7/23/2019 GMO Plant

1/30

Makalah Rekayasa Genetika

Modifikasi Genetika Tanaman

Strategi Modifikasi Tanaman Padi dengan Superoksida Dismutase Cu/Zn dari

Melastoma malabathricum L.Menggunakan vektorAgrobacterium tumefaciens

Oleh:

Dwini Normayulanisa

Ghilandy Ramadhan

Kasandika Ganiarsa

Lucia Purwanti

Sandra Monica

Program Studi Teknologi !ioproses

Departemen Teknik "imia

#akultas Teknik $niveritas %ndonesia

Depok& '()*

7/23/2019 GMO Plant

2/30

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas rahmatdan perkenaan-Nya lah makalah ini dapat diselesaikan dengan tepat pada waktunya. Makalahyang berjudul ini disusun dengan tujuan untuk menambah wawasan penulis mengenai aplikasimetode kloning sederhana, khususnya strategi dalam pelaksanaannya, sekaligus memenuhi

tugas mata kuliah Rekayasa enetika.Makalah ini berisikan hasil diskusi dan pemikiran penulis mengenai strategi peme!aham

masalah pada studi kasus yang diberikan, yaitu proses modi"ikasi geneti! pada tanaman . #tudikasus yang diberikan membuat mahasiswa lebih mendalami proses trans"ormasi yangmemungkinakan pada tanaman. $engan begitu, penulis mengharapkan makalah ini dapatmemenuhi kriteria penilaian dan berguna bagi penulis maupun pemba!a dalam mempelajarimodi"ikasi genetik tanaman se!ara mendalam.

Penulisan makalah ini tidak dapat terselesaikan dengan adanya bantuan dan arahan dariberbagai pihak. %leh karena itu, kami ingin berterima kasih kepada&

'. (apak Muhamad #ahlan, selaku dosen mata kuliah Rekayasa enetika yang telahmembimbing dan mengarahkan kami selama proses penulisan makalah,

). *ak $ita +ijanarko, selaku asisten dari mata kuliah Rekayasa enetika yang telah

membantu mengawal proses diskusi ome roup terkait penjelasan mengenai metodeTrans"ormasi Tanaman

. %rang tua penulis yang senantiasa memberi doa dan dukungan selama prosespenyusunan makalah ini,

dan kepada seluruh pihak yang terlibat baik se!ara langsung maupun tidak langsung dalamproses penyusunan makalah ini yang tidak dapat kami sebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kesempurnaan. %leh karena itu,penulis sangat terbuka terhadap kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaanmakalah ini.

$epok, Noember )/'0

ormat kami,

Penulis

1

7/23/2019 GMO Plant

3/30

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangPerkembangan bioteknologi saat ini sangat pesat. 1plikasi bioteknologi dalam kehidupan

sehari-hari telah banyak dilakukan dan dikembangkan oleh para ahli. #alah satu aplikasi

bioteknologi yang sedang berkembang saat ini adalah modi"ikasi genetika. Modi"ikasigenetikamemberikan banyak man"aat bagi kehidupan manusia, salah satunya di bidang pangan, dimana modi"ikasi genetik memungkinkan suatu jenis tanaman resisten terhadap hama, penyakit,dan stress lingkungan. $engan modi"ikasi genetika, kita dapat mengambil satu si"at yangdiinginkan dari organisme lain,kemudian digabungkan ke organisme target.

Trans"ormasi genetik merupakan proses perpindahan gen asing yang diisolasi daritanaman, irus, bakteri, atau hewan ke dalam suatu genom baru. Trans"ormasi genetikmerupakan bentuk bioteknologi yang terus dikembangkan sampai sekarang ini yang bertujuanuntuk meningkatkan tara" hidup manusia maupun lingkungan. Proses trans"ormasi geneti!dapat dilakukan melalui ) teknik, yaitu teknik langsung dan teknik tidak langsung.

Proses trans"ormasi genetik se!ara tidak langsung menggunakan bakteriAgrobacteriumtumifaciens. #e!ara alami bakteri A. tumifaciens hanya dapat mengin"eksi tanaman dikotil,sehingga awalnya trans"ormasi ini hanya terbatas pada tanaman dikotil, namun seiring denganperkembangan teknologi, penelitian menunjukan proses trans"ormasi menggunakan bakteriA.tumifaciens dapat dilakukan untuk tanaman monokotil 2#lamet-3oedin, '4405. (akteri inimemiliki kemampuan untuk memindahkan $N1 ke dalam sel tanaman karena bakteri inimerupakan bakteri "itopatogen. (akteri A. tumifaciens memiliki plasmid single !opy yangberukuran besar dan disebut Plasmid Ti atau tumour indu!ing. #ebagian dari $N1 plasmid yaitut$N1 atau $N1 trans"er akan dipindahkan ke dalam sel tanaman dan akan masuk ke dalamgenom tanaman yang terin"eksi. en-gen tersebut selanjutnya dapat diekspresikan oleh seltanaman, !ontohnya seperi sintesis auksin atau sitokinin. #esuai istilah yang digunakan yaitutumour indu!ing, jaringan tanaman yang terin"eksi akan mengalami proli"erasi sel 2"ase sel saat

mengalami pengulangan siklus sel tanpa hambatan5 yang tak terkendali dan menghasilkanjaringan tumor. Pertumbuhan tumor ini diperlukan untuk pertumbuhan jaringan tumbuhanse!ara in vitro2$ay and 3i!htenstein, '44)6 +hite, '446 eldt, '4445.

.1.2 Rumusan Masalah(agaimana memasukkan gen 7u89n #%$ dari Melastoma malabathricum tahan 1l ke dalamtanaman padi menggunakan metode trans"ormasi tidak langsung

1. Tu!uan Penul"san:ntuk membuat ran!anganpenelitian rekayasa genetika padi tahan 1l menggunakan gen 7u89n#%$ dari Melastoma malabathricum, dengan plasmid p7ambia '// dan ektor trans"ormasi

genAgrobacterium tumefaciens.

