febriyati-fkik

ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI

DAUN SIRIH (Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS

ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI

GRAM POSITIF

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi

Oleh :

FEBRIYATI

NIM : 106102003404

PROGRAM STUDY FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2010 M/1431 H

LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI

NAMA : FEBRIYATI

NIM : 106102003404

JUDUL : ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI

DAUN SIRIH (Piper betle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS

ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI

GRAM POSITIF

Disetujui oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Andria Agusta Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt.

NIP. 196908161994031003 NIP.195601061985101001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt.

NIP. 195601061985101001

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi dengan judul

ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH

(Piper betle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP

BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM POSITIF

Telah disetujui, diperiksa dan dipertahankan dihadapan tim penguji oleh :

Febriyati

NIM: 106102003404

Menyetujui,

Pembimbing:

1. Pembimbing I Dr. Andria Agusta ........................

2. Pembimbing II Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................

Penguji:

1. Ketua Penguji Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................

2. Anggota Penguji I Zilhadia, M.Si, Apt. ........................

3. Anggota Penguji II Eka Putri, M.Si, Apt. ........................

4. Anggota Penguji III Ofa Suzanti Betha, M.Si, Apt. ........................

Mengetahui,

Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Prof. Dr (hc). dr. M. K. Tadjudin, Sp, And

Tanggal lulus : 25 Agustus 2010

LEMBAR PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul :


(Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP


Adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun

kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip

dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah

disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka.

Penulis,

Febriyati

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah

melimpahkan rahmat dan karunia-Nya serta shalawat dan salam selalu tercurah

kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW karena dengan segala rahmat dan

karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan

judul ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN

SIRIH (Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI

TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM POSITIF. Skripsi ini

disusun untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program

Studi Farmasi Universutas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terima

kasih yang sebesar-besarnya serta setulus-tulusnya kepada:

1. Bapak Prof. Dr. Komarudin Hidayat, selaku Rektor Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Bapak Prof. Dr (hc) dr. M. K. Tadjudin Sp,And, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

3. Bapak Dr. Andria Agusta dan Bapak Drs. M. Yanis Musdja, Msc., Apt,

sebagai pembimbing yang baik dan dengan sabar telah memberikan

pengarahan, bimbingan, nasehat dan petunjuk selama penelitian dan

penyusunan skripsi ini.

4. Bapak dan Ibu dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan hingga

penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Munawar dan Ibunda Aripah yang selalu

memberikan kasih sayang yang tiada terkira serta tiada pernah hentinya

memberikan doa, semangat, dan dukungan baik moril maupun materil

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Tiada apapun di dunia ini

yang dapat membalas semua kebaikan, cinta dan kasih sayang yang telah

kalian berikan.

6. Kepada kakanda dan adinda-adindaku tersayang terima kasih atas nasehat,

dukungan, serta kasih sayang yang telah kalian berikan, hingga penulis selalu

semangat menyelesaikan skripsi ini.

7. Kepada Angayi Hari Suryono, ST dan keluarga yang selalu memberikan

dukungan, motivasi dan inspirasi serta dengan segala kesabarannya tiada

henti memberikan semangat dikala penulis merasa bimbang, lelah dan

terjatuh dalam menyelesaikan skripsi sehingga penulis dapat bangkit kembali

untuk menyelesaikan skripsi.

8. Bapak Prof. Dr. Eko Baroto Walujo, APU, sebagai kepala bidang Botani dari

Herbarium Bogoriense LIPI Cibinong yang telah memberikan kesempatan

kepada penulis untuk melakukan penelitian di LIPI Cibinong.

9. Ibu Dr. Praptiwi dan Yuliasri Jamal, Msc, yang senantiasa memberikan

bimbingan dan bantuan dikala penulis mengalami kesulitan selama penelitian

dan penyusunan skripsi.

10. Bapak Dedi Rosadi dan Dedi Kustiwa dari balitro yang telah menyediakan

sampel dan melakukan distilasi

11. Saudara Ahmad Futhoni dan kang Asep yang telah memberikan bantuan

selama penelitian.

12. Kepada sahabat-sahabatku tersayang, Aminah Nurhadiyah, Fiestyo Alim,

Erny Fitriana, Rahmania Hidayah dan Nida Nurnabila terima kasih atas

dukungan dan doa kalian, masa-masa kuliah bersama kalian tidak akan

pernah terlupakan sampai kapanpun.

13. Kepada teman-teman seperjuangan dalam penelitian yang selalu membantu

dan senantiasa menyemangati, Erny Fitriana, Nurul Gustiari, Nuryatni, Vika

Fauziah, Mustikaning Ayu, Nurul Farihah, Lidya Pratiwi dan Ulfah Sadiah.

14. Kepada teman-teman Farmasi angkatan 2006, kebersamaan kita didalam suka

dan duka akan selalu terkenang di dalam hati sanubari.

15. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut

membantu menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna.

Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis

harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, dengan segala

kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat

baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa farmasi, masyarakat

pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.

Jakarta, 25 Agustus 2010

Penulis

ABSTRAK


(Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP


Sirih (Piper betle Linn.) merupakan salah satu jenis tanaman dari famili

Piperaceae yang sering digunakan untuk menyirih. Fraksi minyak atsiri daun sirih

diperoleh dengan cara destilasi uap air dan difraksinasi berdasarkan perbedaan

waktu penyulingan. Kandungan relatif yang terdapat pada masing masing fraksi secara berurutan adalah 0,061%, 0,034%, 0,027% dan 0,015%. Analisis fraksi

minyak atsiri dengan GC-MS dari fraksi jam ke 1, 2,4, dan 6 menunjukkan adanya

5 komponen kimia utama yang diduga berperan pada aktivitas antibakteri yaitu

kavibetol, kariofilen, pacouli alkohol,fenol,2-metoksi-4(1-profenil)-asetat dan 4-

alil-1,2-diasetoksibenzene. Fraksi minyak atsiri daun sirih telah diuji aktivitas

antibakteri dan mekanisme penghambatan terhadap beberapa jenis bakteri gram

positif. Aktivitas antibakteri minyak atsiri daun sirih menggunakan mikrodilusi

menunjukkan bahwa ke-4 fraksi minyak atsiri daun sirih aktif terhadap

Staphylococcus epidermidis dan Steptococcus mutan namun tidak menunjukkan

aktivitas terhadap Bacillus subtilis . Nilai MIC pada setiap fraksi terhadap

Staphylococcus epidermidis sebesar 0,25% sedangkan Steptococcus mutan

memilki aktivitas yang paling sensitif terhadap F4 pada nilai MIC 0,25%.

Mekanisme penghambatan pertumbuhan bakteri oleh fraksi minyak atsiri daun

sirih terjadi melalui pengerusakan dinding sel mikroba uji setelah perlakuan 1

MIC dan 2 MIC.

Kata kunci : Piper betle, minyak atsiri, fraksi, aktivitas antibakteri, bakteri gram

positif,.

ABSTRACT

ANALYSIS OF CHEMICAL COMPONENTS OF ESSENTIAL OIL

FRACTIONS OF BETLE LEAVES (Piper betle Linn.) AND ANTI-

BACTERIAL ACTIVITY TEST AGAINST SOME GRAM POSITIVE

BACTERIA.

Beetle (Piper betle Linn) is a plant belongs to Piperaceae that often used in

beetle chewing. Essential oils fractions of beetle leaves was given by steam and

water distilation and fractionated based on time periods. The result showed that

fraction yield of F1, F2, F3 and F4 were 0,061%, 0,034%, 0,027% and 0,015%.

respectively. Analysis of essential oils by GC-MS showed that 5 main chemical

components were chavibetol, caryophyllene, patchouli alcohol, phenol,2-metoksi-

4(1-prophenyl)-acetate and 4-allyl-1,2-diacetoxybenzene respectively. All of

these main chemical constituents were propose to responsible for its antibacterial

activity. The anti-bacterial activity of essential oils of beetle leaves was evaluate

with a microdilluton method. The results showed all of essential oil fractions

tested active against Staphylococcus epidermidis dan Steptococcus mutan but not

active to Bacillus subtilis. The MIC values of Staphylococcus epidermidis for all

of essential oil fractions were 0,25% While Steptococcus mutan were the most

sensitive to fourth fraction by 0.25%. Inhibition mechanism their activity was

indicated through microbial cell walls vandalism test after treatment 1 MIC and 2

MIC of the oils.

Key words: Piper betle,,essential oil, fractions, antibacterial activity, gram

positive bacteria

DAFTAR ISI

Hal

LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI............................................................... ii

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI................................................................ iii

LEMBAR PERNYATAAN................................................................................. iv

KATA PENGANTAR.......................................................................................... v

ABSTRAK............................................................................................................ viii

ABSTRACT.......................................................................................................... ix

DAFTAR ISI......................................................................................................... x

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii

DAFTAR GAMBAR............................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................ xv

BAB I PENDAHULUAN......................................................................... 1

1.1. Latar Belakang................................................................................ 1

1.2. Rumusan Masalah........................................................................... 3

1.3. Hipotesa.......................................................................................... 4

1.4. Tujuan Penelitian............................................................................ 4

1.5. Manfaat Penelitian.......................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................ 5

2.1. Tanaman Daun Sirih....................................................................... 5

2.1.1. Klasifikasi ............................................................................ 5

2.1.2.Nama Daerah......................................................................... 5

2.1.3. Deskripsi Tanaman............................................................... 5

2.1.4. Kandungan Kimia................................................................. 6

2.1.5. Khasiat.................................................................................. 6

2.2. Minyak atsiri................................................................................... 6

2.2.1. Deskripsi Minyak Atsiri........................................................ 6

2.3.1. Deskripsi Bakteri.................................................................. 7

2.3.2. Bakteri Uji............................................................................. 8

2.4. Aktivitas Antibakteri....................................................................... 10

2.4.1. Aktivitas Antibakteri............................................................. 10

2.4.2. Mekanisme Kerja Antibakteri............................................... 11

2.4.3. Metode Pengujian Antibakteri.............................................. 13

BAB III KERANGKA KONSEP............................................................... 14

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN.................................................. 15

4.1. Waktu dan Tempat Penelitian......................................................... 15

4.2. Pengambilan Sampel....................................................................... 15

4.3. Determinasi Tanaman..................................................................... 15

4.4. Alat da Bahan.................................................................................. 15

4.5. Metode Penelitian........................................................................... 16

4.6. Prosedur kerja 17

4.6.2. Identifikasi Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri Daun

Sirih.......................................................................................

18

4.6.3. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Minyak Atsiri

Daun Sirih.............................................................................

18

4.6.4. Analisis Protein dan Asam Nukleat...................................... 22

4.6.5. Analisis Ion Logam Ca2+

dan K+.

.......................................... 23

4.6.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel dengan SEM.................. 23

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 25

5.1. Hasil................................................................................................ 25

5.1.1. Isolasi dan Penentuan Komponen Kimia Fraksi Minyak

Atsiri Daun Sirih ..................................................................

