD yang secara signifikan lebih rendah di HPC + HI dan kelompok HI dibandingkan dengan kontrol dan kelompok HPC (Gambar 4,5,6).

PEMBAHASANPreconditioning merupakan strategi endogen dalam periode singkat hipoksia membuat jaringan lebih resisten terhadap perusakan iskemik / hipoksia berikutnya dan menggambarkan pengobatan subletal kuat yang menginduksi neuron menjadi lebih tahan terhadap perusakan iskemik / hipoksia. Preconditioning hipoksia adalah perlindungan terhadap endogen yang mematikan hipoksia, tetapi mekanisme yang terlibat tidak dipahami. Preconditioning dengan episode berulang dari hipoksia ringan meningkatkan resistensi dari organisme sampai parah, berikutnya hipoksia termasuk struktural dan fungsional ketahanan neuron otak. perawatan ini telah terbukti dapat melindungi otak tikus yang baru lahir terhadap terhadap cedera otak HI Banyak teori telah diajukan untuk menjelaskan mekanisme preconditioning hipoksia; penyebaran depresi, NMDA reseptor , hipotermia dan lipopolisakarida dosis rendah. Jones dan Bergeron melakukan penelitian menyelidiki keterlibatan MAPK dan PI3K / Akt signaling jalur di hipoksia-induced iskemik toleransi. Tidak ada hasil yang jelas ditunjukkan sehingga studi lebih lanjut diperlukan.Salah satu mekanisme saraf yang mungkin diinduksi oleh preconditioning hipoksia untuk melibatkan antioksidan enzim, untuk mmengurangi stres oksidatif yang berhubungan dengan iskemia dan reperfusi. Untuk mendukung konsep ini adalah progresif dan berkelanjutan peningkatan tingkat Mn superoxide dismutase (MnSOD) mengikuti transien paparan hipoksia dalam otak gerbil (5, 10). Kami menggunakan tingkat MDA untuk menunjukkan kerusakan otak disebabkan oleh peroksidasi lipid dalam penelitian kami. Berbagai penelitian telah melihat SOD dan GPX tingkat di jaringan otak hewan dewasa. Ustun et al. mengamati penurunan tingkat ini satu jam setelah trauma kepala sedangkan Fan et al. menunjukkan peningkatan 24 jam setelah trauma.Penelitian kami menggunakan jaringan otak dari 7 hari tikus untuk menyerupai jaringan otak bayi manusia yang baru lahir sedekat mungkin. Studi-studi sebelumnya telah melihat tingkat enzim setelah trauma tapi kami menyelidiki efek protektif yang mungkin setelah stres oksidatif. SOD, GPX dan MDA diukur setelah HI insult selama 4 ja, untuk menunjukkan efek jangka pendek dari preconditioning hipoksia.Hal ini secara luas diakui bahwa pengembangan Otak memiliki toleransi yang lebih tinggi untuk HI. Dengan mempelajari mekanisme ini, selanjutnya tergantung pada fungsi dari SOD, MDA GPX dan tingkatnya sebagai Potensi pelindung faktor. Studi yang lain telah mencatat perubahan tingkat yang lebih rendah dari metabolisme glukosa, peningkatan transportasi glukosa, glikolitik enzim dan glikogen. kepadatan NMDA (N-metil-d-aspartat) yang rendah dari saluran dan saluran distribusi pola yang mengurangi keseluruhan saraf rangsangan dan depolarisasi delay, dan adaptasi lainnya yang memperlambat laju energi tinggi fosfat deplesi dan memaksimalkan ATP homeostasis selama dan setelah iskemia.