1

7/23/2019 GMO Plant

4/30

BAB IITIN#AUAN PU$TAKA

2.1 Penggunaan $u%er&ks"'a D"smutase (u)*n 'ar" Melastoma malabathricumL. 'an

(ara Is&las"n+a

Melastoma malabathricum3. adalah tumbuhan yang banyak ditemukan di daerah tropis

1sia Tenggara, terutama di lahan asam dengan konsentrasi 1l yang tinggi. *etahanan tanaman

M. malabathri!um 3. pada tanah asam berhubungan dengan kemampuannya mengakumulasi

1l di daun tanpa menyebabkan gejala kera!unan dan bahkan 1l mema!u pertumbuhannya

2+atanabe et al. '44;5. Tumbuhan ini mampu mengakumulasi 1l di daun lebih dari '/./// mg

1l kg-'berat daun kering,. Tumbuhan ini memiliki sistem pertahanan terhadap !ekaman asam

dan 1l, sehingga sangat penting sebagai sumber gen toleransi 1l untuk merakit tanaman yang

toleran terhadap asam dan kadar 1l tinggi.

Tanaman men!egah toksisitas 1l melalui mekanisme eksklusi dan mekanisme toleransi

internal. Pada mekanisme eksklusi, 1l didetoksi"ikasi dengan mengeksklusi senyawa-senyawa

organik yang dapat mengikat 1l. #edangkan dalam mekanisme toleransi internal, 1l

didetoksi"ikasi setelah 1l diserap tanaman. Menurut +atanabe et al. 2'44;5 bentuk 1l pada

daun M. malabathri!um 3. adalah 1l

7/23/2019 GMO Plant

5/30

trialen 1l

7/23/2019 GMO Plant

6/30

konsentrasi pada suatu tanaman meningkat, maka aktiitas en?imnya juga mengalami

peningkatan.

2.1.2 Is&las" $D (u)*n 'ar" Melastoma malabathricumL.

>solasi RN1 Total

>solasi RN1 ini menggunakan metode 7T1( 2#uhartono et al. )//;5 yang dimodi"ikasi.

7T1( merupakan sejenis detergen yang mendegradasi dinding sel, denaturasi protein,

memisahkan karbohidrat 2*aidah dan #uprapto, )//5, merusak membran sel dan

melarutkan $N1 2Purwantara, )//'5.

o $aun Melastoma malabathricum3. sebanyak /,' gram digerus dengan bantuan

nitrogen !air di dalam mortar sampai menjadi tepung.o asil gerusan dimasukkan ke dalam tabung ',B ml yang telah berisi B//Fl bu""er

ekstraksi 2)C 7T1(, )C PGP 0////, '//mM Tris-7l p ;, )/ mM E$T1, '.0 M

Na7l dan 'C H-mer!apto ethanol5, kemudian diorteI dan diinkubasi pada suhu

JB/7 selama '/ menit.o #uspensi didinginkan, kemudian ditambahkan ' I olume kloro"orm&isoamil

alkohol 2)0&'5.o 7ampuran diorteI dan disentri"ugasi pada ke!epatan ';/// I g 2T%MY M@-

)/B5 pada suhu 0/7 selama '/ menit.o 7airan bagian atas dipindahkan ke tabung '.B ml yang baru, ditambahkan /.)B

olume '/ M 3i7l dan diinkubasi pada suhu -//7 selama ).B jam.o

7ampuran disentri"ugasi pada ke!epatan ';/// I g pada suhu 0

/

7 selama 'Bmenit.o 7airan dibuang, dan endapan RN1 total disuspensikan dalam B//Fl TE 2'/ mM

Tris p A.0, ' mM E$T15 dan ditambahkan ' I olume phenol p 4.o $iorteI dan disentri"ugasi pada ke!epatan ';/// I g pada suhu )//7 selama

'/ menit.o 7airan bagian atas yang mengandung RN1 total diambil, dimasukkan ke dalam

tabung '.B ml dan diekstraksi kembali dengan ' I olume

"enol&kloro"orm&isoamilalkohol 2)B&)0&'5o $iorteI dan disentri"ugasi pada ke!epatan ';/// I g pada suhu 0/7 selama '/

menit.o 7ariran bagian atas diambil, dipindahkan ke tabung '.B ml yang baru, kemudian

ditambah dengan /.)B olume '/ M 3i7l dan diinkubasi pada suhu //7 selama

).B jam.o 7airan disentri"ugasi pada ke!epatan ';/// I g pada suhu 0/7 selama 'B

menit.

4

7/23/2019 GMO Plant

7/30

o Endapan RN1 total dibilas dengan B//Fl alkohol A/C dan disentri"ugasi pada

';/// I g suhu 0/7 selama B menit.o Endapan RN1 total dikeringkan dengan a!!um dryer, dan disuspensikan di

dalam d)%.o *ualitas dan kuantiitas RN1 ditentutak dengan spektrometer :G pada panjang

gelombang )J/ nm dan );/ nm.o *eutuhan RN1 total dianalisis dengan elektro"oresis pada gel agarose 'C di

dalam larutan penyangga T1E 'I.o Gisualisasi RN1 total dilakukan di atas :G transiluminator el$o! 23abKuip5

setelah diwarnai dengan Et(r 2/.BFg8ml5 selama 'B menit dan dibilas dengan air.

#intesis !$N1 Total

!$N1 total disintesis dengan menggunakan #upers!ript >>> Reerse Trans!riptase

2>nitrogen5. *omposisi sintesis !$N1 total adalah 'Fg RN1 total, 'I RT (u""er, )/ pmol

oligodT, 0mM dNTP, '/mM $TT, 0/ : en?im #uper#!ript

TM

>>> Rtase dan air $EP7dengan olume reaksi )/Fl. #intesis !$N1 dilakukan pada suhu 0)/7 selama B/ menit.

