26

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1Nilam (Pogostemon cablin) Tanaman nilam berasal dari daerah tropis di Asia, dan telah dibudidayakan secara luas di Cina, India, Thailand, Indonesia, Malaysia, Mauritius, Filipina, Afrika Barat, dan Vietnam.13 Tanaman nilam dalam taksonomi diklasifikasikan sebagai berikut:Kategori :Dicot Kingdom :Plantae Sub-kingdom :Tracheobionta Super divisi :Spermatophyta Divisi :Magnoliophyta Kelas :Magnoliopsida Sub-kelas :Asteridae Ordo :Lamiales Famili :Lamiaceae Genus :Pogostemon Species :Cablin Nama binomial:Pogostemon cablin Benth.142.1.1Morfologi Nilam Tanaman nilam merupakan tanaman tahunan (perennial), berasal dari genus Pogostemon, memiliki tinggi sekitar 0,75 meter dan berbunga kecil berwarna ungu-kemerahan. Tanaman ini merupakan tanaman perdu yang bercabang-cabang dan bertingkat-tingkat, serta memiliki aroma yang khas.15 (lihat Gambar 2.1 berikut) Daun tanaman berukuran panjang antara 5-11 cm, berbentuk bulat telur sampai bulat lonjong, berwarna hijau, tipis, lentur dan memiliki trichome (bulu) pada permukaan batang dan daun. Permukaan daun kasar dengan tepi yang bergerigi, berujung tumpul dan urat daun tampak menonjol.162.1.2Kandungan dan Potensi Nilam Nilam atau patchouli telah banyak digunakan dalam pengobatan tradisional di Asia lebih dari 20 abad yang lalu. Daun dan akar tanaman nilam digunakan sebagai anti-stress, anti-inflamasi, astringent, karminatif, diuretik, fungisida, insektisida, dan sedatif.17 Senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman nilam, yaitu; sesquiterpene, b-patchoulene, a-guaiene, caryophyllene, a-patchoulene, seychellene, a-bulnesene, norpatchoulenol, patchouli alcohol, dan pogostol.18

Gambar 2.1 Pogostemon cablin (dokumentasi pribadi) Gambar 2.2. Senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol akar dan rimpang tanaman nilam. Pengujian menggunakan HPLC kromatografi (254 nm)19

Akar dan rimpang tanaman nilam yang diekstraksi menggunakan etanol mengandung 3 (tiga) jenis senyawa kimia, yaitu; verbacoside, rosmarinic acid, dan pogostone. Ketiga senyawa kimia tersebut berperan dalam aktifitas anti-inflamasi dari akar dan rimpang tanaman nilam. Ekstrak etanol akar dan rimpang nilam, dalam dosis 120 mg/Kg, 240 mg/Kg, dan 480 mg/Kg menunjukkan adanya aktifitas anti-inflamasi melalui efek antioksidan dan pengaturan terhadap faktor-faktor inflamasi pada tikus yang diinduksi karagenan.19 Ekstrak metanol herbal nilam terbukti mampu memberikan efek analgesik anti-inflamasi pada tikus yang diinduksi formalin dan asam asetat. Ekstrak metanol herbal nilam dalam dosis 1 g/Kg terbukti mampu menurunkan writhing response pada tikus yang diinduksi asam asetat. Sementara pada tikus yang diinduksi formalin, efek analgesic nilam pada dosis 0,5 mg/Kg dan 1 mg/Kg mampu menghambat respon nyeri pada fase lambat, namun tidak mampu menghambat respon nyeri pada fase cepat. Ekstrak metanol herbal nilam pada tikus model inflamasi yang diinduksi karagenan diduga mampu meningkatkan kadar superoxide dismutase dan glutathione peroxidase, serta menurunkan kadar TNF- dan COX-2. Kondisi demikian akan menurunkan respon inflamasi sehingga menurunkan respon edema.20EdemaH2O2 H2O + O2Ekstrak metanol herbal nilamTNF-COX-2GPxSODInfiltrasi LeukositO2+OH+PGKaragenanPeningkatan tekanan hidrostatikReaksi inflamasi

Gambar 2.3. Efek ekstrak metanol herbal nilam terhadap tikus model inflamasi yang diinduksi karagenan20

