IDENTIFIKASI BAHAN BAKU No. Meode Pengujian 1 KLT USP 32 hal 131, 30453046 A. Penyiapan Larutan Uji Dibutuhkan larutan dengan konsentrasi setara 3,5 mg/ml Neomisin base. 1 mg Neomisin sulfat = 600 g Neomisin base (USP 32, 3045), maka Neomisin Sulfat yang dibutuhkan = (3500 g/600g) x 1 mg = 5,83 mg. Timbang 58,3 mg bahan baku, larutkan dalam 10 ml HCl 0,1 N (3,5 mg/ml Neomisin base) B. Penyiapan Larutan Baku Timbang 58,3 mg standar, larutkan dalam 10 ml HCl 0,1 N (3,5 mg/ml Neomisin base) C. Penyiapan Fasa Gerak Campurkan 4 ml methanol, 2 ml isopropanol, 2 ml metilen klorida, 2 ml ammonium hidroksida, dan 1,5 ml aqades (10 ml fasa gerak) D. Penyiapan Bejana Kromatografi Lapisi sisi bejana dengan kertas saring Prosedur Kerja

Masukan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi hingga tinggi fasa gerak 0,5 cm 1 cm dari dasar bejana (kertas saring harus tercelup ke dalam fasa gerak pada dasar bejana)

Tutup bejana dan biarkan sistem mencapai kesetimbangan, kertas saring harus basah seluruhnya E. Cara Kerja Totolkan secara terpisah masing-masing 1l larutan uji dan 1l larutan baku, dengan jarak 1,5 cm -2 cm dari tepi bawah lempeng, dan biarkan mengering

Beri tanda 8 cm di atas titik penotolan

Masukan plat dalam bejana kromatografi, dengan tempat penotolan terletak di bawah (fasa gerak dalam bejana harus mencapai tepi bawah lapisan penjerap, tetapi titik penotolan jangan sampai terendam)

Tutup bejana dan biarkan sistem hingga fasa gerak merambat hingga 8 cm di atas titik penotolan

Keluarkan lempeng dari bejana, buat tanda batas rambat pelarut Keringkan plat pada suhu 105oC selama 10 menit

Semprot lempeng dengan larutan penampak bercak (0,2% Ninhidrin P dalam Butanol P) Panaskan pada suhu 105oC selama 5 menit

Amati kromatogram, hitung Rf

Syarat: Rf bercak merah utama yang diperoleh dari larutan uji sesuai dengan yang diperoleh dari larutan baku

Hasil:

MS / TMS

2

Reaksi Sulfat FI IV hal 924

i. Penyiapan larutan uji Larutkan 300 mg bahan baku dengan 6 ml aquades/500 mg dlm 10 ml/100 mg dlm 2 ml/50 mg dalam 1 ml (1 dalam 20) ii. Cara Kerja Reaksi A Tambahkan barium klorida LP ke dalam 2 ml larutan uji

Terbentuk Endapan putih

Dalam dua tabung reaksi yang berbeda larutkan endapan dengan asam klorida P dan dengan asam nitrat P

Amati Syarat: Terbentuk endapan putih yang tidak larut dalam asam klorida P dan asam nitrat P Hasil: MS/TMS

Reaksi B Tambahkan timbal (II) asetat LP ke dalam 2 ml larutan uji

Terbentuk Endapan putih

Larutkan endapan dengan amonium asetat LP

Amati Syarat: Terbentuk endapan putih yang larut dalam ammonium asetat LP Hasil: MS/TMS

Reaksi C Tambahkan asam klorida P ke dalam 2 ml larutan uji

Syarat: Tidak terbentuk endapan Hasil: MS/TMS

KEMURNIAN BAHAN BAKU No. Meode Pengujian 1 Penentuan pH FI IV hal 607, 1039 B. A. Penyiapan larutan uji Larutkan 330 mg dalam 10 ml aquades (33 mg/ ml) Ambil 1 ml larutan tersebut dan encerkan hingga 10 ml (3,3 mg/ml) Kalibrasi pH meter i. Siapkan larutan dapar pH 4 dan pH 7 (pH yang akan diukur berada pada rentang pH kalibrasi) untuk kalibrasi pH meter ii. iii. iv. v. vi. C. Set alat untuk standar 1 Bilas sel dengan aquades, kemudian ukur dapar standar pH 4 Set alat untuk standar 2 Bilas sel dengan aquades, kemudian ukur standar pH 10 Bilas kembali sel dengan aquades Prosedur Kerja