>solasi en 7u9n-#%$

ragmen !$N1 7u9n-#%$ telah diisolasi dengan P7R menggunakan sepasang primer

generate 2primer "orward #%$6 BL-1T T 11 7T T 7+ TT YT* 1-L, dan

primer reerse #%$R06 BL-1$ 7T RR7 711 TR1 T17 717 1-L5 yang didesain

berdasarkan !$N1 copper/zinc superoxide dismutase dari beberapa tumbuhan

dikotiledon. asil P7R dielektro"oresis pada gel agarose 'C 2w85 dengan larutan

penyangga ' I T1E 2/.4 mM Tris-7l dan ) mM E$T1 p A.J5. Gisualisasi hasil

elektro"oresis dilakukan di atas transluminator :G 2oeer5 dan di"oto menggunakan

kamera digital yang dihubungkan ke komputer dengan menggunakan program $igido!.

#elanjutnyaa "ragmen !$N1 disisipkan ke dalam ektor pEM-T-Easy. *lon putih

dieri"ikasi dengan P7R, kemudia diisolasi plasmidnya. Plasmid dieri"ikasi lagi

menggunkan en?im E!oR'. Plasmid diurtukan menggunakan $N1 seKuen!er.:jung BL

dan L dari !$N1 7u9n-#%$ diisolasi dengan metode BL R17E dan L R17E #ystem.

Primer-primer yang digunakan telah didesain dari urutan !dN1 "ragmen Mm7u9n-#%$.

ragmen !$N1 hasil ampli"ikasi dengan L- dan BL- R17E disisipkan ke pEM-T Easy

ektor dan ditrans"ormasi ke E.!oli strain $Ba. *lon teah diurutkan dengan $N1

seKuen!er.

1nalisis urutan !dN1 7u9n-#%$

:rutan basa nukleotida dan deduksi asam amino 7u9n-#%$ dianalisis homologinya

dengan database gen di en(ank menggunakan program N7(> (31#T.

5

7/23/2019 GMO Plant

8/30

1 TTGGTGAAGG (TGTGG(TGT T(TTGG(AA( AG(GAGGGTGTGAG(GG(A( TGT(TA(TT(01 A(T(AAGAAG GAGATGGA(( (A(TA(TGTG A(TGGGAGT(TTT(AGG(TT GAAG((TGGA121 (T((A(GGTT T((ATGT((A TG(T(TTGGG GA(A(TA((AA(GG(TG(AT GT(TA(TGGA

11 ((T(A(TT(A AT((TG((GG AAAGGAG(AT GGTG((((TGAAGATGAGAA ((GG(ATG(A21 GGTGA(TTGG G(AATGT(A( (GTTGGAGAT GA(GGTA(TG(TA(ATT(A( (AT(A(AGA(31 AAG(AGATT( (T(T(TTTGG A((TAA(T(T ATTATTGGAA GGG(TGTTGTTGT((ATG(T01 GAT((TGATG AT(T(GGAAA GGGTGG((AT GAA(T(AG(AAGT(GA(TGG (AATG(TGGT 21 GGAAGGATTG (TTGTGGTAT(ATTGGT(TG (AG((TT

Gam4ar 1. Urutan 4asa 5ragmen Mm(u)*n6$D

1nalisis ekspresi gen 7u9n-#%$1nalisis ekspresi gen 7u9n-#%$ pada M. malabathri!um dengan metode semi-

Kuantitatie reerse trans!riptase-polymerase !hain rea!tion 2RTP7R5.:rutan basa "ragmen Mm7u89n-#%$ adalah

2.2 Pem"l"han Plasm"' %a'a %em4uatan GM

2.2.1 Plasm"'

Plasmid adalah $N1 rantai ganda ke!il yang berbentuk lingkaran yang terpisah dari kromosom.

Plasmid umumnya terdapat pada sel bakteri dan juga terdapat pada beberapa organisme

eukariotik. #eringkali, gen yang dibawa oleh plasmid memberikan bakteri kemampuan bertahan

hidup, seperti resistansi terhadap antibiotik. Plasmid memiliki ukuran basa nitrogen yang

berbeda-beda, dari seribu pasang basa nitrogen sampai ratusan ribu pasang basa. *etika

bakteri membelah, plasmid yang terkandung di dalam sel akan ikut tereplikasi sehingga sel

anak akan memiliki plasmid yang sama dengan induknya. (akteri juga dapat mentrans"er

plasmidnya ke bakteri lain melalui proses konjugasi.

>lmuan telah menggunakan plasmid untuk digunakan sebagai alat !loning, trans"er, dan

memanipulasi gen. Plasmid yang digunakan untuk tujuan ini dinamakan juga e!tor. >lmuan

umumnya memasukan "ragmen $N1 atau gen ke dalam ektor sehingga membentuk yang

dinamakan plasmid rekombinan. Plasmid ini kemudian akan dimasukan ke bakteri melalui

proses trans"ormasi.

2.2.2Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri yang menyebabkan penyakit crown gall pada

tanaman-tanaman dikotiledon. Penyakit ini dinamakan demikian karena terdapatnya tumor

besar yang membengkak yang terdapat pada tanaman. Penyakit ini adalah salah satu penyakit

yang paling umum diketahui karena perubahan yang ditimbulkannya pada system biologis

6

7/23/2019 GMO Plant

9/30

tanaman. #e!ara mendasar, ketika bakteri ini mengin"eksi tanaman, sebagian dari materi

$N1nya dipindahkan ke genom tanaman yang akhirnya menyebabkan tumor dan perubahan

pada sistem metabolisme tanaman. al ini dapat terjadi karena materi genetik yang diberikan

kepada tanaman salah satunya mengandung gen pengkode hormon pertumbuhan tanaman

yang dalam jumlah berlebih akan menyebabkan pertumbuhan tidak terkendali dan pada

akhirnya menyebabkan kanker atau tumor.