2.1.3Minyak Atsiri Nilam Tanaman aromatik terbanyak berasal dari keluarga Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Zingiberaceae, Rutaceae yang tersebar hampir pada seluruh vegetasi tanaman di dunia. Karakteristik utama tanaman aromatik adalah kandungan minyak atsiri, yang menimbulkan aroma yang khas dari satu atau lebih organ tanaman tersebut.21 Minyak atsiri pada tanaman nilam terkandung di hampir seluruh bagian tanaman. Daun yang terdapat di bagian atas tanaman dan ranting tanaman muda merupakan sumber minyak atsiri nilam dengan kualitas tertinggi.22 Minyak atsiri nilam dapat disuling menggunakan destilasi air (hydro distillation), microwave distillation, supercritial fluid extraction, ultrasound extraction, dan destilasi uap (steam distillation). Metode penyulingan yang paling sering digunakan adalah destilasi uap, karena destilasi uap relatif sederhana, dan lebih mudah dimonitor prosesnya, serta lebih terjamin kemurniannya oleh karena destilasi uap hanya menggunakan air dan uap air.21 Alat destilasi uap terdiri atas ketel uap, distillation still, condensor dan penampung minyak dan air. Simplisia atau bagian tanaman yang akan disuling harus diisi secara penuh di dalam distillation still. Hal ini bertujuan agar tidak ada celah kosong di dalam distillation still yang dapat mengakibatkan menurunnya kuantitas dan kualitas minyak atsiri. Jumlah air yang dipanaskan dalam ketel uap harus diawasi secara rutin. Durasi penyulingan dapat bervariasi antara 6 - 8 jam. Proses penyulingan tersebut menghasilkan 2 produk berbeda, yaitu; bahan larut air, yang terlarut dalam uap air yang terkondensi, yang dikenal dengan nama hydrosol, dan bahan tidak larut air yang disebut sebagai minyak atsiri.21,232.1.4Toksisitas Minyak Atsiri Nilam2.1.4.1Potensi Minyak Atsiri Nilam Nilam merupakan salah satu jenis tanaman penghasil minyak atsiri. Nilam diperdagangkan dalam bentuk minyak, dan dikenal sebagai patchouli oil. Sebagaimana pada penelitian oleh Nickavar (2004) menyebutkan bahwa perbedaan komposisi dan jumlah komponen penyusun minyak dapat dipengaruhi oleh variabilitas dari subspecies tanaman yang berbeda, dan eksistensi chemotype yang berbeda.24 Minyak nilam digunakan dalam industri, kosmetik, parfum, pemberi aroma pada pasta gigi, dan lain-lain. Penggunaan minyak nilam pada industri ini karena daya fiksasinya yang cukup tinggi terhadap bahan pewangi lain sehingga mencegah penguapan yang berlebihan pada zat pewangi lain. Komponen kimia penyusun minyak nilam terdiri dari dua golongan, yaitu; golongan hidrokarbon yang berupa senyawa sesquiterpen (40-45%) dan golongan oxygenated hydrocarbon (52-57%).25 Patchouli alcohol (PA) merupakan komponen oxygenated hydrocarbon, yaitu senyawa dengan kadar terbesar, yang sangat menentukan aroma khas dan kualitas dari minyak nilam.26 Senyawa PA merupakan senyawa alkohol tricyclic sesquiterpene yang mempunyai gugus hidroksil, yaitu gugus OH- dan 4 buah gugus metil.27 Tabel mengenai Kandungan Fitokimia yang diisolasi dari Pogostemon cablin dapat dilihat pada Tabel 2.1.2.1.4.2Riset tentang Toksisitas Nilam Berdasarkan Penelitian yang dilakukan oleh Rahmah (2013), pada tikus yang diinduksi tawas dan diberi minyak atsiri daun nilam 12% sebanyak 2 ml, kelima ekor tikus mengalami kematian. Hewan coba tampak mengalami perubahan, seperti penurunan mobilitas, dan perilaku yang tampak seperti terkena efek anastesi. Pada pengamatan juga ditemukan feses hewan coba yang lebih encer, dibandingkan dengan kelompok perlakuan yang diberi minyak atsiri daun nilam dengan konsentrasi 3% dan 6% yang padat.25Tabel 2.1 Kandungan Fitokimia yang diisolasi dari Pogostemon cablin (GC-MS)24