25

5.1.2. Pengujian Aktivitas Antibakter i Fraksi Minyak Atsiri

Daun Sirih.............................................................................

29

5.1.4. Analisis Kebocoran Protein dan Asam nukleat.................... 31


dan K+.......................................... 31

5.1.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel Bakteri S. epidermidis

dengan SEM ........................................................................

32

5.2. Pembahasan.................................................................................... 33

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN..................................................... 43

6.1. Kesimpulan..................................................................................... 43

6.2. Saran............................................................................................... 44

DAFTAR PUSTAKA........................................................................................... 45

LAMPIRAN.......................................................................................................... 48

DAFTAR TABEL

Hal

Tabel 1. Perbandingan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri

daun Sirih ............................................................................................... 27

Tabel 2. Penggolongan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri

daun Sirih ............................................................................................... 28

Tabel 3. Aktivitas fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap 3 jenis bakteri

uji gram positif pada konsentrasi 50 %.................................................. 29

Tabel 4. Penentuan MIC fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap bakteri

uji B. subtilis........................................................................................... 30

Tabel 5. Penentuan MIC fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap bakteri uji

S.epidermidis dan S. mutan..................................................................... 30

DAFTAR GAMBAR

Hal

Gambar 1. Daun sirih........................................................................................... 25

Gambar 2. Perbandingan komatogram antar fraksi minyak atsiri daun sirih....... 30

Gambar 3. Nilai absorbansi asam nukleat dan protein fraksi jam ke-1

pada sel S. epidermidis...................................................................... 31

Gambar 4. Hasil pengukuran konsentrasi ion logam Ca2+

dan K+ fraksi

jam ke-1 pada supernatan biakan S.epidermidis konsentrasi

1 MIC dan 2 MIC.............................................................................. 36

Gambar 5. Morfologi sel S. epidermidis............................................................. 37

DAFTAR LAMPIRAN

Hal

Lampiran 1. Hasil determinasi daun sirih (Piper betle Linn.)............................. 48

Lampiran 2. Skema Kerja..................................................................................... 49

Lampiran 3. Hasil uji sensitivitas minyak atsiri daun sirih terhadap

ketiga jenis bakteri uji gram positif................................................ 56

Lampiran 4. Pertumbuhan bakteri uji terhadap fraksi minyak atsiri

daun sirih dengan metode plating...................................................... 57

Lampiran 5. Nilai absorbansi asam nukleat dan protein fraksi jam ke-1

pada sel S.epidermidis................................................................... 58

Lampiran 6. Hasil pengukuran konsentrasi ion logam Ca2+

dan K+ fraksi jam

ke-1 pada supernatan biakan bakteri S.epidermidis konsentrasi

1 MIC dan 2 MIC............................................................................ 58

Lampiran 7. Perhitungan konsentrasi MIC bakteri uji B. subtilis........................ 62

Lampiran 8. Perhitungan konsentrasi MIC bakteri uji S. epidermidis dan

S. mutan........................................................................................... 63

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pengetahuan tentang obat tradisional yang banyak digunakan oleh

nenek moyang pada zaman dahulu, saat ini sedang banyak digali. Hal ini

tidak terlepas dari banyaknya kendala yang ditimbulkan oleh penggunaan

obat sintetis, seperti harganya yang mahal, terjadinya resistensi bila

penggunaannya kurang tepat dan dapat menimbulkan efek samping yang

tidak dikehendaki. Masyarakat kini lebih cenderung untuk menggunakan obat

dari bahan alami dan melakukan pengobatan secara tradisional seperti yang

dilakukan pada zaman dahulu. Tumbuhan sebagai obat tradisional, biasanya

digunakan secara tunggal (satu jenis tumbuhan) atau majemuk (campuran dari

beberapa jenis tumbuhan). Bagian tumbuhan yang umum digunakan sebagai

obat tradisional adalah daun, bunga, buah, kulit batang, atau akarnya.

Penggunaannya ada yang secara langsung dalam keadaan yang masih segar,

ada pula yang diseduh ataupun direbus (Tengah, 2005).

Sirih (Piper betle) merupakan salah satu jenis tumbuhan dari famili

Piperaceae yang telah dikenal luas sehingga memiliki beberapa nama daerah,

diantaranya : sireh, suruh (Jawa). Pemanfaatan sirih yang paling umum

adalah sebagai bahan untuk sirih pinang. Bagian tumbuhan sirih untuk bahan

sirih pinang adalah daun (umumnya di Indonesia bagian barat) dan buah

(umumnya di Indonesia bagian timur). Tumbuhan dari Genus Piper, seperti

Piper nigrum, P. methysticum, P. auritum dan P. betle telah dikenal sejak

lama sebagai komoditi pertanian untuk rempah, insektisida pada lahan

pertanian dan bahan obat - obatan dengan nilai ekonomi yang tinggi (Sumarni

et al., 2009 ).

Minyak atsiri merupakan minyak yang mudah menguap yang akhir-

akhir ini menarik perhatian dunia, hal ini disebabkan minyak atsiri dari

beberapa tanaman bersifat aktif biologis sebagai antibakteri dan antijamur.

Kandungan minyak atsiri daun sirih dilaporkan memiliki daya antibakteri.

Kemampuan tersebut karena adanya kandungan 4,2% minyak atsiri yang

sebagian besar terdiri dari senyawa betelphenol yang merupakan isomer

eugenol, methil eugenol, kariofilen (siskuiterpen), kavikol, kavibekol,

estragol dan terpinen (Sastroamidjojo, 1997). Analisis komponen kimia

penyusun minyak atsiri Piper betle telah dilakukan juga oleh beberapa

peneliti dan diketahui bahwa sebagai komponen utama penyusun minyak

atsirinya antara lain kariofilena (30%), Isoeugenol (22%) dan -kubebena

(9%) (Agusta, 2000; Sulianti dan Chairul, 2002; Hertiani dan Purwantini,

2002).

Beberapa hasil penelitian tentang daun sirih telah dilaporkan, misalnya

bahwa ekstrak daun sirih pada konsentrasi 2,5%, 5% dan 10% secara invitro

dapat menghambat pertumbuhan S. aureus dan E. coli (Hermawan, 2007).

Nalina dan Rahim (2007) melaporkan bahwa ekstrak air daun sirih memiliki

aktivitas antibakteri terhadap S. mutan. Telah dilaporkan pula bahwa minyak

atsiri pada daun sirih, rimpang temu kunci, rimpang lengkuas, dan kunyit

berperan dalam aktivitas sebagai antibakteri dan anti jamur. Diduga aktivitas

tersebut disebabkan adanya kandungan senyawa fenolik bermolekul rendah

yang banyak terdapat di dalam minyak atsiri tersebut (Parwata et al., 2008).

Suppakul et al., (2006) melaporkan adanya sifat antibakteri dan antioksidan

pada minyak atsiri daun sirih dan nilai MIC minyak atsiri sirih pada kisaran

12,5 - 100 Lml-1

dapat menghambat pertumbuhan semua mikroorganisme

yang diuji kecuali P. aeruginosa. Sediaan obat kumur minyak atsiri daun sirih

2,5% dapat menghambat pertumbuhan E. coli dan sediaan 10% mampu

menghambat pertumbuhan S. aureus (Rahmat et al., 2000). Minyak atsiri

daun sirih juga memiliki aktivitas dan daya hambat terhadap S. epidermidis

dengan nilai MIC 5% ( Alfarisi, 2009).

Dari penelitian sebelumnya dilaporkan bahwa minyak atsiri daun sirih

memiliki aktivitas sebagai antibakteri dengan mekanisme pengrusakan

dinding sel bakteri. Pada penelitian ini dilakukan fraksinasi komponen kimia

minyak atsiri daun sirih dan uji aktivitasnya terhadap bakteri gram positif B.

Subtilis, S. epidermidis dan S. mutan. Maka, pada penelitian ini ditujukan

pada komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih yang diperoleh dari

variasi waktu pengambilan distilat terhadap aktivitas antibakteri untuk

beberapa jenis bakteri gram positif B. Subtilis, S. epidermidis dan S. mutan.

1.2. Rumusan masalah

Dalam penelitian ini yang menjadi rumusan masalah adalah sebagai berikut :

1. Apa saja komponen kimia yang terdapat dalam fraksi minyak atsiri daun

sirih yang diperoleh berdasarkan variasi waktu pengambilan fraksi?

2. Bagaimana aktivitas komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih yang

diperoleh pada jam ke-1, jam ke-2, jam ke-4 dan jam ke-6 terhadap

aktivitas bakteri gram positif B. subtilis, S. epidermidis dan S. mutan?

1.3. Hipotesa

Fraksi minyak atsiri daun sirih yang diperoleh pada jam ke-1, jam ke-2,

jam ke-4 dan jam ke-6 memiliki komponen kimia yang berbeda dan aktivitas

antibakteri terhadap bakteri gram positif B. subtilis, S. epidermidis dan S.

mutan dengan merusak membran sel.

1.4. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui komponen kimia yang terdapat dalam setiap fraksi minyak

atsiri daun sirih yang diperoleh pada jam ke-1, jam ke-2, jam ke-4 dan

jam ke-6.

2. Mengetahui aktivitas antibakteri setiap fraksi minyak atsiri daun sirih

terhadap bakteri gram positif B. subtilis, S. epidermidis dan S. mutan.

3. Mengetahui mekanisme antibakteri fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap

bakteri uji.

1.5. Manfaat Penelitian

Memberikan landasan ilmiah dan informasi mengenai komponen kimia

fraksi minyak atsiri daun sirih dan aktivitasnya terhadap beberapa jenis

bakteri gram positif untuk menunjang penggunaan daun sirih sebagai bahan

obat.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tanaman Daun Sirih

2.1.1. Klasifikasi

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Ordo : Piperales

Family : Piperaceae

Genus : Piper

Spesies : Piper betle Linn

2.1.2. Nama Daerah

Burangir, napuran (Batak), siriah (Minang), buyu, ayap (Dayak),

seureuh (Sunda), sedah, suruh (Jawa), kuta kowa (Sumba), papek,

ruange (Sul.Utara), ain kamu, amu (Seram), gies, bido (Halmahera),

kenaan, bido (Irian Jaya) (Agusta, 2000).

2.1.3. Deskripsi Tanaman

Merupakan tanaman memanjat tinggi 5-15 m. Helaian daun

berbentuk bundar telur atau bundar telur lonjong, pada bagian pangkal

berbentuk jantung atau agak bundar. Tulang daun bagian bawah gandul

atau berambut pendek, tebal,berwarna putih. Panjangnya 5-18 cm dan

lebar 2,5-10,5 cm (Sudarsono et al.,1996).