#i"atnya yang unik ini membuat bakteri 1.tume"a!iens digunakan sebagai alat pada proses

pengembangbiakan tanaman. en yang diinginkan, seperti gen insectisidal toxin genes atau

herbicide-resistance dapat dimasukan ke dalam $N1 bakteri dan kemudian dimasukan ke

dalam genom tanaman. Penggunaan bakteri ini tidak hanya memperpendek waktu

pengembangbiakan tanaman, tetapi juga memungkinkan tanaman untuk memiliki si"at baru

yang tidak dimiliki tanaman pada umumnya.

2.2. Plasm"' T"

en penyebab penyakit yang disebabkan oleh 1groba!terium umumnya tidak ditemukan pada

kromosomnya, melainkan pada plasmidnya, yang dinamakan tumour-inducingplasmid 2plasmid

Ti5. (agian dari plasmid Ti dapat dilihat pada gambar berikut&

Gam4ar 2.. $truktur Plasm"' T"

$ari gambar di atas, dapat dilihat bagian penting dari plasmid Ti, yaitu&

- T-$N1 border seKuen!es, yamg membatasi segmen $N1 2T-$N15 yang akan ditrans"er

ke genom tumbuhan. T-$N1 akan dijelaskan pada bagian selanjutnya.- Girulen!e genes, yang dibutuhkan untuk mentrans"er daerah T-$N1 ke tanaman tetapi

tidak memindahkan seluruh plasmid ke tanaman.- T-$N1 termodi"ikasi, dimana gen yang ingin ditrans"er diletakan sehingga dapat

dipindahkan ke dalam tanaman tetapi tidak menyebabkan tumor pada tanaman.

7

7/23/2019 GMO Plant

10/30

Girulen!e genes yang terdapat pada plasmid Ti terdiri dari beberapa bagian, yaitu virA!"#$%.

ir1 mengkode reseptor yang akan bereaksi ketika terdapat phenolic compounds seperti

acetosyringone, syringealdehyde, atau acetovanilloneyang umumnya terdapat pada bagian

tanaman yang terluka.

ir( yang mekode protein yang menyebabkan struktur berpori.

ir7 yang mengikat oerdrie seKuen!e.

ir$' dan ir$) yang memproduksi endonu!lease yang mentarget sekuens batas dari daerah

T-$N1.

irE yang mengikat untai T dan melindunginya dari serangan nuklease dan menginterkalasinya

dengan lemak dan men!iptakan ruang bagi kompleks T untuk menuju sel tanaman.

ir mengakti"kan ekspresi ir-gene

2.2. T6DNA

T-$N1 atau transferred $N1 adalah bagian $N1 dari plasmid Ti yang dipindahkan ke genom

tumbuhan. (agian ini dibatasi oleh )B pasang basa nitrogen yang sama pada kedua ujungnya.

Proses trans"er dimulai pada batas kanan dan diakhiri pada batas kiri. #eperti yang dapat

dilihat pada gambar ' di atas, daerah T-$N1 pada plasmid Ti mengandung gen yang mengkode

en?im pensintesi opines dan "itohormon atau hormon pertumbuhan tanaman. $engan

memindahkan materi genetik tersebut ke tanaman, bakteri se!ara langsung menyebabkan

tumor pada tanaman akibat banyaknya jumlah hormon pertumbuhan sehingga tidak terkontrol.

Maka dari itu, ketika 1groba!terium digunakan untuk mentrans"er gen tertentu kepada tanaman,

daerah ini akan dihilangkan dan diganti dengan gen yang diinginkan dan penanda yang

berguna untuk menentukan tanaman yang sudah terin"eksi dan belum. 7ontoh dari penanda

yang sering digunakan adalah neomycin phosphotransferase dan hygromycin

phosphotransferase.

T-DNA Binary Vector

T-$N1 binary e!tor sepasang pasmid yang terdiri dari plasmid biner dan plasmid pembantu.

*edua plasmid tersebut digunakan se!ara bersamaan untuk men!iptakan genetically modified

plants. *edua ektor ini adalah ektor buatan yang di!iptakan dari plasmid Ti yang se!ara alami

terdapat pada agroba!terium. Pada T-$N1 binary e!tor, tidak seperti plasmid Ti, daerah T-$N1

dan ir genes berada pada dua repli!on yang berbeda. T-$N1 terletak pada ektor biner

sementara repli!on yang mengandung ir genes dinamakan ir helper. Gektor ini di!iptakanagar ektor biner atau ektor yang mengandung T-$N1 dapat bereplikasi pada inang yang

bukan bakteri 1groba!terium, !ontohnya E.!oli. #elain itu plasmid Ti yang ukurannya besar juga

seringkali menjadi alasan penggunaan ektor ini. *edua bagian dari T-$N1 binary e!tor akan

dijelaskan sebagai berikut&

8

7/23/2019 GMO Plant

11/30

&ide-host-range small replicon yang mengandung origin o" repli!ation, $N1 asing pada daerah

T-$N1, batas kanan dan kiri T-$N1, penanda untuk E.!oli dan 1.tume"a!iens, penanda untuk

tanaman.

'elper (i plasmid yang T-$N1 nya telah dihilangkan tetapi tetap mengandung ir region.

*euntungan dari penggunaan ektor ini dibanding menggunakan plasmid Ti adalah, tidak ada

proses rekombinasi yang terdapat pada molekul yang terlibat, dan dibandingkan menggunakan

plasmid Ti yang sangat besar, digunakan ektor ke!il yang meningkatkan e"isiensi trans"er dari

E.!oli ke 1groba!terium. #ementara kerugiannya adalah stabilitas replikons yang berariasi.