Pada penelitian yang dilakukan oleh Hernandez et al (2011), uji Vitotox yang dilakukan terhadap ekstrak alkohol daun nilam menunjukkan bahwa kandungan cytotoxic chalcone pada nilam bersifat toksik terhadap sel.28 Hasil uji toksisitas akut yang dilakukan terhadap mencit menunjukkan, Patchouli Alkohol yang diisolasi dari tanaman nilam memiliki nilai LD50 sebesar 4693 mg/kgBB. Hewan coba tidak menunjukkan tanda-tanda kejang, namun tampak mengalami gangguan pernapasan (gasping) dan penurunan mobilitas yang progresif hingga kematian hewan coba.7 2.1.5Pengemulsi Minyak Atsiri Nilam Emulsi merupakan sebuah sistem yang mana suatu cairan dicampur pada cairan lain, namun tidak terbentuk suatu larutan sempurna atau immiscible. Sistem emulsi sering digunakan dalam bidang farmasi, makanan dan minuman, industri tekstil, industri kimia, dan sebagainya.15 Emulsi terdiri atas beberapa jenis atau bentuk, yakni; (1) oil-in-water (O/W) atau water-in-oil (W/O) yang merupakan makroemulsi dengan ukuran droplet 0,15 m, (2) nanoemulsions yang memiliki karakteristik mirip dengan makroemulsi, namun memiliki ukuran partikel 20 100 nm dan stabil secara kinetis, (3) micellar emulsions / microemulsions yang berukuran 5 50 nm serta stabil terhadap perubahan suhu, (4) double and multiple emulsions yang merupakan emulsi di dalam emulsi, atau berstruktur O/W/O atau W/O/W, (5) mixed emulsions merupakan emulsi yang membutuhkan makroemulsi untuk dapat terbentuk sistem emulsi yag sempurna. Pemisahan makroskopis dari dua atau lebih cairan tersebut dapat dicegah menggunakan surfaktan atau pengemulsi yang sesuai. Pengemulsi yang sering digunakan untuk mengemulsi minyak atsiri dan air adalah dimethyl sulfoxide (DMSO) dan carboxymethyl cellulose (CMC).161) Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Dimethyl sulfoxide (DMSO) adalah bahan organic cair yang bersifat sangat polar, dan digunakan secara luas sebagai pengemulsi dan pelarut. Dimethyl sulfoxide sangat sering ditambahkan dalam obat-obatan topikal karena aktifitas biologisnya yang sangat baik dalam menembus membran sel kulit. Dimethyl sulfoxide juga dapat digunakan untuk melindungi jaringan dalam sediaan Cryopreservation.10 Dimethyl sulfoxide merupakan bahan dipolar aprotic yang dibentuk dari proses metabolik tanah dan sedimennya. Dimethyl sulfoxide juga terbentuk secara alami melalui aktifitas mikroorganisme dengan bahan pembentuk dasar, yaitu sulfur dan dimethyl sulfide. Dimethyl sulfoxide dilaporkan ditemukan dalam kadar sangat rendah pada produk makanan seperti saus tomat, susu, bir, kopi, teh, dan sereal.17 Ketoksikan akut dan kronis DMSO sangat rendah terhadap hewan, tanaman, maupun terhadap makhluk yang hidup di air. Pada uji toksisitas menggunakan konsentrasi maksimal dengan pajanan secara topikal, oral, dan inhalasi secara konsisten menunjukkan tingkat ketoksikan yang rendah.18 Pemberian DMSO terhadap subjek manusia dosis 1 g/KgBB/hari selama 14 hari memberikan efek sedative headache, mual, dan pusing.6 Pada uji toksisitas DMSO secara per oral terhadap anjing, babi, tikus dan kelinci membuktikan bahwa pemberian selama 9 - 10 bulan pada dosis 1 ml/Kg memberikan efek toksik terhadap lensa dan vitreous organ mata hewan coba.30

Gambar 2.4. Struktur kimia dimethyl sulfoxide (DMSO)18

Semakin tinggi konstanta dielektrika suatu pelarut, maka semakin tinggi pula kemampuannya untuk melarutkan suatu bahan. Karena DMSO memiliki konstanta dielektrika yang cukup besar dibanding pelarut lainnya, maka tidak heran apabila DMSO disebut sebagai super solvent. Kondisi lain yang menyebabkan DMSO dapat menjadi pelarut yang baik adalah struktur kimia DMSO yang tidak rata, yaitu piramida trigonal, serta memiliki sepasang elektron dipuncaknya.172) Carboxymethyl cellulose (CMC) Carboxymethyl cellulose (CMC) merupakan bahan eter selulosa yang berasal dari bahan baku kayu, dan direaksikan dengan selulosa alkali dan sodium monokloroasetat.19,20 Carboxymethyl cellulose merupakan polimer anion yang larut dalam air. Pemanfaatan CMC telah diterapkan secara luas dalam industri farmasi dan makanan, karena CMC memiliki beberapa kelebihan, yakni; (1) CMC merupakan surfaktan yang mampu menurunkan tegangan permukaan, sehingga dapat digunakan untuk mencampur beberapa bahan membentuk emulsi yang stabil dan sempurna, (2) Karena sifat CMC yang dapat mengentalkan air, maka CMC sering digunakan dalam industry sebagai Flow control agent, (3) CMC merupakan bahan yang polar dan stabil pada suhu dingin maupun panas, sehingga cocok digunakan sebagai bahan tambahan dalam industry kimia, obat, maupun makanan, (4) CMC terbukti aman terhadap makhluk hidup, termasuk manusia dan lingkungan. Senyawa CMC mudah diserap dan dieskresikan oleh tubuh, serta didegradasi oleh lingkungan dengan cepat, sehingga aman untuk digunakan dalam obat maupun makanan.19,21