2.1.3. Kandungan Kimia

Daun sirih mengandung minyak atsiri dengan kadar berkisar

antara 0,13-0,33% (v/v). Terdiri dari kavibetol, katekol, kadinen,

karvakrol, kariofilen, kavikol, 1.8 sineol, estragol, eugenol, metil

eugenol, pirokatekin, terpenil asetat, sesquiterpen, triterpen dan

terpenoid . Disamping itu juga terdapat senyawa neolignan (piperbetol,

metilpiper betol, piperol A, piperol B), krotepoksid suatu senyawa

yang mempunyai potensi sebagai sitotoksik (Sudarsono et al., 1996).

2.1.4. Khasiat

Secara empiris tanaman sirih digunakan untuk obat batuk, asma,

hidung berdarah (mimisan), mulut berbau, kepala pusing, demam nifas

(daun), gusi bengkak (getah), dan minyak atsirinya untuk radang

tenggorokan (Pudjiastuti, 1996; Sudarsono et al., 1996).

2.2. Minyak atsiri

2.2.1. Deskripsi Minyak Atsiri

Minyak atsiri adalah zat berbau yang terkandung dalam tanaman.

Minyak ini disebut juga minyak menguap karena pada suhu biasa (suhu

kamar) mudah menguap di udara terbuka. Komponen utama minyak

atsiri adalah isoprenoid, karena molekul-molekulnya tersusun dari unit-

unit isopren. Beberapa sifat umum dari minyak atsiri antara lain

tersusun oleh bermacam-macam komponen senyawa, memiliki bau

khas, mempunyai rasa getir, menggigit tergantung dari jenis komponen

penyusunnya, dalam keadaan segar dan murni minyak atsiri umumnya

tidak berwarna, tidak stabil terhadap pengaruh lingkungan baik

pengaruh udara, sinar matahari dan panas, tidak dapat bercampur

dengan air dan larut dalam pelarut organik.

Minyak atsiri dapat terbentuk secara langsung oleh protoplasma

akibat adanya peruraian lapisan resin dari dinding sel atau oleh

hidrolisis dari glikosida tertentu. Minyak atsiri sendiri bagi tanaman

berguna untuk menarik serangga yang membantu proses penyerbukan

sebagai cadangan makanan, untuk mencegah kerusakan tanaman oleh

serangga atau hewan lain dan mempengaruhi proses transpirasi (Didik

dan Mulyani, 2004).

2.3. Bakteri

2.3.1. Deskripsi Bakteri

Bakteri merupakan kelompok sel prokariotik uniseluler. Salah satu

karakteristik utama sel bakteri adalah ukuran, bentuk, struktur dan

penataan selnya yang mencakup morfologi sel. Reproduksi terutama

dengan aseksual atau pembelahan biner. Ciri umum lainnya adalah

dimana dinding sel mengandung molekul kompleks disebut

mukopeptida yang berperan memberi kekakuan pada struktur selnya

(Pelczar et al., 1998). Komponen bakteri secara umum terdiri dari

substansi membran sel, dinding sel, bahan nukleat dan ribosom

(Brooks et al., 2005; Pelczar et al., 1998).

2.3.2. Bakteri Uji

a. Bacillus subtilis

Bacillus subtilis dapat diklasifikasikan sebagai berikut :

Kingdom : Tumbuhan

Divisi : Protophyta

Class : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Family : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Species : Bacillus subtilis

B.subtilis merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang,

bersifat aerob dan dapat membentuk spora. Bakteri ini banyak terdapat

dalam tanah, air, udara dan tumbuh-tumbuhan (Jawetz et al., 1996).

B.subtilis dapat menyebabkan beberapa jenis penyakit seperti

meningitis, endokarditis, infeksi mata dan lain-lainnya

(Syahrurachman et al., 1994).

b. Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis di klasifikasikan sebagai berikut :

Kingdom : Procariotae

Divisi : Ciano Cyanobacteria

Class : Bakteria

Ordo : Eubacterialees

Family : Micrococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus epidermidis

S. epidermis merupakan bagian dari flora normal pada kulit

manusia, saluran pernafasan dan saluran pencernaan, dapat ditemukan

di udara dan lingkungan sekitar kita. Kuman ini tidak patogen, tidak

bersifat invasive, nonhemolitik, berwarna putih, tidak membentuk

koagulasi. Staphylococcus patogen sering menghemolisis darah dan

mengkoagulasi plasma (Warsa et al., 1993). S. epidermis juga dapat

menyebabkan endokarditis infektif jika sebagian besar bakteri ini

masuk ke dalam aliran darah dan menempel di katup-katup jantung.

Bakteri ini juga sering disebut S. albus (Jawetz et al., 1996).

c. Streptococcus mutan

Streptococcus mutan di klasifikasikan sebagai berikut :

Kingdom : Bacteria

Divisi : Firmicutes

Class : Diplococcic

Ordo : Lactobacillales

Family : Streptococcaceae

Genus : Streprococcus

Spesies : Streptococcus mutan

S. mutan merupakan bakteri gram positif berbentuk bulat, yang

memiliki karakteristik dapat membentuk pasangan atau rantai selama

pertumbuhannya. S. mutan dapat mensintesa berbagai macam

polisakarida seperti dextrans atau levans dari sukrosa yang memiliki

peranan penting pada proses pembentukan karies gigi (Brooks et al.,

2005).

2.4. Antibakteri

2.4.1. Aktivitas Antibakteri

Antibakteri adalah obat pembasmi bakteri khususnya bakteri

yang merugikan manusia. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada

bakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri

(bacteriostatic) dan ada yang bersifat membunuh bakteri

(bactericidal). Sulfonamid, kloramfenikol, dan tetrasikiklin

merupakan antibiotik yang bersifat bakteriostatik. Sedangkan

sefalosforin, rifampisin, aminoglikosid, isoniazid, dan kotrimoksazol

bekerja secara bakterisid (Bilbiana dan Hastowo, 1992).

Konsentrasi minimal yang diperlukan untuk menghambat atau

membunuh pertumbuhan bakteri masing-masing dikenal sebagai nilai

MIC dan MBC. Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat

menjadi bakterisid bila kadar antibakterinya ditingkatkan melebihi

MIC (Setiabudy dan Gan, 1995).

2.4.2. Mekanisme Kerja Antibakteri

a. Inhibitor Sintesis Dinding Sel

Kerusakan dinding sel atau penghambatan pada

pembentukannya dapat menyebabkan sel menjadi lisis. Dinding sel

bakteri terdiri dari polipeptidoglikan yang merupakan kompleks

mukopeptida (glikopeptida). Zat antibakteri menghambat sintesis

peptidoglikan dinding sel bakteri dengan menghambat keja enzim

traspeptidase dan enzim rasemase alanin atau dengan menghambat

sintesa asam muramat. Senyawa penisilin dan sefalosforin yang secara

struktur mirip, dan senyawa-senyawa yang tidak mirip seperti

sikloserin, vankomisin, dan basitrain merupakan zat antibakteri yang

bekerja dengan menghambat sintesis dinding sel (Setiabudy dan Gan,

1995; Chambers, 2007).

b. Inhibitor Fungsi Membran Sel

Senyawa yang bekerja langsung pada membran sel

mikroorganisme, mempengaruhi permeabilitas dan menyebabkan

kebocoran senyawa-senyawa intraselluler. Dalam hal ini termasuk

senyawa yang bersifat detergen seperti polimiksin dan amfoterisin B

yang berikatan dengan sterol-sterol dinding sel (Chambers, 2007).

Kerusakan membran sel akan mengakibatkan keluarnya berbagai

komponen penting dalam sel bakteri yaitu protein, asam nukleat dan

lain-lain (Setiabudy dan Gan, 1995).

c. Inhibitor Sintesis Protein Sel

Bakteri memiliki ribosom dengan 70S, sedangkan manusia

memiliki 80S. Unit ribosom pada bakteri adalah 30S dan 50S.Sntesis

protein dihambat dengan memengaruhi fungsi subunit ribosom 30S

atau 50S sehingga menyebabkan penghambatan sntesis protein yang

reversibel dan mengakibatkan kematian sel. Obat bakteriostatik ini

meliputi kloramfenikol, golongan tetrasiklin, eritromisin, klindamisin,

pristinamin dan aminoglikosida (Setiabudy dan Gan, 1995; Chambers,

2007).

d. Inhibitor Sintesis Asam Nukleat

Antibakteri yang tergolong kelompok ini adalah golongan

kuinolon dan rifampin. Dalam hal ini, derivat rifampin akan berikatan

dengan enzim polimerase-RNA (pada sub unit) sehingga menghambat

sintesis RNA oleh enzim tersebut. Sementara asam nalidiksat bekerja

dengan menggaggu sintesis DNA . Sedangkan golongan kuinolon

bekerja dengan menghambat topoisomerase (Bilbiana dan Hastowo,

1992; Chambers, 2007)

e. Inhibitor Metabolisme Sel Bakteri

Dalam kelompok ini termasuk sulfonamida. Pada umumnya

bakteri memerlukan para-aminobenzoat (PABA) untuk sintesis asam

folat, yang diperlukan dalam sintesis purin. Sulfonamida memiliki

struktur seperti PABA, sehingga penggunaan sulfonamida

menghasilkan asam folat yang tidak berfungsi (Bilbiana dan Hastowo,

1992).

2.4.3. Metode Pengujian Antibakteri

a. Metode Difusi

Metode ini hanya menyajikan informasi kualitatif atau

semikuantitatif mengenai kerentanan mikroorganisme tersebut

terhadap antibiotik yang diberikan. Uji dilakukan dengan

mengaplikasikan cakram Kertas saring berisi sejumlah obat tertentu

diatas permukaan medium agar (medium padat) yang sebelumnya

telah diinokulasi bakteri uji. Setelah inkubasi 18-24 jam, dilakukan

pengukuran daerah hambatan yang jernih disekitar cakram. Diameter

daerah tersebut tergantung pada aktivitas obat terhadap mikroba yang

diuji. Nilai standar untuk ukuran daerah hambatan masing-masing

spesies bakteri dan masing-masing antibiotik memungkinkan

klasifikasi isolat secara klinis sebagai resisten, intermediet, atau rentan

(Chambers, 2007).

b. Metode Dilusi

Metode ini menggunakan antimikroba dengan kadar yang

menurun secara bertahap (seri pengenceran), baik dengan media cair

atau padat. Kemudian media diinokulasi bakteri uji dan dieramkan.

Tahap akhir dilarutkan antimikroba dengan kadar menghambat atau

mematikan (Brooks et al., 2005; Pratiwi, 2008).

BAB III

KERANGKA KONSEP

Analisis Protein & Asam

Nukleat Dengan Uv-Vis

Analisis Ion-Ion

Logam Dengan AAS

Analisis SEM

Didistilasi uap dan air

Sampel daun sirih segar

Pengambilan fraksi

minyak atsiri

Analisa kimia dengan

GCMS

Uji aktivitas antibakteri

Penentuan diameter daerah

hambat

Penentuan MIC

Determinasi Tanaman

Disortasi dan dirajang

BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni hingga Agustus 2010 dan

bertempat di Laboratorium Biosain, Puslit biologi, LIPI Cibinong, Bogor.