Gam4ar . T" %lasm"' Hel%er 'an 7"'e h&st6range re%l"8&n

2.2.9 P"l"han B"nar+ :e8t&r

9

7/23/2019 GMO Plant

12/30

#eperti yang telah dijelaskan di atas, kita dapat menggunakan baik plasmid Ti maupun ektor

biner. Gektor biner terdiri dari berbagai ma!am jenis, yaitu&

'. Gektor seri p1 yang mengandung&- )rigin of replication yang diturunkan dari R*) untuk replikasi pada E.!oli dan

agroba!terium- en resistansi tetra!y!line- a!tor cisyang dibutuhkan untuk trans"er konjugasi- (atas kanan dan kiri T-$N1- *eomycin phosphotransferasegen yang berguna untuk memberikan resistensi terhadap

+anamycindan gpada tanaman yang tertrans"ormasi- Multicloning site

Gektor pada seri ini didesain untuk mengkloning "ragmen besar, promotor analis, dan

mengekspresikan gen yang diinginkan.

). Gektor seri p7 yang mengandung )rigin of replicationdari agrobacterium rhizogenes

yang menawarkan stabilitas lebih baik pada agroba!terium dibandingkan origin o"repoli!ation yang diturunkan dari R*), dan origin !ol#dari ektorp011untuk #.coli

. Gektor serip!2(yang mengandung gen resisntas hygromycindan lambda cossite untuk

mengkloning "ragmen yang panjang.- Gektor seri pPTG yang mengandung penanda seleksi tanaman yang berbeda di dekat

batas kiri T-$N1. $esign ini digunakan karena T-$N1 dikloning dari batas kanan,

sehingga lebih mungkin dapat terdeteksi.0. Gektor seri p(E7*)/// yang mengandung sintetik batas T-$N1 dan gen bar yang

memberikan resistensi terhadap tanaman dari herbisida phosphinothri!in. Gektor juga

menggunakan phage P' 7re8loIP site-spe!i"i! sistem rekombinan yang memungkina

trans"er dan integrasi dari target dan gen penanda sebagai satu T-$N1 atau dua T-$N1

yang berada pada satu sel bakteri. Gektor ini juga memungkinkan site spe!i"i eI!isiondari gen pendanda dari genom tanaman setelah trans"ormasi.

B. Gektor seri binary-(17 yang mengandung&- (erdasarkan ba!terial arti"i!ial !hromosome 2(175 ektor dan !o!ok untuk

agroba!terium untuk mentrans"ormasi $N1 dengan berat molekul besar- 7omprises low !opy number origins o" repli!ation untuk e.!oli dan agroba!terium untuk

memastikan replikasi plasmid sebagai single !opy pada kedua bakteri- elper plasmid yang mengandung kopi tambahan dari ir genes untuk mengklon T-$N1

yang sanat besar ke genom tanaman.J. Gektor seri preen

Plasmid ke!il yang mengandung broad host range replication orginidan cole origin

yang diturunkan dari p:7en psa replikase yang memberikan "ungsi replikasi pada trans dan terletak pada

!ompatible plasmidpSouppada agroba!terium.Multiple cloning site didasarkan pada pbluescript vectoryang memberikan kebebasan

ntuk memilih penanda dan gen reporter.

2.2.0 Plasm"' +ang '"%"l"h

10

7/23/2019 GMO Plant

13/30

Pada penelitian kali ini, kami memutuskan untuk menggunakan ektor p7ambia B/'B dengan

beberapa alasan sebagai berikut&

- Gektor tersebut memiliki ukuran yang jauh lebih ke!il dibandingkan plasmid Ti namun

memiliki daerah T-$N1 dan ir genes sehingga tidak membutuhkan binary e!tor.- Gektor memiliki M7# tempat yang dapat disisipkan oleh gen yang ingin diberikan

kepada tumbuhan.- Memiliki high !opy number pada E.!oli- Memiliki kestabilan yang tinggi dalam agroba!terium- $apat diseleksi dengan penggunaan !hlorampheni!ol atau kanamy!in- Tanaman dapat diseleksi dengan hygromy!in ( atau kanamy!in

#tuktur dari p7ambiaB'/B dapat dilihat pada gambar berikut

11

7/23/2019 GMO Plant

14/30

Gam4ar . Plasm"' %(am4"a 9139

12

7/23/2019 GMO Plant

15/30

2. Met&'e Insers" ;ragmen DNA $u%er&ks"'a D"smutase -$&'/ Mm8u)*n ke Dalam

Plasm"' %(AMBIA 9139

#alah satu tahapan untuk melakukan kloning pada tanaman padi yang dimutasi dengan

penambahan gen #%$ Mm7u89n ialah tahap insersi "ragmen $N1 #%$ Mm7u89n ke dalam

ektor. $ari tahap sebelumnya, "ragmen $N1 #%$ Mm7u89n yang telah berhasil diisolasi

dari tanaman Melastoma malabathricum, kemudian diinsersi ke dalam ektor untuk

dilakukan ampli"ikasi atau perbanyakan dengan menggunakan reaksi ligasi.

Pada insersi "ragmen $N1 kali ini, kami memilih untuk menggunakan ektor berupa

plasmid yaitu p71M(>1 B'/B karena ektor tersebut memiliki beberapa kelebihan, yaitu

memiliki ukuran yang lebih ke!il jika dibandingkan dengan plasmid Ti dan memiliki daerah T-

$N1 dan ir genes, yang dapat membantu memudahkan proses kloning dan trans"ormasi

$N1 #%$ Mm7u89n ke dalam kromosom tanaman padi.