Gambar 2.5. Struktur kimia carboxymethyl cellulose (CMC).22 Ketoksikan CMC terbukti sangat rendah dan tergolong sebagai bahan kimia yang aman bagi manusia dan lingkungan. Pada uji toksisitas akut dan subkronis, CMC tidak menimbulkan kematian pada seluruh hewan coba. Pengemulsi CMC memberikan efek diare dan pelebaran usus besar hewan coba, serta terjadi peningkatan produksi urin dan konsumsi cairan akibat senyawa sodium 7 - 8% dalam CMC.8Penelitian efek toksisitas MAHN ini dilakukan sebagai bagian dari penelitian toksikologi. Sebagaimana dijelaskan sebelumnya bahwa MAHN dipergunakan secara luas oleh masyarakat. Namun uji toksisitas senyawanya belum dilakukan. Sehingga penelitian ini dilakukan sebagai bagian uji toksikologi pada MAHN.2.2 Toksikologi Manusia telah lama mempelajari tentang bahan-bahan beracun dan berbahaya. Aplikasi toksikologi telah ada sejak lama karena manusia telah mengenal bahwa banyak sekali bahan di alam yang berbahaya dan mengancam kesehatan mereka. Bahkan bahan beracun tersebut juga dimanfaatkan dalam menunjang kehidupan mereka, seperti berburu dan lain sebagainya.5Toksikologi adalah ilmu yang mempelajari mengenai deteksi, pengolahan, kandungan, efek dan regulasi bahan-bahan beracun. Toksikologi membahas paparan, distribusi, metabolisme, interaksi bahan toksik dengan sel dan manifestasi bahan-bahan beracun yang terpapar pada tubuh manusia. Ilmu toksikologi telah membantu kehidupan manusia dalam berbagai bidang, bukan hanya melindungi manusia dan lingkungan dari bahan-bahan berbahaya, tetapi juga membantu manusia memilih bahan-bahan toksik yang selektif terhadap kanker.4Toksikologi memiliki beberapa cabang ilmu yang telah lama dipelajari dan dimanfaatkan oleh manusia, yaitu;1. Toksikologi Forensik2. Toksikologi Pestisida3. Toksikologi Obat4. Toksikologi Regulatori5. Toksikologi Eksperimental5Racun mengalami banyak proses di dalam tubuh sebelum akhirnya menimbulkan manifestasi klinis tertentu. Suatu bahan dapat bersifat toksik pada spesies tertentu, namun belum tentu bahan tersebut bersifat toksik terhadap spesies lain. Hal ini menunjukkan bahwa setiap spesies memiliki kemampuan metabolisme dan pertahanan masing-masing dalam mengolah ancaman bahan beracun yang terpapar pada tubuhnya.4

IngestiKulitInhalasi

Absorbsi ke aliran darahDistribusi ke jaringan dan organ

Paparan Bahan Toksik

Storage

Toxicity

Metabolisme

Eksresi

Gambar 2.1 Bagan Perjalanan Bahan Toksik Dalam Tubuh4.Pada saat melakukan uji toksisitas terhadap suatu senyawa tertentu, diperlukan tiga komponen utama yang harus dipenuhi dalam penelitian uji toksisitas;1. Pemilihan hewan coba yang tepat,2. Pemilihan variabel pengamatan/pemeriksaan yang tepat (metode pemeriksaan),3. Lama paparan bahan toksik terhadap hewan coba,4. Durasi pengamatan terhadap hewan coba yang telah terpapar,5. Variasi dosis yang tepat untuk pengujian bahan.2.2.1 Uji Toksisitas1) Uji Toksisitas AkutUji toksisitas akut merupakan uji untuk menentukan Dosis Lethal (LD50), dimana LD50 didefinisikan sebagai dosis tunggal suatu zat yang secarastatistik diharapkan akan membunuh 50% hewan percobaan. Uji toksisitas akut ini dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji kepada hewan coba selama masa pengujian dan diamati dalam jangka waktu minimal 24 jam atau lebih (7-14 hari). Uji toksisitas akut dirancang untuk menentukan efek toksik suatu senyawa yang akan terjadi dalam waktu yang singkat setelah pemejanan atau pemberiannya dengan takaran tertentu. Takaran dosis yang dianjurkan paling tidak empat peringkat dosis, berkisar dari dosis terendah yang tidak atau hampir tidak mematikan seluruh hewan uji sampai dengan dosis tertinggi yang dapat mematikan seluruh atau hampir seluruh hewan uji. Biasanya pengamatan dilakukan selama 24 jam, kecuali pada kasus tertentu selama 7-14 hari. Pengamatan tersebut meliputi: gejala-gejala klinis seperti nafsu makan,bobot badan, keadaan mata dan bulu, tingkah laku, jumlah hewan yang mati serta histopatologi organ.6Pada uji toksisitas akut dapat diperoleh gambaran kerugian yang terjadi akibat peningkatan dosis tunggal dan bagaimana kematian dapat terjadi. Uji toksisitas akut dapat memberikan gambaran tentang gejala-gejala ketoksikan terhadap fungsi penting seperti gerak, tingkah laku, dan pernafasan yang dapat menyebabkan kematian. LD50 dapat dihubungkan dengan Efektif Dosis 50 (ED50) yaitu dosis yang secara terapeutik efektif terhadap 50% dari sekelompok hewan percobaan. Hubungan tersebut dapat berupa perbandingan antara LD50 dengan ED50 dan disebut Indeks Terapeutik (IT), yaitu perbandingan antara dosis obat yang memberikan efek terapi yang samar dengan dosis obat yang menyebabkan efek toksik yang nyata. Makin besar indeks terapeutik suatu obat makin aman obat tersebut.7Keracunan akut dihasilkan dari jumlah racun yang relatif besarmemasuki tubuh dihitung dengan periode menit, jam, atau beberapa hari.Evaluasi tidak hanya mengenai LD50, tetapi juga terhadap kelainan tingkahlaku, stimulasi, aktivitas motorik, dan pernapasan mencit atau hewanpercobaan lainnya untuk mendapatkan gambaran tentang sebab kematian.8 Tingkat keracunan senyawa kimia atau obat berdasarkannilai LD50 dan klasifikasi toksisitas akut dapat dilihat pada Tabel 2.1. 2) Uji Toksisitas SubkronisUji toksisitas subkronis adalah uji ketoksikan suatu senyawa yang diberikan dengan dosis berulang pada hewan uji tertentu, selama kurang dari tiga bulan. Uji ini ditujukan untuk mengungkapkan spectrum efek toksik senyawa uji serta untuk memperlihatkan apakah spectrum efek toksik itu berkaitan dengan takaran dosis.10