Studi kami hanya tebatas pada efek perubahan dalam tingkat SOD, MDA GPX dan bersama-sama dengan preconditioning dalam kasus iskemia hipoksia. Setelah penyakit HI posnatal diketahui dapat dikurangi dengan hipoksia preconditioning). Namun, meskipun mekanisme preconditioning ini belum sepenuhnya diklarifikasi, diperkirakan akan didorong oleh gen atau protein yang mempengaruhi metabolisme. ROS berpotensi signifikan dalam faktor perusakan mematikan yang diinduksi oleh preconditioning dari subletal stimulus. Pembengkakan mitokondria langsung dan Kerusakan lebih rendah sehingga ada hambatan kurang dari ATP sintesis yang pada gilirannya mencegah setiap peningkatan produksi ROS. Respon adaptif normal SOD meningkatkan aktivitas di tingkat GPX. Peningkatan GPX mendetoksifikasi tingkat tinggi dari hidrogen peroksida yang dihasilkan oleh aktivitas SOD yang meningkat. Ketika GPX meningkat maka untuk mengais radikal superoksida tidak ada, maka akan ada Otak kerusakan.

Dalam penelitian kami preconditioning yang dilakukan dengan tujuan menaikkan tingkat SOD dan GPX sehingga memperkuat pertahanan antioksidan. Hasil kami menunjukkan bahwa kedua kelompok yang menjalani HI (Kelompok III dan IV) memiliki tingkat yang lebih rendah dari SOD bila dibandingkan dengan kelompok I dan II. Kami hanya mengambil satu pengukuran pada 4 jam setelah rusaknya HI. Meskipun ada penelitian yang sedang berlangsung berfokus pada pelindung saraf dan terapi yang dapat mempengaruhi patofisiologi jalur hipoksia, sehingga meminimalkan kerusakan saraf, studi lebih lanjut mengambil pengukuran selama periode waktu yang berbeda diperlukan untuk memperjelas setiap waktu atau usia yang berhubungan dengan perubahan.REFERENSI1. Azzopardi D, Edwards AD: Hypothermia. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine 12:303-310, 2007

2. Bickler PE: Clinical perspectives: neuroprotection lessons from hypoxia-tolerant organisms. J Exp Biol 207:3243 3249, 2004

3. Bordet R, Deplanque D, Maboudou P, Puisieux F, Pu Q, Robin E, Martin A, Bastide M, Leys D, Lhermitte M, Dupuis B: Increase in endogenous brain superoxide dismutase as a potential mechanism of lipopolysaccharide induced brain ischemic tolerance. J Cereb Blood Flow Metab 20:1190-1196, 2000

4. Brucklacher RM, Vannucci RC, Vannucci SJ: Hypoxic preconditioning increases brain glycogen and delays energy depletion from hypoxia-ischemia in the immature rat. Dev Neurosci 24:411-417, 2002

5. Buonocore G, Groenendaal F: Anti-oxidant strategies. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine 12:287-295, 2007

6. Cimarosti H, Jones NM, O'Shea RD, Pow DV, Salbego C, Beart PM: Hypoxic preconditioning in neonatal rat brain involves regulation of excitatory amino acid transporter 2 and estrogen receptor alpha. Neurosci Lett 385:52-57, 2005

7. Douen AG, Akiyama K, Hogan MJ, Wang F, Dong L, Chow AK, Hakim A: Preconditioning with cortical spreading depression decreases intraischemic cerebral glutamate levels and down regulates excitatory amino acid transporters EAAT1 and EAAT2 from rat cerebral cortex plasma membranes. Journal of Neurochemistry 75:812-818, 2000

8. Dringen R, Pawlowski PG, Hirrlinger J: Peroxide detoxification by brain cells. Journal of Neuroscience Research 79:157-165, 2005

9. Fan P, Yamauchi T, Noble LJ, Ferriero DM: Age-dependent differences in glutathione peroxidase activity after traumatic brain injury. J Neurotrauma 20:437-445, 2003

10. Garnier P, Demougeot C, Bertrand N, Prigent-Tessier A, Marie C, Beley A: Stress response to hypoxia in gerbil brain: HO-1 and Mn SOD expression and glial activation. Brain Res 893:301-319, 2001

11. Gidday JM: Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nature Reviews Neuroscience 7:437-448, 2006

12. Gidday JM, Fitzgibbons JC, Shah AR, Park TS: Neuroprotection from ischemic brain injury by hypoxic preconditioning in the neonatal rat. Neurosci Lett 168:221-224, 1994