:ntuk melakukan insersi "ragmen $N1 #%$ Mm7u89n pada ektor p71M(>1 B'/B,

diperlukan desain "ragmen $N1 yang memuat sekuens $N1 gen #%$ Mm7u89n, sekuens

dari en?im restriksi yang sesuai dengan daerah restriksi yang terdapat pada ektor, serta

sekuens dari kodon start BL 1: L dan kodon stop BL :1 L. #elain itu, karena di dalam

plasmid p71M(>1 B'/B telah terdapat promoter, maka desain "ragmen $N1 tidak

memerlukan sekuens $N1 dari promoter.

(erikut ini ialah sekuens utuh dari $N1 #%$ Mm7u89n, yaitu $N1 #uperoksida$ismutase 7u89n yang diisolasi dari organisme Melastoma malabathricum.

Gam4ar 1. $ekuens DNA $u%er&ks"'a D"smutase (u)*n 'ar" Melastoma

malabathricum

2#umber& annum, #aleha. )/'). lsolasi, Pengklonan, $an 1nalisis Ekspresi en

Penyandi !opper/3inc Superoxide "ismutase 2!uzn-Sod5 $ari Melastoma malabathricum 45

13

7/23/2019 GMO Plant

16/30

:ntuk sekuens en?im restriksi yang akan ditambahkan pada "ragmen $N1 yang akan

diinsersi ke dalam plasmid p71M(>1 B'/B ialah sekuens dari en?im restriksi yang terdapat

pada daerah T-$N1. En?im restriksi yang terdapat pada daerah T-$N1 diantaranya ialah

en?im restriksi Swa2dan Spe2. (erikut ini merupakan sekuens dari en?im restriksi Swa2dan

Spe2.

Gam4ar 9. $ekuens SwaI

2#umber&https&88www.neb.!om8produ!ts8r/J/0-swai 5

Gam4ar 0. $ekuens SpeI

2#umber&https&88www.neb.!om8produ!ts8r/'-spei 5

%leh karena itu, desain "ragmen $N1 yang memuat sekuens $N1 Mm7u89n, en?im

restriksi Swa2 dan Spe2, kodon start dan kodon stop untuk kemudian diinsersi ke dalam plasmid

p71M(>1 B'/B ialah sebagai berikut&

Pr"mer ;&r7ar'erse> untuk ketahanan terhadap kanamisin, gen gus1, serta dapat diuji dengan

seleksi biru - putih karena membawa gen la!9 2(rown '44J5.T-$N1 ektor p7ambia mengandung gen npt>>, gen hpt, dan gen gus1. en npt>>

penyandi en?im neomy!in phosphotrans"erase yang digunakan sebagai penyeleksi

pada bakteri. en gus1 penyandi en?im -glu!uronidase yang se!ara umum

dipergunakan sebagai penanda pada sistem trans"ormasi genetik tanaman

2=e""erson '4;A5.

>nsersi plasmid p7ambia hasil modi"ikasi dan nampli"ikasi ke dalam sel bakteriA.(umafeciensdilakukan dengan metode heatshoc+.$engan melakukan teknik heat-

shoc+ S mendinginkan, memanaskan dan mendinginkan kembaliQ bakteri, maka

$N1 dapat masuk ke dalam sel. Teknik ini ditemukan oleh trio peneliti #tanley

7ohen, 1nnie 7hang, 3eslie su pada tahun '4A).

Gam4ar 13. Mekan"sme Heat6$h&8k

.1.9 $eleks"Agrobacterium tumefeciensterm&'"5"kas"

20

7/23/2019 GMO Plant

23/30

%leh karena $N1 yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya $N1

rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang

trans"orman yang membawa $N1 rekombinan.#elanjutnya, di antara selsel

trans"orman yang membawa $N1 rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk

mendapatkan sel yang $N1 rekombinannya membawa "ragmen sisipan atau gen

yang diinginkan. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelahtrans"ormasi dilakukan, yaitu 2'5 sel inang tidak dimasuki $N1 apa pun atau berarti

trans"ormasi gagal, 2)5 sel inang dimasuki ektor religasi atau berarti ligasi gagal,

dan 25 sel inang dimasuki ektor rekombinan dengan8tanpa "ragmen sisipan atau

gen yang diinginkan.

:ntuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan si"at

yang terjadi pada sel inang.=ika sel inang memperlihatkan dua si"at marker ektor,

maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi.#elanjutnya,

untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan

si"at yang terjadi pada sel inang.=ika sel inang hanya memperlihatkan salah satu

si"at di antara kedua marker ektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinanketigalah yang terjadi.#eleksi sel rekombinan yang membawa "ragmen yang

diinginkan dilakukan dengan men!ari "ragmen tersebut menggunakan "ragmen

pela!ak 2probe5, yang pembuatannya dilakukan se!ara in itro menggunakan teknik

reaksi polimerisasi berantai atau polymerase !hain rea!tion 2P7R5.

Pela!akan "ragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui !ara yang

dinamakan hibridisasi koloni. *olonikoloni sel rekombinan ditrans"er ke membran

nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya

hingga tinggal tersisa $N1nya saja.#elanjutnya, dilakukan "iksasi $N1 dan

perendaman di dalam larutan pela!ak. Posisiposisi $N1 yang terhibridisasi oleh

"ragmen pela!ak di!o!okkan dengan posisi koloni pada kultur awal 2master plate5.

$engan demikian, kita bisa menentukan kolonikoloni sel rekombinan yang

membawa "ragmen yang diinginkan.

.2 In5eks"Agrobacterium tumefaciensTerm&'"5"kas" ke Pa'"

Agrobacterium tumefaciens merupakan salah satu jenis bakteri tanah yang dapat

menyebabkan crown gall pada tanaman. !rown gall merupakan tumor tanaman yang dapat

dengan mudah mun!ul pada tanaman dikotil gymnospermae dan tanaman dikotil

angiospermae.A. tumefaciens memiliki kemampuan untuk memperkenalkan materi genetik lain

ke dalam sel tanaman. Materi genetik baru ini disebut T $N1 2(ransferred "*A9 yang berada

pada plasmid A. tumefaciens. Pada penemuan '/ tahun terakhir ini, diperoleh pembaharuan

bahwa A. tumefaciens juga dapat digunakan pada beberapa tanaman monokotil sepeti padi,

jagung dan asparagus.