Tabel 2.1 Kriteria derajat toksisitas .9KategoriLD50 (mg/kgBB)

Supertoksik5 atau kurang

Amat sangat toksik5 50

Sangat toksik50 500

Toksik sedang500 5000

Toksik ringan5000 15000

Praktis tidak toksik> 15000

Hasil uji ketoksikan subkronis akan memberikan informasi yang bermanfaat tentang efek utama senyawa uji dan organ sasaran yang dipengaruhinya. Selain itu juga dapat diperoleh info tentang perkembangan efek toksik yang lambat berkaitan dengan takaran yang tidak teramati pada uji ketoksikan akut. Kekerabatan antar kadar senyawa pada darah dan jaringan terhadap perkembangan luka toksik dan keterbalikan efek toksik.10Tujuan utama dari uji ini adalah untuk mengungkapkan dosis tertinggi yang diberikan tanpa memberikan efek merugikan serta untuk mengetahui pengaruh senyawa kimia terhadap badan dalam pemberian berulang.10Pengamatan gejala toksik meliputi:1. Pengamatan fisik, perilaku, saluran cerna, kulit dan bulu.2. Berat badan hewan uji.3. Asupan makan atau minuman untuk masing-masing hewan uji atau kelompok hewan uji.4. Pemeriksaan fungsi organ secara biokimia melalui analisis urin (bobot jenis, protein total, volume urin, glukosa, bilirubin) dilakukan pada awal dan akhir uji.5. Pengamatan gejala klinis diperiksa melalui pengamatan fisik dalam jangka waktu setelah pemajanan tiap hari selama 30 hari.Pada penelitian ini akan dilakukan uji toksisitas pada hewan coba ikan zebra (Danio rerio) dengan berbagai pertimbangan pemilihannya. Adapun uraian mengenai ikan zebra dan alasan kenapa memilihnya dapat dilihat pada uraian berikut ini. 2.3 Ikan Zebra Ikan zebra (Danio rerio) merupakan ikan air tawar yang berasal dari India, Myanmar, dan Indonesia yang memiliki panjang tubuh hingga 4,5 cm. Ikan zebra merupakan hewan bertulang belakang (vertebrata) dan memiliki garis horisontal putih perak dan biru pada badan dan siripnya.26 Ikan zebra dalam taksonomi diklasifikasikan sebagai berikut;Kingdom :AnimaliaDivisi :ChordataKelas :ActinopterygiiOrdo :CypriniformesFamili :Cyprinidae Genus :Danio Species :Danio rerio.27

Gambar 2.2 : Ikan Zebra (Danio rerio)28

Gambar 2.4 : Waktu Perkembangan Ikan Zebra.29 Embrio ikan zebra berkembang relatif cepat dengan fungsi kardiovaskuler dan sistem syaraf yang dapat diamati beberapa jam setelah fertilisasi. Embrio ikan zebra sangat mudah diamati karena memiliki chorion yang transparan. Embrio ikan zebra dengan cepat dapat menyerap senyawa dengan berat molekul rendah yang ada didalam larutan sekitarnya. Embrio ikan zebra menetas dan berkembang menjadi larva pada hari keempat. Organ dalam larva ikan zebra telah berfungsi pada tahap ini. Sel epithelial intestinal memproduksi berbagai enzim pencernaan, hepatosit memproduksi empedu, serta sel-sel pankreas memproduksi insulin dan karboksipertidase. Pada usia 7 hari pasca fertilisasi penyerapan terjadi melalui insang. Masa hidup ikan zebra berkisar 3-5 tahun.30