4.2. Pengambilan Sampel

Sampel daun sirih (Piper betle Linn.) diambil dari tanaman yang

terdapat di BALITRO (Balai Tanaman Obat dan Rempah), Cimanggu,

Bogor. Waktu pengambilan sampel dilakukan pada bulan Mei 2010.

4.3. Determinasi Tanaman

Sampel daun sirih diidentifikasi di Herbarium Bogoriense Bidang

Botani, Puslit biologi, LIPI Cibinong, Bogor.

4.4. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain perangkat

distilasi uap dan air, cawan petri, inkubator, neraca analitik, Laminar Air

Flow (LAF), autoklaf, jarum ose, mikropipet, microplate, oven, tabung

reaksi, rak tabung reaksi, spektrofotometer Uv-Vis Perkin Elmer,

spektrofotometer AAS Perkin Elmer a Analist 700, Gas Chromatography-

Mass Spectrophotometer (GC-MS) Varian Saturn 2000, Scanning Eletron

Microscope (SEM) JEOL seri JSM-5310 LV, refrigerator, pipet tetes,

erlenmeyer, vial, ependrof, inkubator, inkubator shaker, vortek dan

sentrifus.

2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih (Piper

bettle Linn.), aquadest, NaSO4 anhidrat, tween 80, aquadest steril, Blood

Agar Base, Nutrient Agar, Mueller Hinton Agar, Mueller Hinton Broth,

darah kambing steril, dapar fosfat pH 7,4; cacodylate buffer, glutaraldehid

2,5%, alkohol 50%, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 95%, alkohol

96%, tannin acid, terbutanol dan osmium tetraoksida 1%.

3. Bakteri Uji

Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis dan Steptococcus mutan.

4.5. Metode Penelitian

Kegiatan yang dilakukan untuk mencapai sasaran :

1. Isolasi fraksi minyak atsiri daun sirih

2. Identifikasi komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih

3. Pengujian aktivitas antibakteri fraksi minyak atsiri daun sirih

a. Sterilisasi alat dan bahan

b. Pembuatan medium

c. Pembiakan bakteri uji

d. Pembuatan suspensi bakteri uji

e. Pembuatan larutan uji

f. Penentuan Minimum Inhibitor Concentration (MIC)

4. Analisis protein dan asam nukleat

5. Analisis ion logam Ca2+ dan K +

6. Analisis Perubahan Morfologi Sel dengan Scanning Electron

Microscope (SEM)

4.6. Prosedur Kerja

4.6.1. Isolasi Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih

Sampel daun sirih yang diperoleh dari Balai Penelitian Obat

dan Aromatik (BALITRO) dan sudah dideterminasi di Herbarium

Bogoriensis, LIPI Puslit Biologi, Cibinong, Jawa Barat. Diambil

dalam keadaan segar kemudian di sortasi dan ditimbang sebanyak

30 kg lalu dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan segala

jenis kotoran yang melekat. Setelah pencucian selesai, kemudian

dilakukan perajangan dan proses distilasi uap dan air selama 6 jam

dengan variasi waktu pengambilan distilat untuk mendapatkan fraksi

minyak atsiri dari dalam tanaman. Setiap fraksi minyak atsiri yang

telah berhasil didapatkan kemudian ditambahkan NaSO4 anhidrat

untuk menghilangkan kandungan air. Kemudian menentukan

presentase kadar setiap fraksi minyak atsri yang berhasil di dapat.

Presentase kadar fraksi minyak atsiri didapat berdasarkan berat fraksi

minyak atsiri yang diperoleh perberat sample x 100%.

4.6.2. Identifikasi Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih

Identifikasi komponen fraksi minyak atsiri daun sirih dilakukan

selama 1 jam dengan menggunakan instrumentasi GC-MS Varian

Saturn 2000 di Laboratorium Analisis Umum, LIPI Cibinong.

Preparasi sample fraksi minyak atsiri dilakukan dengan penambahan

dietil eter. Jenis kolom yang digunakan adalah VF-17 MS panjang

30mm dan ID sebesar 0,25 mm. Gas pembawa adalah helium dengan

kecepatan aliran 1,3 ml/menit dan tekanan sebesar 10,7 Psi. Suhu

kolom diprogram dari 50 oC sampai 250

oC dengan dua tahap

kenaikan. Pada tahap awal suhu kolom dibuat konstan 50 oC selama 3

menit, lalu dinaikkan sampai 150 oC dengan temperatur 5

oC/menit

dan selanjutnya dinaikkan menjadi 250 oC dengan temperatur 3

oC/menit. Kondisi ini dipertahankan selama 3.67 menit. Suhu injektor

selama analisis berlangsung diprogram konstan pada suhu 230 oC.

Sementara temperatur interface adalah 250 oC dan autosampling

sebanyak 2 l. Solvent cut time selama 3 menit dan Scan MS 50-450

(M/Z).

4.6.3. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih

4.6.3.1. Sterilisasi Alat dan Bahan

a. Sterilisasi Alat

Sterilisasi dilakukan dengan cara yang sesuai terhadap

masing-masing alat. Alat-alat yang akan disterilkan harus dalam

keadaan bersih dan kering. Tabung reaksi, gelas ukur, vial,

erlenmeyer ditutup mulutnya dengan alumunium voil, kemudian

semuanya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C, selama

15 menit. Pinset, jarum ose, disterilkan dengan cara dipijarkan

pada nyala api bunsen.

b. Sterilisasi Bahan

Untuk media pembenihan, aquadest, tween 20 disterilkan

dan larutan NaCl dengan autoklaf pada temperatur 121 o

C

selama 15 menit. Pengerjaan aseptis dilakukan di dalam lemari

aseptis yang sebelumnya telah dibersihkan dengan larutan

alkohol, lalu disterilkan dengan UV yang dinyalakan selama

lebih kurang 2 jam sebelum digunakan.

4.6.3.2.Pembuatan Medium

a. Blood Agar Base (BAB)

Pada pembiakan bakteri S. mutan media yang digunakan

adalah Blood Agar Base sebanyak 40 gram dilarutkan dalam 1

liter aquadest, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C

selama 15 menit. Kemudian ditambahkan darah pada suhu 35-40

0C sekitar 5%.

b. Nutrient Agar (NA)

Pada pembenihan bakteri B.subtilis dan S. Epidermidis

media yang digunakan Nutient Agar. Serbuk NA sebanyak 23

gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest, lalu disterilkan dalam

autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.

c. Mueller Hinton Agar

Sebanyak 38 gr serbuk Mueller Hinton Agar dilarutkan

dalam 1 liter aquadest, lalu disterilkan dengan autoklaf pada

suhu 121 C selama 15 menit.

d. Mueller Hinton Broth

Sebanyak 21 gr serbuk Mueller Hinton Broth dilarutkan dalam

1 liter aquadest, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf pada

suhu 121 C selama 15 menit.

4.6.3.3. Pembiakan Bakteri Uji

Bakteri B. Subtilis dan S. epidermidis diinokulasikan ke

media Nutrien Agar miring sedangkan S. mutan diinokulasikan

ke media Blood Agar Base miring menggunakan ose yang telah

disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen,

kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam.

4.6.3.4. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Stok bakteri uji yang telah diremajakan pada agar nutrien

miring, Diambil dengan jarum ose (1 ose) dan dimasukkan

kedalam tabung yang berisi 5 ml Mueller Hinton Broth, media

untuk S. mutan ditambahkan darah steril. Kemudian divortek.

Dan diinkubasi selama 18 jam. Selanjutnya dituang ke dalam

nutrien agar dan media untuk S. mutan ditambahkan darah steril.

Diencerkan hingga diperoleh suspensi (105) sel bakteri/ml.

Suspensi ini yang akan digunakan dalam pengujian.

4.6.3.5. Pembuatan Larutan Uji

Larutan induk dibuat emulsi dengan menggunakan cara

mencampur fraksi minyak atsiri daun sirih dengan pelarut 0.5%

tween 80, etanol absolut 2% dan aquadest. Kemudian

diencerkan hingga 17,5%; 15%; 12,5%; 10%; 7,5%; 5%; 2,5%;

1%; 0.5%; 0,25%; 0,125%.

4.6.3.6. Penentuan MIC (Rodriguez et.al., 2002)

Metode penentuan minimum inhibitor concentration adalah

adalah sebagai berikut :

Menyiapkan larutan uji yang sudah dibuat dan juga larutan

kontrol.

Menyiapkan media Mueller Hinton Broth, menyiapkan

microplate, selanjutnya tiap-tiap sumuran diisi dengan 100

l media MHB, 100 l suspensi bakteri 1x105 sel/ml, dan

50 l larutan uji dengan berbagai konsentrasi, dan juga

larutan kontrol, dan dibuat homogen.

Kemudian diinkubasikan dalam shaker 150 rpm pada suhu

37 C selama 24 jam.

Pembacaan hasil percobaan didasarkan pada keruh atau

tidaknya sumuran percobaan dibandingkan kontrol untuk

menentukan MIC dan juga dengan cara plating pada

media agar di cawan petri.

Percobaan dilakukan secara duplo.

4.6.4. Analisis Protein dan Asam Nukleat (Carson et al., 2002)

Suspensi bakteri uji yang telah diinkubasi selama 18 jam dalam

media Muller Hinton Broth. Sentrifus dingin, kecepatan 3500 rpm selama

15 menit. Selanjutnya filtrat dibuang dan pellet dalam tabung dicuci

dengan dapar fospat Ph 7,4 sebanyak 2 kali. Lalu suspensikan kedalam

dapar fospat Ph 7,4 hingga volume 10 ml. Ditambahkan fraksi minyak

atsiri daun sirih dengan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC sesuai kebutuhan.

Diinkubasi kembali selama 24 jam dalam shaker 150 rpm 37 C.

Kemudian suspensi disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3500

rpm, lalu saring dan ambil cairan supernatan. Selanjutnya ukur absobansi

dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 260 nm dan

280 nm.


dan K +

(Cox et al., 2000)

Untuk analisis ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca2+

dan K+

yang

keluar dari membran sel bakteri akibat perlakuan dengan minyak atsiri.

Analisis kebocoran ion dilakukan pada pelet bakteri yang dipersiapkan

seperti pada pengukuran kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran

dinyatakan dengan terukurnya ion-ion logam yang terdapat pada bakteri

uji setelah dikontakkan dengan minyak atsiri pada perlakuan 1 MIC dan

2 MIC. Kebocoran ion Ca2+

dan K+

dideteksi dengan menggunkan AAS

(Atomic Absorption Spectrophotometre) Perkin Elmer a Analist 700.