Pengukuran pH i. ii. iii. Bilas sel dengan aquades Set alat untuk pengukuran pH Ukur pH larutan 33 mg/ml dan 3,3 mg/ml

Syarat: pH larutan yang mengandung 33 mg per ml antara 5-7 2 Susut Pengeringan FI IV hal 607, 1043 iii. i. ii. Timbang 100 mg sampel bahan baku Tara Botol timbang bersumbat kaca yang telah dikeringkan selama 30 menit pada oven vakum 60oC (tekanan tidak lebih dari 5 mmHg) Masukan sampel ke botol timbang tersebut, dan timbang seksama botol berserta isinya iv. Ratakan sampel sampai setinggi 5 mm (ruahan tidak boleh lebih dari 10 mm) v. Masukkan botol timbang yang berisi sampel ke dalam oven vakum

600C, dengan sumbat kaca dibuka, dan sumbat ditinggal dalam oven, biarkan selama 3 jam vi. Setelah tiga jam, tutup segera botol pada saat oven dibuka, biarkan botol dalam desikator sampai mencapai suhu ruang vii. Timbang botol, dan hitung penyusutan

Syarat: Tidak lebih dari 8%

PENETAPAN KADAR BAHAN BAKU No. Meode Pengujian 1 Penetapan Potensi Antibiotik FI IV 891-899 FI IV 606 A. Pengeringan Baku dan Bahan Baku Lakukan pengeringan dalam hampa udara, pada tekanan tidak lebih dari 5 mmHg, pada suhu 60oC selama 3 jam B. Pembuatan Media Timbang 5,6 gram Nutrient Agar (NA), masukkan dalam labu Erlenmeyer 250 ml Tambahkan 200 ml aquadest ke dalam labu, panaskan di atas Bunsen hingga agar larut dan larutan bening Sumbat labu dengan kapas lemak dan tutup dengan alumunium foil, serilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit Prosedur Kerja

C. Pembuatan Dapar 3

Timbang 8,365 g K2HPO4, dan 0,2615 g KH2PO4 Tambahkan 400 ml Aquades, ukur pH larutan Atur pH dengan asam fosfat 18 N atau KOH 10 N hingga pH 81, tambahkan Aquades hingga 500 ml Sterilisasi laruan dapar dalam Flakon dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit

D. Pembuatan Suspensi mikroba (Staphylococcus epidermidis, dan Staphylococcus aureus) Suspensikan mikroba dari biakan awal ke dalam laruan NaCl dengan jarum ose hingga suspensi menunjukkan transmitan sebesar 25% pada panjang gelombang 518 nm

E. Pembuatan Agar Inokula 1% Pipet 0,2 mL suspensi bakteri ke dalam cawan petri Tambahkan 20 mL media NA bersuhu 40-50oC ke dalam cawan

Putar Cawan untuk menghasilkan agar inokula yang homogen, biarkan agar memadat pada suhu kamar

F. Penyiapan larutan baku (sesuai dengan hasil orientasi) Timbang 50 mg (minimal penimbangan) baku Neomisin sulfat dalam 50 ml dapar 3 untuk memperoleh larutan stok 1000 g/ml;

Buat 4 tingkat pengenceran larutan baku

Dari larutan 1000g/ml: i. ii. iii. iv. Ambil 8,75 ml larutan stock, encerkan hingga 10 ml (875 g/ml) Ambil 7,656 ml larutan stock, encerkan hingga 10 ml (765,6 g/ml) Ambil 6,699 ml larutan stock, encerkan hingga 10 ml (669,9 g/ml) Ambil 5,862 ml larutan stock, encerkan hingga 10 ml (586,2 g/ml)

Larutan baku yang akan digunakan untuk impregnasi cakram S5 : 1000 g/ml S4 : 875 g/ml S3 : 765,6 g/ml S2 : 669,9 g/ml S1 : 586,2 g/ml

G. Penyiapan larutan uji Bahan Baku (U1) i. Larutkan 50 mg (minimal penimbangan) sampel bahan baku ke dalam labu takar 50 ml ii. Ambil 7,656 ml larutan tersebut dan encerkan hingga 10 ml (765,6 g/ml)