Gambar 2.3 : Bentuk Perkembangan Embrio Ikan Zebra.29 Pemanfaatan ikan zebra sebagai hewan coba dalam penelitian meningkat cukup signifikan, terutama dalam bidang genetic, neuroscience, neurofarmakologi, neural development, dan behavioural neuroscience.312.3.1 Ikan zebra Sebagai Model Ideal Binatang Coba Karakteristik yang menyebabkan ikan zebra populer sebagai binatang model dalam penelitian adalah : (1) Ikan zebra memiliki embrio dan larva yang transparan. Kondisi ini memungkinkan untuk dilakukan penelitian secara in vivo dan pengamatan secara real-time.32,33 (2) Produktifitas ikan zebra dalam menghasilkan embrio dalam jumlah besar disertai embryogenesis yang relatif cepat. Biaya perawatan ikan zebra secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan hewan coba mamalia lain.34 (3) Genome sequence ikan zebra telah selesai diidentifikasi pada akhir tahun 2010 sehingga kajian molekuler dan genetik sangat memungkinkan untuk kajian penentuan ekspresi gen, fungsi gen melalui pengembangan transgenik, antisense gene knockdown dan mutagenesis dalam skala besar.35,36,37 (4) Ikan zebra memiliki sistem kardiovaskuler, syaraf dan sistem pencernaan yang mirip dengan mamalia. Ikan zebra yang tergolong vertebrata ini memiliki berbagai macam organ dan tipe sel yang serupa dengan mamalia. Proses organogenesis terjadi relatif cepat yaitu organ-organ utama telah terbentuk setelah 5-6 hari pasca fertilisasi. (5) Tingkat konservasi yang tinggi antara genom ikan zebra dengan manusia, yaitu 75%.342.3.2 Ikan zebra untuk kajian Toksikologi Embrio dan ikan zebra dewasa dapat digunakan untuk menguji toksisitas akut terhadap berbagai bahan (misalnya logam berat, pestisida dan senyawa-senyawa lain yang menyebabkan kontaminasi lingkungan atau polusi). Uji toksisitas akut meliputi pengujian LC50 (konsentrasi yang dapat membunuh 50% ikan). Pendekatan serupa juga dapat dilakukan untuk penapisan toksisitas akut senyawa obat. Terdapat beberapa standart uji toksisitas yang direkomendasikan oleh International Standardization Organization (ISO) misalnya organization for Economic Cooperation and Development (OECD), dan telah ada rekomendasi internasional untuk pengujian toksisitas akut baik pada embrio maupun ikan zebra dewasa.38 LC50 mempunyai peran penting dalam pemahaman efek toksik obat pada mamalia. Uji toksisitas akut pada ikan zebra terfokus pada penentuan konsentrasi dari substansi yang diuji. Sementara kajian absorbsi dan distribusi bahan uji pada pada ikan zebra masih dalam tahap pengembangan. Penentuan nilai LC50 berbagai senyawa pada embrio ikan zebra menggunakan satuan mg/liter dan untuk mamalia mg/kgBB.392.3.3Ikan Zebra sebagai Model Ideal Binatang Coba pada Berbagai Penelitian BiomedisKarakteristik yang menyebabkan ikan zebra populer sebagai binatang model adalah: (1) Ikan zebra memiliki larva yang transparan. Embrio yang transparan memungkinkan pengamatan seluruh sel, jaringan dan organ secara in vivo dan real-time sampai pada tahap perkembangan awal larva; 13,14 (2) Embriogenesis yang cepat dan tingginya tingkat fekunditas menyebabkan jumlah embrio yang dihasilkan sangat besar. Dalam kondisi optimum ikan zebra betina dapat menghasilkan 300 telur per minggu sehingga sangat menguntungkan untuk kajian meiosis dan cloning. Di samping itu rendahnya biaya perawatan yang sangat signifikan jika dibandingkan perawatan binatang model mamalia;15 (3) Keseluruhan sekuensing genom ikan zebra telah selesai diidentifikasi pada akhir tahun 2010 oleh Zfin (2011) sehingga kajian molekuler dan genetik sangat memungkinkan untuk kajian penentuan ekspresi gen, fungsi gen melalui pengembangan transgenik, antisense gene knockdown dan mutagenesis dalam skala besar;16, 17, 18 (4) Ikan zebra memiliki sistem kardiovaskuler, syaraf dan sistem pencernaan yang mirip dengan mamalia. Ikan zebra yang tergolong vertebrata ini memiliki berbagai macam organ dan tipe sel yang serupa dengan mamalia. Proses organogenesis terjadi relatif cepat yaitu organ-organ utama telah terbentuk setelah 5-6 hari pasca fertilisasi (dpf); (5) Tingkat konservasi yang tinggi antara genom ikan zebra dengan manusia (persamaannya sekitar 75%).15 (6) Sensitifitasnya terhadap lingkungan menyebabkan ikan zebra digunakan sebagai bioindikator adanya polutan