Larutan sel hasil kontak dengan minyak atsiri diambil untuk diukur

kandungan ion-ionnya.

4.6.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel dengan SEM (Fathillah et al.,

2009)

Suspensi bakteri (umur 24 jam) diberi perlakuan 1 MIC, 2 MIC

fraksi minyak atsiri dan kontrol. Diinkubasi selama 24 jam pada shaker

150 rpm suhu 37 C. Selanjutnya suspensi bakteri tersebut disentrifus

dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, cairan dibuang untuk

mendapatkan masa sel bakteri (pelet). Kemudian pelet dicuci dengan

dapar fospat sebanyak 2 kali. Pelet difiksasi dengan glutaraldehid 2,5%

selama 4 jam, Selanjutnya disentrifus dan supernatan dibuang. Pelet

direndam kembali dengan larutan tannin acid 2% selama 18 jam

selanjutnya disentrifus. Supernatan dibuang dan pelet direndam dengan

cacodylate buffer sebanyak 2 kali masing-masing selama 10 menit.

Kemudian disentrifus kembali, dibuang supernatan dan pelet direndam

dalam osmium tetraoksida 1% dalam cacodylate buffer dibiarkan dalam

refrigerator selama 1 jam. Setelah direndam, disentrifus kembali dan

pelet dicuci dengan alkohol 50% dingin, dibiarkan 10 menit dan

disentrifus kembali selama 5 menit. Kemudian supernatan dibuang dan

pelet dikeringkan berturut-turut dengan alkohol 50%, 70%, 80% dan

alkohol 95% masing-masing selama 10 menit. Dicuci dengan alkohol

absolut dan disentrifus 5 menit sebanyak 2 kali dan dicuci kembali

dengan terbutanol 2 kali. Kemudian Oleskan apusan sel diatas potongan

bujur sangkar cover slip (slip glas) dan dikeringkan dengan terbutanol.

Slip glas yang telah diolesi dengan sel tersebut diletakkan pada stub

alumunium untuk dicoating dengan emas dalam ion coater selama 1 jam

pada kondisi vakum. Kemudian diamati dengan alat Scanning Electron

Microscope tipe JEOL seri JSM-5310 LV.

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Hasil

5.1.1. Isolasi dan Penentuan Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri

Daun Sirih

Gambar 1: Daun sirih

Metode yang digunakan untuk proses pemisahan komponen

kimia fraksi minyak atsiri daun sirih segar yang berasal dari Balitro,

Cimanggu (Bogor), adalah distilasi uap dan air (Sugiastuti, 2002;

Sulianti dan Chairul, 2002). Proses distilasi ini dilakukan dengan

menggunakan variasi waktu pengambilan minyak atsiri yaitu pada jam

ke-1, jam ke-2, jam ke-4 dan jam ke-6. Perbedaan waktu pengambilan

distilat ini memberikan hasil yang berbeda pada kandungan komponen

kimia fraksi minyak atsirinya (tabel 1). Begitu pula terhadap nilai

presentase kadar yang dihasilkan masing masing fraksi 1,2,3 dan 4

yaitu 0.061%, 0.034%, 0.027% dan 0.015%. Namun demikian, minyak

yang diperoleh masih memiliki aroma dan warna yang sama, dengan

aroma daun sirih yang khas dan berwarna kuning jernih.

Dari hasil analisis GCMS diketahui bahwa keempat fraksi minyak

atsiri tersebut memiliki kromatogram yang berbeda satu sama lain

(gambar 1). Fraksi jam ke-1 memiliki 64 komponen kimia penyusun.

Sedangkan pada fraksi jam ke-2 dan jam ke-6 terdeteksi sebanyak 56

puncak dan 73 puncak untuk fraksi jam ke-4.

Identifikasi masing-masing puncak pada kromatogram masing-

masing fraksi minyak atsiri memperlihatkan bahwa komponen

kimianya terdiri dari monoterpena, monoterpena alkohol, seksuiterpena,

seskuiterpena alkohol dan turunan fenil propanoid. Kemudian masing-

masing komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih dikelompokkan

berdasarkan golongan senyawanya seperti terlihat pada (tabel 2).

Gambar 2. Perbandingan kromatogram antar fraksi minyak atsiri daun

sirih

Keterangan: a: Minyak atsiri daun sirih tunggal

b: Minyak atsiri daun sirih fraksi jam ke-1

c: Minyak atsiri daun sirih fraksi jam ke-2

d: Minyak atsiri daun sirih fraksi jam ke-4

e: Minyak atsiri daun sirih fraksi jam ke-6

48

Tabel 1. Perbandingan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri daun sirih

No Waktu Retensi

Nama Senyawa Rumus Molekul

BM Kandungan Relatif (%)

F1 F2 F3 F4

1 10,84 Sabinen C10H16 136 0,65 - - -

2 11,23 2--pinen C10H16 136 0,10 - - -

3 12,36 -Terpinen C10H16 136 0,06 - -

4 12,73 dl-Limonen C10H16 136 0,05 - - -

5 13,09 -Felandren C10H16 136 0,29 - - -

6 13,39 3-Karen C10H16 136 0,39 0,12 0,09 0,12

7 13,55 Tidak teridentifikasi - - 0,19 - - -

8 14,07 -Terpinen C10H16 136 0,10 - - -

9 15,10 -Humulen C15H24 204 0,05 - - -

10 15,69 Linalil Isobutirat C14H24O2 224 0,59 0,18 0,07 0,18

11 18,93 Origanol C10H18O 154 0,37 0,10 0,06 0,10

12 19,62 -Terpinenil asetat C12H20O2 196 0,09 0,06 0,04 0,06

13 20,74 Estragol C10H12O 148 0,16 - - -

14 21,35 Asam benzoat, 2-hidroksi-

,metil ester

C8H8O3 152 1,00 1,28 1,07 1,30

15 21,65 -Kubeben C15H24 204 0,20 0,29 0,24 0,29

16 21,98 1-(1-Etil-2,3-dimetil-

siklopen-2-enil)-etanon

C11H18O 166 0,06 0,14 0,17 0,15

17 22,40 -Bourbenen C11H18O 166 0,05 0,13 0,17 0,13

18 22,62 -Kopaen C15H24 204 0,31 0,69 0,80 0,71

19 23,08 Kavikol C9H10O 134 1,61 1,44 1,90 1,47

20 23,32 -Elemen C15H24 204 2,85 4,41 3,94 4,33

21 23,91 -Bergamot C15H24 204 0,16 0,31 0,37 0,32

22 24,24 Trans--Bergamot C15H24 204 0,06 0,12 0,14 0,12

23 24,57 Kariofilen C15H24 204 4,82 8,70 8,54 8,61

24 24,66 -Guaien C15H24 204 1,21 2,63 3,56 2,65

25 24,97 Aromadendren C15H24 204 0,20 0,55 0,73 0,55

26 25,61 Fenol 1,4-(2-profenil)-asetat C11H12O2 176 10,34 0,02 0,03 0,02

27 25,89 -Humulene C15H24 204 3,82 4,97 4,97 4,85

28 26,12 p-Eugenol C10H12O2 164 0,59 - - -

29 26,33 Valensen C15H24 204 0,50 1,09 1,39 1,09

30 26,46 Naptalen,1,2,3,4,4a,5,6,8a-

oktahidro-7-metil-4-metilen-

1-(1-metilethil)

C15H24 204 1,01 1,28 1,46 1,30

31 26,83 Kavibetol C10H12O2 164 10,61 9,60 10,50 9,90

32 27,04 -Selinen C15H24 164 0,78 2,97 3,64 2,88

33 27,19 -Selinen C15H24 204 1,60 2,58 3,02 2,63

34 27,38 - Gurjunena C15H24 204 1,74 3,83 4,63 3,78

35 27,60 Bisiklogermakren C15H24 204 3,11 4,11 3,16 4,08

36 27,85 Benze,1,2-dimetoksi-4-(2-propenil)

C11H14O2 204 0,12 0,07 0,09 0,08

37 27,97 -Pacuelen C15H24 204 0,47 0,55 0,69 0,54

38 28,13 -Kadinena C15H24 204 0,43 0,72 1,02 0,72

39 28,30 (-)--Panasinsen C15H24 204 0,20 0,29 0,42 0,30

40 28,43 -Kadinena C15H24 204 0,06 - 0,03 -

41 28,59 Kadina-1,4-diena C15H24 204 0,05 0,08 0,13 0,09

42 29,17 -Himakalen C15H26O 222 0,03 - - -

43 29,90 -Gurjunena C15H24 204 0,05 - - -

44 31,07 Veridiflorol C15H26O 204 0,07 0,30 0,59 0,30

45 31,29 -Gurjunene poksid-(2) C15H24O 220 0,05 0,14 0,24 0,14

46 31,44 -Guaien C15H24 222 0,17 0,37 0,57 0,37

47 31,65 Kariofilen oksida C15H24O 220 0,10 0,10 0,14 0,11

48 31,77 (-)-Kariofilen oksida C15H24O 220 0,05 0,07 0,10 0,07

49 32,03 Kubenol C15H26O 222 0,59 - 0,08 -

50 32,35 2,3,3-Trimetil-2-(3-methil-

buta-1,3-dienil)-sikloheksan

C14H22O 0,10 0,22 0,27 0,22

51 32,52 3-Alil-6-metoksipenil asetat C12H14O3 206 0,34 0,51 0,38 0,52

52 32,92 fenol,2-metoksi-4-(1-

profenil)-asetat

C12H14O3 206 13,89 12,95 10,77 13,01

53 33,30 -Guaien C15H24 204 0,12 0,17 0,21 0,17

54 33,45 t-Kadinol C15H26O 222 0,05 0,08 0,12 0,08

55 33,61 -Bisabolol C15H26O 222 0,05 0,04 0,04 0,04

56 33,78 Toreyyol C15H26O 222 0,12 0,18 0,20 0,17

57 34,07 Junipen C15H24 222 0,45 0,89 1,52 0,90

58 34,52 Agarospirol C15H26O 222 0,12 0,39 0,80 0,40

Keterangan : F1: Fraksi jam ke-1 F2: Fraksi jam ke-2

F3: Fraksi jam ke-4

F4: Fraksi jam ke-6 - : tidak teridentifikasi

Tabel 2. Penggolongan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri daun sirih