H. Impregnasi Cakram Pada Cawan Petri dibuat pola 5+1, dan diberi tanda Pipet 10 l masing-masing larutan baku serta larutan uji, dan teteskan pada cakram kertas sesuai dengan tanda konsentrasinya Lakukan preinkubasi selama 20-30 menit pada suhu kamar, kemudian lakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 32-350C Amati diameter hambat yang terbentuk Hasil: Cawan S1 1 2 3 RataRata RS1 RR1 RS2 RR2 RS4 RR5 RS5 RR5 RSU1 RRU1 R1 S2 R2 Diameter Hambat S4 R4 S5 R5 U1 RU1

No S1 S2 S4 S5 RS1+(RR1-RRt) RS2+(RR2-RRt) RS4+(RR3-RRt) RS5+(RR4-RRt)

Koreksi Diameter Hambat

Plot Log konsentrast S1, S2, S4, S5 terhadap diameter hambat yang sudah dikoreksi hingga

didapatkan persamaan y=ax+b Masukkan log konsentrasi S3 sebagai x dalam persamaan didapat YS3 YU1 = YS3 + (URSU1-RRU1) Cari XU1 dari y=ax+b Konsentrasi u1= antilog XU1 Rasio potensi U1 = (antilog XU1/ konsentrasi S3) x 100% Potensi U1 = (Rasio potensi/100%) x Potensi baku

IDENTIFIKASI ZAT AKTIF DALAM SEDIAAN No. Meode Pengujian 1 KLT USP 32 hal 131, 30453046 A. Penyiapan Larutan Uji i. Timbang krim setara 3,5 mg Neomisin base, yaitu 1 gr (Kekuatan sediaan 0,583% neomisin sulfat = 0,35% Neomisin base, dalam 1 gr terdapat 3,5 mg Neomisin base, maka jumlah krim yang ditimbang adalah 1 gr) ii. Masukan dalam tabung sentrifuga, tambahkan 4 ml kloroform, kocok baik untuk mendispersi krim iii. Tambahkan 1 ml HCl 0,1 N, vortex selama 4 menit, kemudian sentrifuga iv. Gunakan supernatant yang jernih Prosedur Kerja

B. Penyiapan Larutan Baku Timbang 58,3 mg baku Neomisin Sulfat, larutkan dalam 10 ml HCl 0,1 N (3,5 mg/ml Neomisin base) C. Penyiapan Fasa Gerak Campurkan 4 ml methanol, 2 ml isopropanol, 2 ml metilen klorida, 2 ml ammonium hidroksida, dan 1,5 ml aqades (10 ml fasa gerak) D. Penyiapan Bejana Kromatografi Lapisi sisi bejana dengan kertas saring

Masukan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi hingga tinggi fasa gerak 0,5 cm 1 cm dari dasar bejana (kertas saring harus tercelup ke dalam fasa gerak pada dasar bejana)

Tutup bejana dan biarkan sistem mencapai kesetimbangan, kertas saring harus basah seluruhnya E. Cara Kerja Totolkan secara terpisah masing-masing 1l larutan uji dan 1l larutan baku, dengan jarak 1,5 cm -2 cm dari tepi bawah lempeng, dan biarkan mengering

Beri tanda 8 cm di atas titik penotolan

Masukan plat dalam bejana kromatografi, dengan tempat penotolan terletak di bawah (fasa gerak dalam bejana harus mencapai tepi bawah lapisan penjerap, tetapi titik penotolan jangan sampai terendam)

Tutup bejana dan biarkan sistem hingga fasa gerak merambat hingga 8 cm di atas titik penotolan

Keluarkan lempeng dari bejana, buat tanda batas rambat pelarut Keringkan plat pada suhu 105oC selama 10 menit

Semprot lempeng dengan larutan penampak bercak (0,2% Ninhidrin P dalam Butanol P) Panaskan pada suhu 105oC selama 5 menit

Amati kromatogram, hitung Rf

Syarat: Rf bercak merah utama yang diperoleh dari larutan uji sesuai dengan

yang diperoleh dari larutan baku

Hasil:

MS / TMS

PENENTUAN KADAR ZAT AKTIF DALAM SEDIAAN No. Meode Pengujian 1 Penetapan Potensi Antibiotik FI IV 891-899 FI IV 606 A. Pengeringan Baku Lakukan pengeringan dalam hampa udara, pada tekanan tidak lebih dari 5 mmHg, pada suhu 60oC selama 3 jam B. Pembuatan Media Timbang 5,6 gram Nutrient Agar (NA), masukkan dalam labu Erlenmeyer 250 ml Tambahkan 200 ml aquadest ke dalam labu, panaskan di atas Bunsen hingga agar larut dan larutan bening Sumbat labu dengan kapas lemak dan tutup dengan alumunium foil, serilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit Prosedur Kerja