dan pengujian bahan obat (uji toksisitas dan pengembangan obat).15, 19 1. Model untuk Menentukan Lethal Concentration (LC50) EmbrioEmbrio ikan zebra dipilih sebagai hewan coba uji toksisitas dengan pajanan konsentrasi minimal karena sensitifitasnya lebih tinggi dibandingkan ikan zebra dewasa.20 Ada berbagai hewan coba yang dipakai dalam uji toksisitas antara lain tikus wistar, mencit, lalat buah dan ikan zebra. Pemilihan jenis hewan coba tersebut didasarkan pada tingkat kemiripan DNA (deoxyribonucleic acid), dan kemampuan reproduksi. Uji toksisitas menggunakan ikan zebra (Danio rerio) lebih murah, lebih mudah dan memiliki sensitifitas yang lebih baik karena spesies tersebut mempunyai 70-85% kemiripan DNA dengan manusia. Hasil uji toksisitas dengan subjek embrio (early-life stage) memberikan prediksi toksisitas jangka panjang yang lebih tepat pada 80% bahan uji.21 2. Model untuk Uji Teratogenik Studi toksikologi preklinik termasuk menggunakan uji teratogenik,uji ini sudah mulai dikembangkan karena kemampuannya untuk memprediksi potensi teratogenik suatu obat, karena ikan zebra sangat sensitif terhadap perubahan lingkungan dan suatu senyawa obat dapat masuk ke dalam tubuh larva ikan zebra melalui kulit maka dalam hal ini uji teratogenik menggunakan embrio ikan zebra. Pada uji teratogenik hasil yang dilihat adalah perkembangan kepala, ekor dan jantung, scoliosis,deformitas yolk dan kelainan pertumbuhan yang akan di evaluasi dibawah mikroskop setelah72 hpf.22 3. Model untuk Menilai Heart Rate EmbrioTerdapat banyak kesamaan antara jantung manusia dengan jantung ikan yaitu berfungsi memompa darah dengan arah dan ritme yang sama serta dibentuk oleh sel myosit yang terkonservasi. Ikan zebra memiliki sistem kardiovaskular, saraf, dan sistem pencernaan yang mirip dengan mamalia. Ikan zebra yang tergolong vertebra ini memiliki berbagai macam organ dan tipe sel yang serupa dengan mamalia. Proses organogenesis terjadi relatif cepat yaitu organ-organ utama telah terbentuk setelah 5-6 hari setelah fertilisasi. Tingkat konservasi yang tinggi antara genom ikan zebra dengan manusia (persamaannya sekitar 75%).154. Model untuk Menilai Kelengkungan Tulang BelakangGeorge Tressinger memulai penelitian menggunakan ikan zebra (Danio rerio) sebagai binatang model dan mempublikasikan hasil penelitian tentang analisa perkembangan vertebra melalui pendekatan genetis. Stressinger melihat keunggulan zebra yaitu: waktu genetic yang pendek (2-3 bulan), tingginya tingkat fekunditas (100-300 embrio per mating), reproduksi secara ovipar, embrio yang transparan sehingga memudahkan pengamatan sel dan organ saat embrio.12Penggunaan Ikan zebra (Danio rerio) sebagai model penelitian vertebra karena ikan zebra memiliki larva yang transparan memungkinkan pengamatan seluruh sel, jaringan dan organ secara in vivo dan real-time sampai pada tahap perkembangan awal larva menurut penelitian Eisen (1996) dan Fishman (1999) serta tingkat konservasi yang tinggi antara genom ikan zebra dengan manusia (persamaannya sekitar 75%).13, 14, 155. Model untuk Menilai Lethal Concentration LarvaLC50 adalah lethal concentration yang banyak digunakan sebagai screening uji toksisitas akut suatu senyawa yang dapat menimbulkan kematian pada 50% populasi dan sudah direkomendasikan oleh International Organization Standrdization (ISO), sebagai standart penghitungan LC50.15Tingkat kemiripan ikan zebra secara genetik terhadap mamalia yang hampir sama dan sensitivitas yang tinggi terhadap perubahan lingkungan sehingga dapat membantu menentukan nilai dari efek toksisitas yang diberikan secara akut.166. Model untuk Menilai Heart Rate LarvaIkan zebra memiliki denyut jantung yang yang berirama dari kanal ion yang berfungsi untuk metabolisme dan transparansi dari embrio memudahkan evaluasi denyut jantung dan efek fungsi jantung larva ikan zebra dapat bertahan tanpa sirkulasi selama empat sampai lima hari.23 7. Model untuk Melihat Perilaku LarvaDepresi merupakan suatu sindrom psikiatrik yang manifestasinya dapat berupa perasaan murung, turunnya berat badan, kemunduran psikomotor dan kehilangan gairah hidup.24 Menurut diagnostic and statistical manual of mental disorders edisi ke-4 orang dengan depresi mayor merasa sedih dan tak berdaya setiap hari dan