59 35,30 Pacouli Alkohol C15H26O 222 4,95 10,23 12,62 10,08

60 35,48 Longiborneol C15H26O 222 0,00 - - -

61 35,76 -Eudesmol C15H24O 220 0,07 - 0,12 -

62 37,03 4-Alil-1,2-diasetoksibenzen C13H14O4 234 27,31 14,53 6,32 14,64

63 38,62 Tidak teridentifikasi - - 0,09 0,17 0,31 0,18

64 38,77 fenol,3,5-dimetil-4-(metiltio)-metilkarbamat

C11H15NO2S 225 0,22 0,66 1,08 0,83

65 25,29 -Pacuelen C15H24 204 - 0,04 0,06 0,04

66 25,53 Kavisil asetat C11H12O2 176 - 1,55 1,04 1,54

67 25,98 Seychellen C15H24 204 - 2,27 2,80 2,28

68 26,66 -Sedren C15H24 204 - 0,31 0,37 -

69 26,90 -Bisabol C10H12O2 164 - 0,02 - 0,01

70 31,98 4-Alil-1,2diasetoksibenzene C13H14O4 234 - 0,36 0,27 0,36

71 33,04 Epiglobulol C15H26O 222 - 0,04 0,06 0,04

72 39,73 4,4-Dimetil-3-(3-metilbut-3-

eniliden)-2-metilen

bisiklo(4.1.0)heptan

C15H22 202 - 0,10 0,13 0,08

73 24,09 Safrol C10H10O2 162 - - 0,04 -

74 30,10 (-)--Selinen C15H24 204 - - 0,33

75 30,77 Selina-3,7(11)diena C15H24 204 - - 0,17 -

76 30,87 (-)-Kariofilen-(l1) C15H24 204 0,04

77 32,59 -Guaien C15H26O 222 - - 0,33 -

78 34,37 Tidak teridentifikasi - - - - 0,03 -

79 34,67 2-Propenol,3- (2,6,6 trimetil-

1-siklpheksen-1-yl)

C12H18O 178 - - 0,10 -

80 34,76 Tidak teridentifikasi - - 0,14 -

81 35,01 -Selinen C15H24 204 - - 0,07 -

82 36,09 Bisiklo(3.2.0)hept-2-en-6-

one,7,7-dikloro

C7H6Cl2O 176 - - 0,03 -

83 36,22 Eudesm-7(11)-en-4-ol C15H26O 222 - - 0,06 -

84 37,20 4-Alil-1,2-diasetoksibenzen C13H14O4 222 - - 0,06 -

85 37,44 Sedrenol C15H24O 220 - - 0,13 0,07

86 41,74 (+)--Siperone C15H22O 218 - - 0,08 -

87 42,78 Tidak teridentifikasi - - - - 0,09 -

No

. Golongan Senyawa

Presentase (%)

F1 F2 F3 F4

1. Monoterpena 1,63 0,12 0,09 0,12

2. Monoterpena Alkohol 0,37 0,10 0,06 0,10

3. Seskuiterpena 24,49 44,36 49,21 43,72

4. Seskuiterpena Alkohol 6,00 11,26 15,15 11,20

5 Turunan Fenil Propanoid 66,07 42,54 32,83 43,07

6 Lain - lain 1,16 1,45 2,09 1,61

7 Tidak teridentifikasi 0,28 0,17 0,57 0,18

Total 100 100 100 100

Keterangan: F1: Fraksi jam ke-1

F2: Fraksi jam ke-2

F3: Fraksi jam ke-4

F4: Fraksi jam ke-6

5.1.2. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih

Aktivitas antibakteri fraksi minyak atsiri sirih terhadap tiga

bakteri uji dapat dihitung dengan mengukur diameter daerah hambat

(DDH) pertumbuhan bakteri disekitar kertas cakram yang terlihat

jernih. Berdasarkan hasil pengujian yang disajikan dalam tabel 3 dapat

diketahui bahwa fraksi minyak atsiri sirih pada konsentrasi 50% dapat

mempengaruhi pertumbuhan ketiga bakteri dengan tingkat hambatan

yang berbeda. F2 dan F4 minyak atsiri daun sirih memiliki tingkat

sensitifitas yang paling tinggi terhadap ketiga bakteri uji dibandingkan

dengan ketiga fraksi lainnya (tabel.3).

Tabel 3. Aktivitas fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap 3 jenis

bakteri uji gram positif pada konsentrasi 50%


F2: Fraksi jam ke-2

F3: Fraksi jam ke-4

F4: Fraksi jam ke-6

* : rata-rata dari dua ulangan

: tidak ada diameter daerah hambat

5.1.3. Penentuan MIC Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih

Penentuan nilai MIC berdasarkan atas konsentrasi minimal

fraksi minyak atsiri daun sirih yang dapat menghambat pertumbuhan

ketiga bakteri uji gram positif (tabel 4 dan tabel 5).

No Bakteri uji Diameter Daerah Hambat (mm)*

F1 F2 F3 F4

1 B. subtilis 4 8 7 7,5

2 S. epidermidis 2 4,5 2,5 5,5

3 S. mutan 5,5 13 4,5 8,5

Kontrol metanol - - - -


B. subtilis


F2: Fraksi jam ke-2

F3: Fraksi jam ke-4

F4: Fraksi jam ke-6

-: tidak ada pertumbuhan bakteri + : ada pertumbuhan bakteri

*: 0,5% tween 80, 2% etanol absolut dan aquadest


S. epidermidis dan S. mutan


F2: Fraksi jam ke-2

F3: Fraksi jam ke-4

F4: Fraksi jam ke-6

-: tidak ada pertumbuhan bakteri + : ada pertumbuhan bakteri

*: 0,5% tween 80, 2% etanol absolut dan aquadest

No Konsentrasi

MIC (%)

Nilai MIC B. subtilis

F1 F2 F3 F4

1 17,5 + + + +

2 15,5 + + + +

3 12,5 + + + +

4 10 + + + +

5 7,5 + + + +

6 5 + + + +

7 2,5 + + + +

Kontrol pelarut* - - - -

No Konsentrasi

MIC (%)

Nilai MIC

S.epidermidis

Nilai MIC S.mutan

F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4

1 5 - - - - - - - -

2 2,5 - - - - - - - -

3 1 - - - - + - - -

4 0,5 - - - - + + + -

5 0,25 - - - - + + + -

6 0,125 + + + + + + + +

Kontrol pelarut* - - - - - - - -

5.1.4. Analisis Kebocoran Protein dan Asam Nukleat

Pemberian fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih pada beberapa

dosis MIC mengakibatkan terjadinya kerusakan sel yang diamati

dengan adanya kebocoran protein dan asam nukleat dari sel bakteri.

Fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih menyebabkan kebocoran sel

yang diamati dengan adanya peningkatan nilai absorbansi pada panjang

gelombang 260 nm dan 280 nm (gambar 3). Senyawa-senyawa yang

memberikan serapan pada panjang gelombang 260 nm adalah asam

nukleat (RNA dan DNA), sedangkan pada panjang gelombang 280 nm

diidentifikasi sebagai protein.

Gambar 3. Nilai absorbansi asam nukleat dan protein fraksi jam ke-1

pada sel S .epidermidis


dan K+

Fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih juga dapat menyebabkan

terlepasnya ion Ca2+

dan K+

dari sel bakteri S.epidermidis. Ion-ion yang

keluar dari sel dapat dilihat pada gambar 4.

Gambar 4. Hasil pengukuran konsentrasi ion logam Ca2+

dan K+ fraksi

jam ke-1 pada supernatan biakan S.epidermidis konsentrasi

1 MIC dan 2 MIC

5.1.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel Bakteri S. epidermidis Dengan

SEM

Fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun sirih dengan perlakuan 1 MIC

dan 2 MIC juga dapat menyebabkan kebocoran pada membran sel, hal

ini bisa dilihat pada gambar 5. Dari gambar foto yang di dapatkan oleh

Scanning Electron Microscope dapat terlihat adanya perubahan

morfologi sel. Perubahan morfologi sel dapat ditunjukkan dari gambar

5(a) dimana hasilnya menunjukkan bakteri S. epidermidis yang

normal, sel-selnya masih terlihat kompak, dan berbentuk bulat.

Kemudian terjadi perubahan sel yang ditunjukkan oleh gambar 5(b) dan

gambar 5(c) dimana sel bakteri S. epidermidis yang sudah diberi

perlakuan minyak atsiri daun sirih dengan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC

terjadi perubahan sel jadi mengkerut dan berlubang.

Berlubang Berlubang dan Mengkerut

(a) (b) (c)

Gambar 5. Morfologi sel S.epidermidis. (a) kontrol, (b) Sel

S.epidermidis setelah perlakuan 1 MIC, (c) Sel

S.epidermidis setelah perlakuan 2 MIC (perbesaran

10.000x). Tanda panah adalah terjadinya kebocoran.

5.2. Pembahasan

Sirih dikenal karena hampir semua bagian tanaman digunakan sebagai

obat, disamping sebagai ramuan makan sirih. Selain itu dianggap juga dapat

menguatkan gigi, mencegah gangguan perut, menambah ketahanan tubuh,

stimulan syaraf dan lain lain (Pudjiastuti, 1996). Pada penelitian ini telah

dilakukan isolasi fraksi minyak atsiri, identifikasi komponen kimia fraksi, dan

uji aktivitas antibakteri dari daun sirih dalam bentuk fraksi minyak atsiri

untuk mendapatkan alternatif antibakteri. Daun sirih yang digunakan dalam

penelitian ini merupakan daun sirih segar yang berasal dari Balitro,

Cimanggu, Bogor dan telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Bidang

Botani, Puslit Biologi LIPI seperti yang tertera pada lampiran 1.

Metode yang digunakan untuk proses pemisahan komponen fraksi

minyak atsiri daun sirih adalah metode distilasi uap dan air (Sugiastuti, 2002;

Sulianti dan Chairul, 2002). Sebelum proses distilasi, daun sirih terlebih

dahulu disortasi dan dicuci untuk memisahkan dan menghilangkan pengotor

yang melekat pada sampel.Kemudian dirajang dengan cara dipotong potong

kecil untuk memperluas ukuran permukaan partikelnya agar mempermudah

kontak antara bahan sampel dengan uap air sehingga proses distilasi dapat

berlangsung dengan baik (Novalny, 2006).

Proses fraksinasi distilat ini dilakukan dengan menggunakan variasi

waktu pengambilan distilat yaitu pada jam ke-1 (F1), jam ke-2 (F2), jam ke-4

(F3) dan jam ke-6 (F4) untuk dapat mengamati hasil distilat yang diperoleh.

Perbedaan waktu pengambilan distilat memberikan hasil yang berbeda pada

volume distilat yang diperoleh. Hal ini berpengaruh terhadap presentase kadar

masing masing fraksi. Hasil distilasi uap dan air secara berurutan untuk

fraksi 1,2,3, dan 4 diperoleh minyak atsiri daun sirih dengan presentase

0.061%, 0.034%, 0.027% dan 0.015%. Namun demikian, minyak yang

diperoleh masih memiliki aroma dan warna yang sama, dengan aroma daun

sirih yang khas dan berwarna kuning jernih.