21

7/23/2019 GMO Plant

24/30

#elama trans"ormasi,beberapa komponen plasmid ektor dalam A. tumefaciens menjadi

"aktor keberhasilan trans"er gen yang diinginkan ke dalam tanaman, anata lain&

(atas sekuens T-$N1 yang membatasi segmen $N1 untuk ditrans"er ke genome

tanaman. Gir genes 2irulen!e genes5,yang dibutuhkan untuk mentrans"er daerah T-$N1 ke

tanaman namun bukan ir genes itu sendiri yang ditrans"er

$aerah T-$N1 termodi"ikasi dimana gen yang menyebabkan pembentukan !rown gall

dihilangkan dan diganti dengan gen yang diinginkan.

Pen!ampuran 1groba!terium yang telah tertrans"ormasi dengan sel tanaman agar T-$N1

tertrans"er ke sel tanaman terdiri dari beberapa langkah. 3ingkungan buatan untuk

pen!ampuran A. tumefaciens dan jaringan tanaman sangat menentukan keberhasilan

trans"ormasi genetik. Paparan oksidasi, "enolisasi dan kematian sel merupakan kejadian !ukup

sering selama interaksiA. tumefaciensdengan sel monokotil.

:ntuk memperkenalkan A. tumefacienske tanaman padi, maka jaringan meristem !alon

kalus ditumbuhkan dalam media yang terdapat A. tumefaciens. :ntuk membuat planlet padi,

dipilih polen 2antera5 padi kemudian diinduksi agar terjadi embriogenesis. Polen pertama Q

tama dikultiasi dalam medium kaya nutrisi dan diberi "itohormon. $alam media tersebut

di!ampurkan A. tumefaciens. *ultiasi dilakukan hingga terbenuk kalus yang umumnya

terbentuk setelah ) Q '/ minggu kultiasi. #elanjutnya kalus dipidahkan ke medium baru kaya

induser pertumbuhan tunas. >nduser tunas ini mengandung banyak sitokinin. $alam medium ini

juga ditambahkan carbenicillin dan +anamycin. #etelah terbentuk tunas, kalus dipindahkan ke

medium penginduksi pertumbuhan akar. Medium penginduksi pertumbuhan akar ini kaya akan

auksin. $alam medium ini juga diberi antibiotik kanam!in dan !arbeni!illin.setelah terbentuk

tunas dan akar, atau biasa disebut planlet, padi termodi"ikasi dipindah ke medium tanah

2diaklimatisasi5. #etelah beberapa bulan aklimatsasi padi dapat ditanam ke medium tanah di

lingkungan.

Medium yang digunakan untuk pemuliaan tanaman ini adalah Murashige dan #koog 2M#5.

$alam proses pemasukan T-$N1 ini, diberi antibiotik kanamy!in dan karbeni!illin. *anam!in

bertujuan sebagai seleksi terjadinya in"eksi. #ele!ted marker npt>> dalam T-$N1 akan

mengakibatkan tanaman menjadi kebal dari kanamy!in. #ehingga, tanaman akan tetap tumbuh

walaupun diberi kanamy!in. !arbenicillin ber"ungsi untuk membunuh A. tumefaciens setelah

mengin"eksi dan memasukkan T-$N1 ke kromosom padi.

22

7/23/2019 GMO Plant

25/30

Gam4ar 11. Pem4uatan Planlet

2Primrose, #.(. dkk. )//'. :rinciples of %ene Manipulation ;th ed. & )B5

$alam tanaman monokotil termasuk padi, diperlukan kokultiasi embrio padi dengan '// mmol8l

a!etosyringone sebagai "aktor kritis keberhasilan trans"ormasi. al ini untuk meningkatkan

kemampuan terjadinya trans"ormasi dalam plasmid yang berada pada A. tumefaciens. E"isiensi

trans"ormasi meningkat setelah ektor ditingkatkan "ungsi irulensinya. A. tumefaciens

ditingkatkan ekspresi ir-nya sehingga keberhasilan trans"ormasi lebih tinggi.

Penanda bahwa telah terjadi perpindahan T-$N1 ke dalam kromosom tanaman adalah

antibiotik. $alam T-$N1 disisipi gen anti dari antibiotik, sehingga, apabila penanda ini telah

masuk ke dalam kromosom tanaman, tanaman tersebut akan tahan antibiotik sesuai

penandanya. (erikut beberapa penanda 2sele!ted marker5 yang la?im digunakan.

23

7/23/2019 GMO Plant

26/30

Gam4ar 12. Ta4el $ele8ta4le Gene marker

2Primrose, #.(. dkk. )//'. :rinciples of %ene Manipulation ;th ed. & )'5

T-$N1 yang berada dalamA. tumefaciens akan ditrans"er ke dalam kromosom tanaman pada

saat A. tumefacienstersebut mengin"eksi tanaman. Mekanisme perpidahan T-$N1 ke dalam

kromosom tanaman adalah sebagai berikut&

Gam4ar 1. Pr&ses In5eks"Agrobacterium tumefaciens

24

7/23/2019 GMO Plant

27/30

http&88www.nepadbiosa"ety.net8abne8wp-!ontent8uploads8)/'/8'/8agroba!terium.jpg , diakses

pada '; Noember )/'0 pk. ''.//5

A. tumefaciensmenempel pada dinding sel tanaman. #etelah menempel, 1. tume"a!iens akan

membentuk protein ',) glukan. $engan jembatan ini, terjadi trans"er genetik T-$N1 dari bakteri

A. tumefaciens ke dalam kromosom sel tanaman. #elanjutnya $N1 tersebut akan

memperbanyak diri dan terekspresikan dalam tanaman. #alah satu tanda bahwa gen

terekspresikan adalah resistensi tanaman teradap antibiotik sesuai sele!ted marker.