kadang-kadang selama berminggu-minggu, mereka merasa tak bertenaga, berusaha bunuh diri, sulit tidur, tak dapat konsentrasi, sulit menikmati kehidupan seks atau makanan, dan dalam banyak hal bahkan sulit membayangkan dapat berbahagia kembali.25 Orang dengan gejala depresi juga mudah putus asa, lamban, malas bekerja dan cenderung bersifat pasif sehingga aktifitas motoriknya menurun. sedangan perilaku agresif merupakan suatu kecenderungan perilaku yang dilakukan secara sengaja untuk menyakiti orang lain baik secara fisik dan verbal, amarah dan permusuhan. Pada penelitian ini, peneliti ingin membuktikan apakah pemberian minyak atsiri herba nilam dapat mempengaruhi perilaku depresid ataupun agresif berenang pada swim test larva ikan zebra.26 8. Model untuk Menilai Lethal Concentration (LC50) Keamanan tanaman obat perlu dievaluasi dengan melakukan uji toksisitas. Pengujian toksisitas yang menjadi prioritas untuk menilai keamanan suatu herbal adalah Lethal Concentration 50 (LC50). Penentuan LC50 mempunyai peran penting dalam pemahaman efek toksik obat pada suatu hewan coba. Parameter ini menggambarkan konsentrasi minyak atsiri herbal nilam yang dapat mematikan 50% dari hewan coba.27 9. Model untuk ReproduksiEfek toksik suatu zat sangatlah komplek. Efek yang dihasilkan beragam, tidak hanya berdampak lethal bagi hewan coba, namun bisa juga berdampak teratogenik bagi hewan coba tersebut. Ikan zebra sebagai spesies ovipar memiliki fertilisasi eksternal. Selain itu, telur zebrafish yang transparant dari fase fertilisasi sampai pharyngulasi memudahkan kita untuk melakukan observasi terhadap perkembangan tahap awal. Oleh karena itulah dilakukan penelitian untuk melihat apakah minyak atsiri herbal nilam memiliki efek toksik pada reproduksi ikan zebra. Penelitian ini diharapkan bisa diimplementasikan hasilnya pada manusia karena ikan zebra dan mamalia memiliki kesamaaan dalam hal jaringan dan genetik.1510. Model untuk Perilaku Penggunaan ikan zebra akhir-akhir ini meningkat signifikan dan berperan penting untuk penelitian Neuroscience, seperti neurofarmakologi, neural development dan regenerasi, behavioral neuroscience dan kajian penyakit syaraf.52 Dopaminergik neuron pada ikan zebra terdeteksi pada 18 jam setelah fertilisasi (hpf) dan sistem saraf pusat (CNS) telah berkembang sempurna pada 71 hpf. Penggunaan ikan zebra juga diketahui sangat meningkat pada sepuluh tahun terakhir untuk penelitian neurobehavioral karena kemudahan untuk mengetahui korelasi pola kebiasaan dengan fungsi fisiologi sebagai endpoint secara individual.28 Penelitian ini dilakukan untuk uji toksisitas minyak atsiri herba nilam dengan hewan conba ikan zebra. Adapun uraian mengenai herba nilam akan dijelaskan pada sub bab 2. 4 berikut.2.4 Efek Toksik Minyak Atsiri Herba NilamSebelum dapat dimanfaatkan sebagai obat baik pemberian secara per oral, topikal maupun bentuk sediaan yang lain, hendaknya suatu senyawa (obat) harus melalui uji toksisitas untuk menjamin keamanannya. Bahwa obat tersebut tidak atau hanya menimbulkan efek samping yang minimal dan tidak mengganggu kesehatan. Tanaman nilam yang diteliti sebagai tanaman obat juga telah melalui beberapa uji toksisitas sederhana untuk membuktikan toksisitasnya.Berdasarkan Penelitian yang dilakukan oleh Rahmah (2013), pada tikus yang diinduksi tawas dan diberi minyak atsiri daun nilam 12% sebanyak 2 ml, kelima ekor tikus mengalami kematian. Hewan coba tampak mengalami perubahan, seperti penurunan mobilitas, dan perilaku yang tampak seperti terkena efek anastesi. Pada pengamatan juga ditemukan feses hewan coba yang lebih encer, dibandingkan dengan kelompok perlakuan yang diberi minyak atsiri daun nilam dengan konsentrasi 3% dan 6% yang padat1.Pada penelitian yang dilakukan oleh Hernandez et al (2011), uji Vitotox yang dilakukan terhadap ekstrak alcohol daun nilam menunjukkan bahwa kandungan cytotoxic chalcone pada nilam bersifat toksik terhadap sel.28 Hasil uji toksisitas akut yang dilakukan terhadap mencit menunjukkan, Patchouli Alkohol yang diisolasi dari tanaman nilam memiliki nilai LD50 sebesar 4693 mg/kgBB. Hewan coba tidak menunjukkan tanda-tanda kejang, namun tampak mengalami gangguan pernapasan (gasping) dan penurunan mobilitas yang progresif hingga kematian hewan coba.36