Dari hasil analisa GCMS diketahui bahwa keempat fraksi tersebut

memiliki kromatogram yang berbeda satu sama lain (gambar 1). F1 memiliki

64 komponen kimia penyusun. Dengan komponen utamanya (>5%) terdiri

dari fenol 4-(2-profenil)-asetat (10,34%), kavibetol (10,61%), fenol,2-

metoksi-4(1-profenil)-asetat (13,89%) dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen

(27.31%). Pada F2 terdeteksi sebanyak 56 puncak dan memilki 5 komponen

utama penyusunnya, antara lain kariofilen (8.70%), kavibetol (9.60%),

fenol,2-metoksi-4(1-profenil)-asetat (12.95%), pacouli alkohol (10.23%), dan

4-alil-1,2-diasetoksibenzen (14.53%). Dari hasil tersebut dapat diketahui

bahwa ada perbedaan jumlah komponen kimia mayor dan minor antara F1

dengan F2. Hasil identifikasi komponen kimia penyusun F2 menunjukkan

bahwa 48 komponen diantaranya merupakan komponen yang sama dengan

komponen penyusun F1 (Tabel 1). 16 komponen lainnya yang berbeda adalah

sabinen, -pinen, -terpinen, dl-limonen, -felandren, -terpen, -humulen,

estragol, -himakalen, -cadine, -gurjunen, kubenol, longiberneol, dan -

eudesmol.

Untuk F3 terdeteksi sebanyak 73 puncak dengan komponen utamanya

adalah kariofilen (8.54%), kavibetol (10.50%), fenol,2-metoksi-4 (1-profenil)

asetat (10.766%), pacouli alkohol (12.62%), dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen

(6.318%). Bila dibandingkan dengan komponen F2, sebagian komponen

penyusun F3 merupakan komponen penyusun F2 (tabel 1). 16 senyawa

lainnya sebagai penysusun komponen F3 antara lain -kadinena; kubenol; -

eudesmol; safrol; (-)--selinene; selina-3,7(l1)diena; (-)-kariofilen-(l1); -

guaein; 2-propenol,3-(2,6,6-trimetil-1-sikloheksen-1-yl); -Selinen; Bisiklo

(3.2.0) hept-2-en-6-one,7,7-dikloro; Eudesm-7(11)-en-4-ol; sedrenol; dan (+)-

-siperon. Jika dibandingkan dengan komponen senyawa F1, terdapat 14

komponen yang berbeda. Komponen berbeda tersebut merupakan komponen

yang sama-sama tidak terdeteksi di F2 pada F1.

Pada F4 terdapat 56 senyawa yang terdeteksi dengan kandungan

komponen utamanya antara lain kariofilen (8.61%), kavibetol (9,90%),

fenol,2-metoksi-4 (1-profenil) asetat (13.01%), pacouli alkohol (10.08%),

dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen (14.64%). Jika dibandingkan dengan F3,

terdapat 19 senyawa yang tidak dimiliki oleh F4. Sebanyak 16 senyawa

diantaranya adalah komponen kimia penyusun F4 dan 3 senyawa lainnya

merupakan komponen penyusun yang sama pada F1 dan F3 yaitu -kadinena,

kubenol dan -eudesmol. Jika dibandingkan dengan F2 tidak terdapat

senyawa yang berbeda. Jika dibandingkan dengan F1 terdapat 16 senyawa

yang berbeda. Yaitu senyawa yang sama sama tidak terdeteksi pada F2

(tabel 1) .Bila dibandingkan dengan hasil analisa minyak atsiri pada daun

sirih yang telah dilakukan para peneliti, terdapat beberapa persamaan

komponen utama penyusunnya, antara lain kariofilen, kavikol, -pinen,

kopaen, dan kamfen (Harapini et al., 1996; Rahmat et al., 2000; Jamal dan

Agusta, 2001; Parwata et al., 2009).

Identifikasi masing-masing puncak pada kromatogram masing-masing

fraksi minyak atsiri memperlihatkan bahwa komponen kimianya terdiri dari

monoterpena, monoterpena alkohol, seksuiterpena, seskuiterpena alkohol dan

turunan fenilpropanoid. Kemudian masing-masing komponen kimia fraksi

minyak atsiri daun sirih dikelompokkan berdasarkan golongan senyawanya

seperti yang tercantum pada tabel 2.

Pengujian aktivitas antibakteri fraksi minyak atsiri menggunakan

metode difusi cakram dan mikrodilusi. Metode difusi cakram merupakan

skrining awal untuk mengetahui sensivitas bakteri terhadap fraksi minyak

atsiri yang ditunjukkan dengan terbentuknya diameter daerah hambatan yang

berupa zona bening disekitar cakram kertas saring. Uji dilakukan dengan

mengaplikasikan cakram kertas saring berisi sejumlah fraksi minyak atsiri

diatas permukaan medium agar (medium padat) yang sebelumnya telah

diinokulasi bakteri uji. Setelah inkubasi 18 jam, dilakukan pengukuran daerah

hambatan yang jernih disekitar cakram.. Diameter daerah tersebut tergantung

pada aktivitas fraksi minyak atsiri terhadap bakteri yang diuji (Chamber,

2007). Semakin luas diameter hambatan tersebut menunjukkan semakin besar

daya antibakteri fraksi minyak atsiri daun sirih.

Dari hasil pengujian difusi cakram menunjukkan bahwa konsentrasi

50% masing masing fraksi minyak atsiri daun sirih dapat menghambat

pertumbuhan ketiga bakteri uji. Antara lain B. subtilis, S. mutan dan S.

epidermidis. Diameter penghambatan yang terbentuk antar tiap fraksi dan

bakteri berbeda. Fraksi 2 dan Fraksi 4 merupakan fraksi yang memiliki

sensivitas tertinggi terhadap ketiga bakteri uji (tabel 3). Hal ini dapat dilihat

dari besarnya zona bening yang terbentuk disekililing cakram uji .Sedangkan

bakteri yang memiliki sensitiviyas tertinggi terhadap semua fraksi minyak

atsiri daun sirih adalah S. mutan (Tabel 3). Aktivitas penghambatan yang

tinggi dari fraksi 2 dan fraksi 4 diduga karena kedua fraksi ini memiliki

kandungan senyawa minor ( 17.5% (v/v),

terhadap S. epidermidis adalah 0.25% (v/v), terhadap S. mutan adalah 2.5%

(F1), 1% (F2 dan F3), 0.25% (F4) beturut-turut. Walaupun S. mutan adalah

bakteri yang paling senstitif pada saat pengujian secara difusi, tetapi

aktivitasnya terhadap fraksi minyak atsiri kurang begitu peka dibandingkan

dengan S. epidermidis pada metode mikrodillusi. Dari hasil penelitian ini

menunjukkan bahwa fraksi minyak atsiri sirih tidak bersifat broad sprectrum

terhadap aktivitas ketiga bakteri uji tersebut. Bakteri S. epidermidis lebih

peka terhadap semua fraksi minyak atsiri sirih dibandingkan bakteri S. mutan

dan B. s subtilis. Sedangkan untuk fraksi minyak atsiri yang paling aktif

dalam menghambat pertumbuhan bakteri S.mutan adalah fraksi 4 (jam ke-6).

Kemungkinan ini dikarenakan adanya kontribusi komponen yang aktif pada

F4 yaitu senyawa asam benzoat,2-hidroksi-,metil ester; -kubeben; 3-alil-6-

metoksifenil asetat; dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzen. Kemampuan suatu

antibakteri juga sangat erat kaitannya dengan perbedaan jumlah dan intensitas

komponen penyusun senyawa kimia mayor dan minor setiap fraksi minyak

atsiri sirih serta perbedaan komposisi dinding sel bakteri. Walaupun

B.Subtilis termasuk bakteri gram positif, akan tetapi bakteri ini dapat

melindungi dirinya dari molekul fraksi minyak atsiri dengan cara

pembentukan spora (Scocibusik et al., 2006, Brooks et al., 2005). Sehingga

pada saat diplating, bakteri ini kembali bergerminasi dengan kemampuan

bertahan diri membentuk spora. Jadi, untuk menembus pertahanan spora,

maka dibutuhkan lebih banyak lagi molekul fraksi minyak atsiri daun sirih.

Sehingga nilai MIC nya jauh lebih tinggi dari S. epidermidis dan S. mutan.

Aktivitas antibakteri pada fraksi minyak atsiri sirih diduga disebabkan

adanya kontribusi dari senyawa senyawa dengan gugus alkoholik dan

senyawa fenolik alami yang di kandungnya. Fraksi minyak atsiri daun sirih

mengandung senyawa alkoholik ( pacouli alkohol ) dan senyawa fenolik

(kavibetol, 4-alil-1,2-diasetoksibenzen, fenol,2-metoksi-4-1(1-propfenil)-

asetat). Menurut Hertiani et al (2002) dalam daun sirih ditemukan adanya

senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antimikroba dalam minyak atsiri

adalah isoeugeunol dan kariofilen. Dalam daun sirih juga mengandung

hidroksikavikol, asam stearat dan palmitat yang mempunyai aktivitas sebagai

antimikroba (Nalina dan Rahim, 2006). Rahmat, et al (2000) menduga

senyawa yang berperan sebagai antibakteri dalam minyak atsiri daun sirih

adalah isoeugenol dan p-allifen . Senyawa fenolik dapat berfungsi sebagai

antimikroba karena adanya gugus OH yang bersifat racun terhadap mikroba

dan semakin banyak gugus OH yang ada pada senyawa tersebut maka

senyawa tersebut semakin beracun bagi mikroba (Cowan, 1999).

Perubahan atau kerusakan pada sel bakteri oleh senyawa bakteri

umumnya dapat di amati dalam bentuk kebocoran sel. Kerusakan sel bakteri

merupakan hasil interaksi senyawa antibakteri dengan bagian sel tertentu.

Interaksi senyawa antibakteri tersebut dapat menyebabkan sejumlah

perubahan atau kerusakan pada sel bakteri yang berpengaruh pada mekanisme

inaktivasi bakteri. Pada dosis yang tidak mematikan, bakteri mengalami luka

(injury), terjadi sejumlah perubahan dan kerusakan struktur sel bakteri yang

akhirnya dapat mempengaruhi fungsi metabolisme sel, sedangkan pada

kerusakan yang parah dapat menyebabkan kematian sel.