13. Halliwell B: Reactive oxygen species and the central nervous system. J Neurochem 59:1609-1623, 1992

14. Jones NM, Bergeron M: Hypoxic preconditioning induces changes in HIF-1 target genes in neonatal rat brain. J Cereb Blood Flow Metab 21:1105-1114, 2001

15. Jones NM, Bergeron M: Hypoxia induced ischemic tolerance in neonatal rat brain involves enhanced ERK1/2 signaling. J Neurochem 89:157-167, 2004

16. Kitagawa K, Matsumoto M, Tagaya M, Hata R, Ueda H, Niinobe M, Handa N, Fukunaga R, Kimura K, Mikoshiba K: 'Ischemic tolerance' phenomenon found in the brain. Brain Res 528:21-24, 1990

17. Kreps EM, Verzhbinskaia NA, Chenykaeva EI, Chirkovskaia EV, Gavurina T: Preparation of animals for chronic hypoxia; effect of chronic hypoxia on contents of hemoglobin, myoglobin, cytochrome oxidase and carbonic anhydrase in the blood and tissue. Fiziol Zh SSSR Im I M Sechenova 42:149-158, 1956

18. Mishra OP, Delivoria-Papadopoulos M. Lipid peroxidation in developing fetal guinea pig brain during normoxia and hypoxia. Brain Res Dev Brain Res 45:129-135, 1989

19. Nishio S, Yunoki M, Chen ZF, Anzivino MJ, Lee KS. Ischemic tolerance in the rat neocortex following hypothermic preconditioning. J Neurosurg 93:845-851, 2000

20. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K: Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 95:351-358, 1979

21. Raval AP, Dave KR, Mochly-Rosen D, Sick TJ, Perez-Pinzon MA: Epsilon PKC is required for the induction of tolerance by ischemic and NMDA-mediated preconditioning in the organotypic hippocampal slice. Journal of Neuroscience 23:384-391, 2003

22. Rehncrona S, Smith DS, Akesson B, Westerberg E, Siesjo BK Peroxidative changes in brain cortical fatty acids and phospholipids, as characterized during Fe2+- and ascorbic acid-stimulated lipid peroxidation in vitro. J Neurochem 34:1630-1638, 1980

23. Rice JE, III, Vannucci RC, Brierley JB: The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol 9:131-141, 1981

24. Samoilov MO, Lazarevich EV, Semenov DG, Mokrushin AA, Tyul'kova EI, Romanovskii DY, Milyakova EA, Dudkin KN: The adaptive effects of hypoxic preconditioning of brain neurons. Neurosci Behav Physiol 33:1-11, 2003 171 Turkish Neurosurgery 2008, Vol: 18, No: 2, 165-171 Alkan: Effects of Hypoxic Preconditioning in Antioxidant Enzyme Activities25. Sarco DP, Becker J, Palmer C, Sheldon RA, Ferriero DM: The neuroprotective effect of deferoxamine in the hypoxicischemic immature mouse brain. Neurosci Lett 282:113-116, 2000

26. Sheldon RA, Aminoff A, Lee CL, Christen S, Ferriero DM: Hypoxic preconditioning reverses protection after neonatal hypoxia-ischemia in glutathione peroxidase transgenic murine brain. Pediatric Research 61:666-670, 2007

27. Singer D. Neonatal tolerance to hypoxia: A comparativephysiological approach. Comp Biochem Physiol AMol Integr Physiol 123:221-234, 1999

28. Ustun ME, Duman A, Ogun CO, Vatansev H, Ak A: Effects of nimodipine and magnesium sulfate on endogenous antioxidant levels in brain tissue after experimental head trauma. J Neurosurg Anesthesiol 13:227-232, 2001

29. Vannucci RC, Towfighi J, Vannucci SJ: Hypoxic preconditioning and hypoxic-ischemic brain damage in the immature rat: pathologic and metabolic correlates. J Neurochem 71:1215-1220, 1998

30. Yanamoto H, Xue JH, Miyamoto S, Nagata I, Nakano Y, Murao K, Kikuchi. H: Spreading depression induces long-lasting brain protection against infarcted lesion development via BDNF gene dependent mechanism. Brain Research 1019:178- 188, 2004