C. Pembuatan Dapar 3

Timbang 8,365 g K2HPO4, dan 0,2615 g KH2PO4 Tambahkan 400 ml Aquades, ukur pH larutan Atur pH dengan asam fosfat 18 N atau KOH 10 N hingga pH 81, tambahkan Aquades hingga 500 ml

Sterilisasi laruan dapar dalam Flakon dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit

D. Pembuatan Suspensi mikroba (Staphylococcus epidermidis, dan Staphylococcus aureus) Suspensikan mikroba dari biakan awal ke dalam laruan NaCl dengan jarum ose hingga suspensi menunjukkan transmitan sebesar 25% pada panjang gelombang 518 nm

E. Pembuatan Agar Inokula 1% Pipet 0,2 mL suspensi bakteri ke dalam cawan petri Tambahkan 20 mL media NA bersuhu 40-50oC ke dalam cawan

Putar Cawan untuk menghasilkan agar inokula yang homogen, biarkan agar memadat pada suhu kamar

F. Penyiapan larutan baku (sesuai dengan hasil orientasi) Timbang 50 mg baku Neomisin Sulfat (minimal penimbangan) dalam 50 ml dapar 3 untuk memperoleh larutan stok 1000 g/ml;

Buat 4 tingkat pengenceran larutan baku

Dari larutan 1000g/ml: v. vi. vii. viii. Ambil 8,75 ml larutan stock, encerkan hingga 10 ml (875 g/ml) Ambil 7,656 ml larutan stock, encerkan hingga 10 ml (765,6 g/ml) Ambil 6,699 ml larutan stock, encerkan hingga 10 ml (669,9 g/ml) Ambil 5,862 ml larutan stock, encerkan hingga 10 ml (586,2 g/ml)

Larutan baku yang akan digunakan untuk impregnasi cakram S5 : 1000 g/ml S4 : 875 g/ml

S3 : 765,6 g/ml S4 : 669,9 g/ml S5 : 586,2 g/ml G. Penyiapan larutan uji Sampel (U2) (Mengacu pada USP 32, hal 3046) Dalam sediaan terdapat 0,583% Neomisin Sulfat, maka dalam tiap gram mengandung O,583% x 1 gr =0,00583 g= 5,83 mg. Akan dibuat larutan dengan konsentrasi yang sama dengan S3 yaitu 765,5 g/ml, dan ekstraksi dilakukan dengan 60 ml dapar 3, maka krim yang ditimbang harus mengandung : 60 ml x 765,6 g/ml = 45936 g = 45,936 mg Neomisin Sulfat ; dengan demikian jumlah krim yang ditimbang: (45,936 mg/5,83 mg) x 1 g = 7,88 g

i. ii. iii.

Timbang 7,88 g krim Larutkan dengan 50 ml eter Ekstraksi 3 kali dengan 20 ml dapar 3, kumpulkan fasa air

H. Impregnasi Cakram Pada Cawan Petri dibuat pola 5+1, dan diberi tanda Pipet 10 l masing-masing larutan baku serta larutan uji, dan teteskan pada cakram kertas sesuai dengan tanda konsentrasinya Lakukan preinkubasi selama 20-30 menit pada suhu kamar, kemudian lakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 32-350C Amati diameter hambat yang terbentuk Hasil:

Cawan S1 1 R1 S2 R2

Diameter Hambat S4 R4 S5 R5 U1 RU1

2 3 RataRata RS1 RR1 RS2 RR2 RS4 RR5 RS5 RR5 RSU2 RRU2

No S1 S2 S4 S5 RS1+(RR1-RRt) RS2+(RR2-RRt) RS4+(RR3-RRt) RS5+(RR4-RRt)

Koreksi Diameter Hambat

Plot Log konsentrast S1, S2, S4, S5 terhadap diameter hambat yang sudah dikoreksi hingga didapatkan persamaan y=ax+b Masukkan log konsentrasi S3 sebagai x dalam persamaan didapat YS3 YU2 = YS3 + (URSU2-RRU2) Cari XU2 dari y=ax+b Konsentrasi u1= antilog XU2 Rasio potensi U2 = (antilog XU2/ konsentrasi S3) x 100% Potensi U2 = (Rasio potensi/100%) x Potensi baku