Pemberian fraksi 1 minyak atsiri daun sirih pada sel S. epidermidis

dengan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC dapat mengakibatkan terjadinya

kebocoran sel dan perubahan ukuran sel. Kebocoran sel dapat diamati dari

tingkat kerusakan dinding sel dan membran sel. Derajat tingkat kerusakan

dinding sel dapat diukur dari jumlah ion Ca2+

dan ion K+ yang terdapat pada

dinding sel, sedagkan tingkat kerusakan membran dapat di ukur dari bahan

bahan yang dilepaskan oleh sel yang dapat diserap pada panjang gelombang

260 nm untuk asam nukleat dan 280 nm untuk protein dengan menggunakan

spektofotometer UV-Vis (Carson et al., 2002). Menurut Burt

(2004) yang dikutip oleh Miksusanti (2009), Asam nukleat yang terdeteksi

pada panjang gelombang 260 nm adalah RNA dan turunan RNA yaitu

nukleotida (purin, pirimidin dan ribonukleotida), sedangkan senyawa protein

yang terdeteksi adalah tirosin dan triptofan. Meningkatnya jumlah

kandungan sel yang ditemukan pada permukaan sel menandakan terjadinya

kerusakan membran sel atau perubahan permeabilitas

Dari gambar 3 dapat diketahui bahwa pemberian konsentrasi fraksi 1

minyak atsiri daun sirih terhadap sel bakteri S. epidermidis dengan

konsentrasi 1 MIC dan 2 MIC memberikan perbedaan pada peningkatan

nilai absorbansi di panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi

untuk sel kontrol S.epidermidis pada panjang gelombang 260 nm adalah

0.423. Pada konsentrasi 1 MIC absorbansinya mengalami peningkatan

menjadi 1.539 dan pada konsentrasi 2 MIC terjadi peningkatan absorbansi

sekitar 2 kali yaitu 2.498. Pada panjang gelombang 280 nm, absorbansi untuk

sel normal, perlakuan 1 MIC dan 2 MIC juga mengalami peningkatan dari

0.437 menjadi 1.680 dan 3.010 secara berurutan. Dari hasil tersebut

menunjukkan bahwa peningkatan absorbansi protein pada panjang

gelombnag 280 nm lebih tinggi daripada absorbansi untuk asam nukleat di

panjang gelombang 260 nm. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi

dosis MIC yang diberikan, maka kebocoran metabolit seluler baik protein

maupun asam nukleat semakin meningkat. Hal ini sesuai dengan penelitian

yang dilakukan oleh Suliantari (2009) bahwa semakin tinggi konsentrasi

ekstrak daun sirih yang diberikan terhadap bakteri gram positif (S. aureus, B.

cereus dan L. monocytogenes) maka kebocoran asam nukleat dan protein dari

sel bakteri yang terjadi semakin tinggi pula.

Kandungan ion-ion logam yang berada dalam sel bakteri S. epidermidis

seperti Ca2+

dan K+ akan mengalami perubahan jika diberikan senyawa

antibakteri. Pemberian 1 MIC dan 2 MIC fraksi jam ke-1 minyak atsiri daun

sirih menyebabkan perubahan kandungan ion-ion Ca2+

dan K+

pada sel

medium tumbuh. Pada gambar 3 didapatkan bahwa nilai yang didapat untuk

ion Ca2+

untuk kontrol dan pemberian fraksi jam ke-1 minyak atsiri 1 MIC,

dan 2 MIC berturut-turut adalah 0.08 ppm, 36 ppm, dan 45 ppm. Sedangkan

untuk nilai ion K+ berturut-turut adalah 64 ppm; 80 ppm; 95 ppm. Dari hasil

ini didapatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi yang diberikan maka

semakin tinggi pula kerusakan membran sel yang terjadi. Indikasi adanya

kerusakan membran sitoplasma adalah terjadinya kebocoran kandungan ion-

ion Ca2+

dan K+ merupakan tanda kerusakan permeabilitas membran (Cox

et.al., 2001). Menurut Brooks et al 2005 Kekuatan struktur pada membran ini

disebabkan oleh adanya ikatan hidrogen, hidrofobik dan kation Mg2+

dan

Ca2+

bersama fosfolipida.

Seperti yang terjadi pada kebocoran sel, makin tinggi konsentrasi MIC

fraksi jam ke-1 (F1) minyak atsiri daun sirih yang digunakan, maka morfologi

sel bakteri juga semakin mengalami perubahan dibandingkan sel normal.

Kerusakan morfologi sel bakteri diamati dengan menggunakan SEM

(Fathillah et al., 2009 ). Pada S. epidermidis perbesaran 10.000 kali

menunjukkan dalam keadaan normal berbentuk bulat dengan permukaan yang

licin seperti yang terlihat pada gambar 4.a. Dengan adanya perlakuan

pemberian F1 minyak atsiri daun sirih 1 MIC, terjadi perubahan morfologi

pada membran sel nya yaitu sel menjadi berlubang dengan permukaan yang

masih rata (gambar 4.b). Sedangkan perlakuan pada konsentrasi 2 MIC, sel

berlubang dan permukaannya menjadi mengkerut dan kasar (gambar 4.c).

Dari hasil penelitian ini terlihat bahwa pada perlakuan konsentrasi 1 MIC F1

minyak atsiri daun sirih, belum menyebabkan sel bakteri rusak berat

dibandingkan dengan perlakuan 2 MIC. Walaupun terjadi kerusakan struktur

sel dan sel kehilangan isinya (ion Ca2+

dan K+), namun keseluruhan bentuk

sel masih dapat diamati.

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan

1. Fraksi minyak atsiri daun sirih yang berasal dari Balitro, Cimanggu. Bogor

memiliki presentase kadar yang dihasilkan secara berurutan untuk fraksi

1,2,3 dan 4 sebesar 0,061%; 0,034%; 0,027% dan 0,015%. dan memiliki

komponen kimia sebanyak 64 senyawa (F1), 56 senyawa (F2), 73

senyawa (F3) dan 56 senyawa (F4). Sebanyak 4 senyawa kimia sebagai

penyusun komponen mayor (>5%) F1, dan 5 senyawa kimia sebagai

komponen penyusun untuk F2, F3 dan F4. Komponen senyawa utama

yang paling tertinggi pada F1, F2, dan F4 adalah 4-alil-1,2-

diasetoksibenzen (27,35%; 14,53% dan 14,64%), sedangkan pada F3

adalah Pacouli alkohol (12,62%)

2. Fraksi Minyak atsiri daun sirih memiliki aktivitas antibakteri terhadap

bakteri S. mutan, S. epidermidis, dan B. subtilis. Nilai MIC yang diperoleh

dari setiap fraksi minyak atsiri terhadap S. epidermidis adalah 0,25 %

(v/v). B. subtilis >17,5% (v/v)., sedangkan S. mutan F1 sebesar 2,5%

(v/v) , F2 dan F3 sebesar 1% (v/v)., dan F4 sebesar 0,25% (v/v).

3. Mekanisme penghambatan antibakteri fraksi 1 minyak atsiri daun sirih

terhadap S. epidermidis adalah merusak membran sel bakteri, yang

ditandai dengan terjadinya peningkatan pelepasan senyawa metabolit

seluler seperti asam amino, protein, dan ion logam Ca2+

dan K+.

6.2. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut secara invivo untuk mengetahui

efektifitas dan toksisitasnya.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap bakteri patogen lain untuk

mengetahui aktivitas antibakterinya.

DAFTAR PUSTAKA

Agusta, A. 2000. Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika Indonesia. Penerbit ITB.

Bandung.

AlFarisi, S . 2009. Uji Mekanisme Penghambatan Antibakteri Minyak Atsiri Daun

Sirih (Piper Bettle Linn; Piperaceae ) Terhadap Staphylococcus

Epidermidis. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Jakarta.

Bilbiana,L., dan Hastowo,S. 1992. Mikrobiologi. Jakarta : Rajalawi Pers.

Brooks, G.F., Butel, J.S., dan Morse, S.A., 2005. Jawetz, Melnick & Adelbergs Mikrobiologi Kedokteran (Medical Microbiology). diterjemahkan oleh Eddy

M, Kuntaman, Eddy BW, Ni Made M, Setio H, dan Lindawati A. Edisi 1.

Jilid 1. Salemba Medika. Jakarta.

Carson, C.F., Brian, J.M., Riley, T.V., 2002. Mechanism of Action of Melaleuca

alternifolia (Tea Tree) Oil on Staphylococcus aureus Determined by Time

Kill, Lyses, Leakage, and Salt Tolerance Assays and Electron Microscopy.

Antimicrobial Agent and Chemotherapy 6 : 1914-1920.

Chambers, HF. 2007. Goodman dan Gilman Dasar Farmakologi Terapi,

diterjemahkan oleh Cucu ., Ella, E., Winny, RS., Amalia, H., July, M. Edisi

10. Jilid 2. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.

Cowan, M.M. 1999. Plant product asd antimicrobial agents. J. Microbiology

Reviews 612 (4) : 564 582.

Cox, S.D., Mann, C.M., Markham, J.L., Bell, H.C., Gustafson, J.E., Warmington,

J.R. and Wyllie, S.G.. 2000. The Mode of Antibacterial Action of The

Essential Oil of Melaleuca Alternifolia (Tea Tree Oil). J of Applied

Microbiology 88 : 170-175.

Didik, G., dan Mulyani, S. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid I. Penebar

Swadaya. Jakarta

Fathillah, A.R., Yusoff M, Rahim ZHA. The Effect of Psidium guajava and Piper

betle extracts on the Morphology of Dental Plaque Bacteria. Pak J Med Sci

2009;25(6):928-933.

Harapani, M., Agusta, A., dan Rahayu,DC. 1996. Komponen kimia minyak atsiri

dari dua macam sirih (daun kuning dan hijau). Prosiding Symposium

Tanaman Obat Dan Aromatic. Puslitbang biologi-LIPI. Bogor. 58-63.

Hermawan, A. 2007 . Pengaruh ekstrak daun sirih (piper betle l.) terhadap

pertumbuhan staphylococcus aureus dan escherichia coli Dengan metode

difusi disk. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan UAIR.

Hertiani,T., dan Purwantini, A.2002. Hasil distilasi ekstrak etanol daun sirih

(Piper betle L) dari beberapa daerah di Yogyakarta dan aktivitas antijamur

terhadap Candida albicans.Majalah Farmasi Indonesia 13 (4) : 193-199.

Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A. 1995. Medical Microbiology,

Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20. Alih Bahasa: Edi Nugroho dan RF

Maulany. EGC, Jakarta

Mann, C.M dan Markham, J.L. 1998. A new method for determining the

minimum inhibitory concentration of essential oils. Journal of Applied

Microbiology 84. 538-544.

Miksusanti. 2009. Aktivitas dan mekanisme minyak atsiri Temu Kunci

(Kaempheria pandurata Roxb) serta inkoporasinya dalam pati sagu sebagai

film edibel antibakteri. Disertasi. IPB

Nalina, T., and Rahim, Z.H.A. 2007. The Crude Aqueos Extract of Piper betle L.

and its Antibacterial Effect Toward Streptococcus mutans. American

Journal of Biotechnology and Biochemistry 3(1). 2007. 10-15.

Novalny, D. 2006. Pengaruh ukuran rajangan daun dan lama penyulingan

terhadap rendemen dan karakteristik minyak sirih (Piper betle Linn.).

Skripsi. IPB

Parwata, I.O.A.M., Rita, WS., Yoga, R. 2009. Isolasi dan

febriyati-fkik

Documents