25

http://www.nepadbiosafety.net/abne/wp-content/uploads/2010/10/agrobacterium.jpghttp://www.nepadbiosafety.net/abne/wp-content/uploads/2010/10/agrobacterium.jpg

7/23/2019 GMO Plant

28/30

BAB I:

PENUTUP

1.1 Kes"m%ulan. #uperoksida $ismutase 7u89n diisolasi dari Melastoma malabathricum3.

1. >solasi gen #%$ 7u89n dilakukan dengan metode 7T1(

tidak langsung melaluiAgrobacterium tumefaciens

26

7/23/2019 GMO Plant

29/30

DA;TAR PU$TAKA

1nonim. 7loning Q Promega pEM-T Easy*it. http&88eebweb.ari?ona.edu8blast87loning.pd"

1nonim. )/'. 7ambia3abs. UonlineV tersedia di& https&88ben!hling.!om8!ambia 2diakses pada 'ANoember pukul ').//5

1nonim. )/'0. P!ambiaB'/B.UonlineV tersedia di&

mail..http&88www.snapgene.!om8resour!es8plasmid"iles8plante!tors8p71M(>1B'/B8 2diakses

pada 'A Noember './/5

1nonim. Plasmids. UonlineV tersedia di&http&88www.nature.!om8s!itable8de"inition8plasmid-

plasmids-);2diakses pada 'A Noember ')/'0 pukul '.0'5

1nonim. )/'/.Plant trans"ormation usingAgrobacterium tumefaciens. UonlineV tersedia di&

http&88www.nepadbiosa"ety.net8subje!ts8biote!hnology8plant-trans"ormation-agro 2diakses pada'A noember )/'0 pukul 'B.//5

1nonim. (inary Ge!tor. UonlineV tersedia di& http&88www.!ambia.org8daisy81groTran8g'8;0;.html

2diakses pada '; noember )/'0 pukul '/.//5

1nonim. (iology and 7ontrol o" 7rown all. UonlineV tersedia di3

http&88ar!hie.bio.ed.a!.uk8jdea!on8mi!robes8!rown.htm 2diakses pada '; Noember pukul

''.//5

annum, #aleha. )/'). >solasi, Pengklonan, dan 1nalisis Ekspresi en Penyandi

7opper89in!#uperoIide $ismutase 27u9n-#%$5 dari Melastoma malabathricum 3. (ogor&

>nstitut Pertanian (ogor.

Ningrum, E. P. )//;. *eragaman ejala dan Penyebab Penyakit *eriting *uning 7abai.

Yogyakarta& :niersitas adjah Mada.

http&88www.!ambia.org8daisy8bios8B;B.html

Ma"tu!hah.Trans"ormasi 1nggrek $endrobium $engan en us-1 Melalui Perantaraan

Agrobacterium tumefaciens

iei Y, %hta #, *omari T and *umashiro T. '440. E""i!ient trans"ormation o" ri!e mediated

by 1groba!terium and seKuen!e analysis o" the boundaries o" the T-$N1. The Plant = J 2/5 &

//'-/''.

27

http://eebweb.arizona.edu/blast/Cloning.pdfhttps://benchling.com/cambiahttp://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA5105/http://www.nature.com/scitable/definition/plasmid-plasmids-28http://www.nature.com/scitable/definition/plasmid-plasmids-28http://www.nature.com/scitable/definition/plasmid-plasmids-28http://www.nature.com/scitable/definition/plasmid-plasmids-28http://www.nepadbiosafety.net/subjects/biotechnology/plant-transformation-agrohttp://www.cambia.org/daisy/AgroTran/g1/848.htmlhttp://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/crown.htmhttp://eebweb.arizona.edu/blast/Cloning.pdfhttps://benchling.com/cambiahttp://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA5105/http://www.nature.com/scitable/definition/plasmid-plasmids-28http://www.nature.com/scitable/definition/plasmid-plasmids-28http://www.nepadbiosafety.net/subjects/biotechnology/plant-transformation-agrohttp://www.cambia.org/daisy/AgroTran/g1/848.htmlhttp://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/crown.htm

7/23/2019 GMO Plant

30/30

Mulyaningsih , Enung #ri. )//4. Peman"aatan1groba!terium :ntuk Trans"ormasi enetik

Tanaman $an =amur. (ogor & (ioteknologi 3>P>.

www."p.unud.a!.id8biotek8wp-!ontent8uploads8)//48/)8kuliah-'.

Primrose, #.(., R.M. Twyman, R.+. %ld. )//'. :rinciples of %ene Manipulation ;th ed. :#1&

(la!kwell #!ien!e 3td.

1nonim. :lant (ransformation using Agrobacteriu tumefaciens.

http&88www.nepadbiosa"ety.net8subje!ts8biote!hnology8plant-trans"ormation-agro diakses pada

'; Noember )/'0 pk '/.0B.

$e 3a Ria, ustao 1. dkk. '44;. Agrobacterium tumefaciens & a *atural (ool for :lant

(ransformation. http&88www.ejbiote!hnology.in"o8!ontent8ol'8issue8"ull8'8W>ntegration , diakses

pada '; Noember )/'0 pk ''./B.

http://www.nepadbiosafety.net/subjects/biotechnology/plant-transformation-agrohttp://www.ejbiotechnology.info/content/vol1/issue3/full/1/#Integrationhttp://www.nepadbiosafety.net/subjects/biotechnology/plant-transformation-agrohttp://www.ejbiotechnology.info/content/vol1/issue3/full/1/#Integration