PERCOBAAN IVIDENTIFIKASI FLAVONOID DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPISA. Tujuan PraktikumMelakukan analisis kualitatif golongan senyawa flavonoid dengan metodekromatografi lapis tipis.B. PendahuluanFlavonoid terdapat dalam semua tumbuhan yang berpembuluh tetapi beberapa kelas lebih tersebar daripada yang lainnya. Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi dan karena itu menunjukkan pita serapan kuat pada sprektum UV dan sprektum tampak. Flavonoid pada umumnya terdapat dalam tumbuhan, terikat terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikonfalvonoid yang mana pun mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida. Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah basa amonia, jadi mereka mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan. Tidak ada benda lain yang begitu mencolok dibandingkan flavonoid yang member konstribusi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Flavin akan memberikan warna kuning atau jingga, antosianin akan member warna merah, ungu atau biru yaitu semua warna yang terdapat pada pelangi terkecuali warna hijau. Secara biologis, flavonoid memainkan peranan penting dalam kaitannya dengan penyerbukan pada tanaman oleh serangga. Sebagian flavonoid memiliki rasa yang pahit sehingga dapat menolak sejenis ulat tertentu. (Sastroamidjoyo,1996).Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.C. Bahan dan AlatBahan yang digunakan dalam praktikum adalah lempeng KLT GF 254, metanol,amonia, pereaksi sitroborat, fase atas dari campuran n-butanol : asam asetat : air(3 : 1 : 1) v/v sebagai eluen. Sedangkan alat yang digunakan dalam praktikumadalah chamber KLT, pipa kapiler/ tusuk gigi, pinset, alat penyemprot, oven,lampu UV 244 nm.D. Cara KerjaSari I, Rutin dalam metanol Sari 2, Kuersetin dalam metanol, Sari 3Ditotolkan pada lempeng KLT GF 254 (6x8cm,dengan garis awal = 1 cm, garis akhir = 0,5 cm, danjarak elusi = 6,5 cm),Dielusi pada chamber KLT yang telah berisi campurann-butanol : asam asetat : air (3 : 1 : 1) v/v sebagaieluen,Dikeringkan dengan hair dryer,Dideteksi :1. Sinar UV 254, ditandai bercaknya,2. Uap amonia, di bawah sinar tampak dan UV 254,ditandai bercaknya,3. Pereaksi sitroborat, dipanaskan 110oC selama 5menit, di amati di bawah sinar UV 254, ditandaibercaknya,Dicatat Rf, hRf, dan warna yang terbentuk,Rf, hRf, warnaE. Hasil dan PembahasanE.1. Hasil PengamatanGambar 1. Skema Lempeng KLT.Lempeng KLT dan totolan sampel yang terelusi saat praktikum.0,5 cm1 cm6,5 cm6 cmNo Perlakuan Hasil Pengamatan1. Ditotolkan pada lempeng KLT GF 254 (6x8cm,dengan garis awal = 1 cm, garis akhir = 0,5 cm,dan jarak elusi = 6,5 cm),KiriKanan1. Sari 12. Rutin3. Sari 24. Kuersetin5. Sari 32. Dielusi pada chamber KLT yang telah berisicampuran n-butanol : asam asetat : air (3 : 1 : 1)v/v sebagai eluen,Ke-5 sampel terelusihingga garis akhir.3. Dikeringkan dengan hair dryer, Lempeng KLT GF 254telah kering, siap untuk dideteksi.4. Dideteksi :1. Sinar UV 254, ditandai bercaknya,Sari I = 4,7 cmRutin = 4,8 cmSari II = 6,5 cmKuersetin = 6,3 cmSari III = 6 cm2. Uap amonia, di bawah sinar tampak danUV 254, ditandai bercaknya,3. Pereaksi sitroborat, dipanaskan 110oCselama 5 menit, di amati di bawah sinar UV254, ditandai bercaknya,Sari I = 4,4 cmRutin = 4,5 cmSari II = 6,5 cmKuersetin = 6,3 cmSari III = 6,1 cmSari I = 4,5 cmRutin = 4,5 cmSari II = 6,5 cmKuersetin = 6,2 cmSari III = 6,1 cm5. Dicatat nilai Rf dan hRf yang diperolehhRf = Rf x 100Rf1, hRfSari I = 0,72 cm, 72 cmRutin = 0,73 cm, 73 cmSari II = 1 cm, 100 cmKuersetin = 0,97 cm, 97cmSari III = 0,92 cm, 92 cmRf2, hRfSari I = 0,68 cm, 68 cmRutin = 0,70 cm, 70 cmSari II = 1 cm, 100 cmKuersetin = 0,96 cm, 96cmSari III = 0,93 cm, 93 cmRf3, hRfSari I = 0,70 cm, 70 cmRutin = 0,70 cm, 70 cmSari II = 1 cm, 100 cmKuersetin = 0,93 cm, 93cmSari III = 0,93 cm, 93 cm6. Dicatat warna yang terbentuk Warna1Sari I = cokelat kehijauanRutin = cokelat kehijauanSari II = cokelat kehijauanKuersetin = ungu pudarSari III = ungu pudarWarna2Sari I = cokelat kehijauanRutin = cokelat kehijauanSari II = cokelat kehijauanKuersetin = ungu pudarSari III = ungu pudarWarna3Sari I = cokelat kehijauan,lebih pudarRutin = cokelat kehijauanSari II = cokelat kehijauan,lebih pudarKuersetin = ungu pudarSari III = ungu pudarOO1235 46789101'2'3'4'5'6' A(8a)(4a)CBE.2. PembahasanKromatografi lapis tipis (KLT) merupakan kromatografi planar dengan fasediam berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukungoleh lempeng kaca, plat almunium atau plastic. Fase gerak sebagai pelarutpengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler padapengembangan secara ascending atau karena pengaruh gravitasi padapengembangan secara descending. Pemisahan pada KLT yang optimal akandiperoleh jika pada penotolan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempitmungkin, dan jika penotolan sampel tidak tepat akan menyebabkan bercak yangmenyebar dan puncak ganda. Parameter pada KLT yang digunakan untukidentifikasi adalah nilai Rf, dua senyawa dikatakan identik jika memiliki nilai Rfyang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Analisis kuantitatif denganKLT dapat dilakukan dengan mengukur langsung lempeng dengan ukuran luasbercak atau densikometri (Gandjar, 2007).Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen.Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakancampuran beberapa cairan yang berbeda polaritas. Kepolaran eluen sangatberpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh. Faktor retensi (Rf)adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuholeh eluen. Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluentertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaansenyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berartimempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebutdikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuatpada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah (Anonim, 2013).Keuntungan KLT :1. Waktu relatif singkat2. Menggunakan inestasi yang kecil.3. Paling cocok untuk analisis bahan alam dan obat.4. Jumlah cuplikan yang dengan sedikit.5. Kebutuhaan ruang minimum.6. Penanganan sederhana.7. Zat yang bersifat asam/basa kuat dapat dipisahkan dengan KLT.Kelemahan KLT :1. Hanya merupakan langkah awal untuk menentukan pelarut yang cocokdengan pada kromatografi kolom2. Noda yang terbetuk belum tentu senyawa murni.Terdapat beberapa tahap yang dilakukan pada KLT yaitu penyiapan plat,pemilihan adsorben, pemilihan pelarut, menentukan sistem pengembang yangcocok, pengamatan lokasi bercak pada kromatogram, deteksi dan identifikasi(Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Langkah pertama yang dilakukan untukmengidentifikasi flavonoid adalah dengan mempersiapkan fase diam dan fasegerak yang digunakan sebagai eluen. Fase diam yang digunakan adalah selulosaGF254, sedangkan fase gerak yang digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air(3:1:1) v/v dan cuplikan yang digunakan adalah sari I, sari II, sari III, danpembanding larutan rutin serta kuersetin. Dengan digunakannya eluen yangbersifat polar maka senyawa polar akan terelusi lebih dulu dan memiliki Rf yanglebih tinggi, dibandingkan dengan senyawa non-polar ataupun semipolar. PadaKLT ini yang diuji adalah senyawa polar yaitu glikosida flavonoid (rutin) dansenyawa non-polar yaitu aglikon glikosida (kuersetin). Pelarut n-butanol sebagaipelarut non-polar yang melarutkan senyawa non-polar dan yang melarutkansenyawa polar adalah air sebagai pelarut polar. Penotolan dilakukan terhadap sariI, sari II, sari III dan pembanding larutan rutin serta kuersetin, denganmenggunakan pipa kapiler. Penotolan dilakukan pada plat KLT, dimana jarakantar totolan sejauh 1 cm. Setelah dilakukan penotoloan, plat KLT kemudiandideteksi di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm. Pada saatdeteksi di bawah sinar UV diamati bercak flavonoid yang terlihat kemudiandiukur jaraknya dari garis front. Setelah itu, plat KLT diuapkan amonia dandideteksi kembali di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm.Kemudian, langkah selanjutnya di deteksi dengan pereaksi sitroborat, laludipanaskan. Setelah nilai Rf kedua dihitung, plat KLT disemprot dengan pereaksisitroborat dan diamati kembali di bawah sinar UV dengan panjang gelombang254 nm, setelah itu lakukan perhitungan nilai Rf. Nilai Rf dihitung denganpersamaan (Gandjar, 2007) :Rf =Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyaiperbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k) sama dengan 0 yang berartisolut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak (Gandjar danRohman, 2007). Nilai Rf yang diperoleh dari hasil perhitungan dan warna yangterbentuk kemudian dibandingkan dengan nilai Rf dan warna fluoresens yang adadalam pustaka.Setelah melakukan percobaan Kromatografi Lapis Tipis maka diperolehhasil sebagai berikut, hasil yang di amati dibawah sinar UV254 yaitu sari Imenghasilkan jarakmenurut literatur dapat disimpulkan bahwa sari Imengandung rutin dan sari II mengandung kuersetin karena antara sari I dan rutinmemiliki nilai Rf yang berdekatan dan pada sari II dan kuersetin jugamengandung nilai Rf berdekatan (Gross, 1991). Pada saat KLT dilihat dibawahsinar UV bercak yang tampak yaitu rutin manghasilkan 4,1 cm dan sari IImenghasilkan 5 cm, jadi yang mampu berflourosensi hanya rutin dan sari IIkarena yang akan tampak pada UV hanyalah zat yang mampu berflouresensi(Gandjar, 2007). Kemudian, warna yang terbentuk untuk warna yang pertamaadalah sari I dan sari II menghasilkan warna cokelat kehijauan, sari IIImenghasilkan warna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masingmenghasilkan warna cokelat kehijauan dan ungu pudar. Warna yang kedua, untuksari I dan sari II menghasilkan warna cokelat kehijauan, sari III menghasilkanwarna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masing menghasilkan warnacokelat kehijauan dan ungu pudar. Warna yang ketiga, untuk sari I dan sari IImenghasilkan warna cokelat kehijauan tapi lebih pudar, sari III menghasilkanwarna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masing menghasilkan warnacokelat kehijauan dan ungu pudar.F. KesimpulanDari praktikum Identifikasi Falovonoid dengan Kromatografi Lapis Tipisdapat ditarik kesimpulan yaitu sebagai berikut :1. Senyawa golongan flavonoid dapat diidentifikasi dengan metodekromatografi lapis tipis (KLT) dan spektrofotometer UV-vis.2. Nilai Rf ditentukan dengan mengukur jarak titik pusat bercak dari titik awaldibagi dengan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.3. Dengan adanya warna fluoresens itu dapat mengetahui adanya rutin dankuersetin karena hanya rutin dan kuersetin yg dapat berpendar pd Rf standardan sampel yang telah ditentukan (0-1).Daftar PustakaAnonim, 2008, Singkong Manihot esculenta Crantz, www.plantamor.com,Diakses pada 08 Juni 2014.Anonim, 2013, Kromatografi Lapis Tipis.http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-lapis-tipis-klt.html.diakses tanggal 9 mei 2014.Depkes RI, 1979, Farmakope Indonesia Edisi III, Dirjen Ri, Yogyakarta.Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, PustakaPelajar, Yogyakarta.Kusmardiyani, Siti dan Nawawi As'ari, 1992, Kimia Bahan Alam, Pusat antarUniversitas Bidang Ilmu Hayati, Yogyakarta.Lenny, Sovia, 2006, Karya Ilmiah Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida, danAlkaloida, www.library.usu.ac.id. Diakses pada 08 Juni 2014.Perry R. H., and Green D., 1984, "Chemical Engineer's Hand Book", six edition,Mc Graw Hill Book Company.Robbers.J.E., Speedie.M.K., Tyler.V.E., 1996, Pharmacognosy and Pharmaco,biotechnology.Sastrohamidjojo. H., 1996, Sintesis Bahan Alam, Gajahmada University Press,Jogjakarta.Wagner H.,S. Bladt and EM. Zgainski, 1984, Plant Drugs Analysis., Springer-Verlag., Berlin.Lampiran 1. Jawaban Pertanyaan.1. Apa perbedaan fluoresensi rutin (flavonoid-3-glikosida) dan aglikonnya?Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar,sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut polar, seperti air, methanol atauetanol. Filtrate yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untukmempercepat pembentukan kristal.Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapatdilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapathasil berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin. Terlihat berupa tidakberwarna pada sinar tampak, berwarnabiru keunguan pada sinar UV254nm,birukeunguan pada sinar UV 366nm, dan memberikan fluoresensiberwarna biru terang dengan penampak bercak AlCl3.2. Apakah dasar pemisahan senyawa dengan metode kromatografi lapis tipis?Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografilapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serapmasing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fasediam (penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangatmemakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama.Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilihdua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yangsama (Gandjar, 2008).3. Berikan 2 contoh fase gerak lain yang bisa digunakan daam identifikasiflavonoid?Metal asetat, heksan, methanol. Methanol sifatnya polar. Heksan sifatnyanonpolar . Metil asetat sifatnya semi polar.