asam kafeat

SKRIPSI

IDENTIFIKASI SENYAWA ASAM FENOLAT PADA SAYURAN

INDIGENOUS INDONESIA

Oleh:

RIZA ARIS APRIADY

F24050276

2010

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

IDENTIFIKASI SENYAWA ASAM FENOLAT PADA SAYURAN

INDIGENOUS INDONESIA

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh:

RIZA ARIS APRIADY

F24050276

2010

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

Judul Skripsi : Identifikasi Senyawa Asam Fenolat pada Sayuran Indigenous

Indonesia

Nama : Riza Aris Apriady

NIM : F24050276

Menyetujui Dosen Pembimbing,

Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si.

NIP: 19630701.198811.2.001

Mengetahui,

Ketua Departemen,

Dr. Ir. Dahrul Syah

NIP: 19650814.199002.1.001

Tanggal Lulus: 22 Januari 2010

Riza Aris Apriady. F24050276. Identifikasi Senyawa Asam Fenolat pada

Sayuran Indigenous Indonesia. Di Bawah Bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan,

M.Si.

ABSTRAK

Jawa Barat merupakan salah satu provinsi penghasil sayur-sayuran yang

memiliki peran cukup signifikan dalam menghasilkan jenis sayur-sayuran di

Indonesia. Spesies sayuran asli Indonesia yang berasal dari

daerah/wilayah/ekosistem tertentu, termasuk spesies pendatang dari wilayah

geografis lain tetapi telah berevolusi dengan iklim dan geografis wilayah

Indonesia dinamakan sayuran indigenous. Beberapa balai penelitian seperti Balai

Penelitian Tanaman Sayuran (Balitsa) bekerjasama dengan Asian Vegetables

Research Development Center (AVRDC) telah melakukan pendataan terhadap

sayuran ini terutama yang mempunyai kandungan gizi dan non gizi yang

bermanfaat secara fisiologis bagi tubuh manusia yaitu vitamin A, zat besi, dan

antioksidan.

Antioksidan merupakan senyawa yang sangat baik untuk menangkap

radikal bebas. Keberadaan senyawa antioksidan ini akan mencegah penyakit

kanker maupun penyakit degeneratif lainnya. Salah satu senyawa antioksidan

yang penting yaitu senyawa polifenol. Senyawa polifenol yang ada di sayuran,

buah-buahan, dan teh dapat mencegah penyakit degeneratif termasuk kanker

melalui aktivitas antioksidatif dan/atau modulasi fungsi beberapa protein.

Salah satu senyawa polifenol yang banyak terdapat pada sayuran yaitu

flavonoid dan asam fenolat. Senyawa asam fenolat (phenolic acids) mendapatkan

perhatian yang lebih dalam beberapa tahun terakhir ini karena pengaruhnya untuk

kesehatan manusia. Sebagai polifenol, asam fenolat merupakan antioksidan yang

sangat kuat dan memiliki aktivitas antibakteri, antivirus, antikarsinogenik,

antiinflamasi, dan aktivitas vasodilatory. Selain itu asam fenolat juga mempunyai

peranan untuk melindungi dari kanker dan penyakit jantung.

Penelitian ini meneliti kandungan asam fenolat (asam klorogenat, asam

kafeat, dan asam ferulat) pada dua puluh empat jenis sayuran indigenous

Indonesia yang berasal dari Jawa Barat yaitu kenikir, kecombrang, kemangi,

katuk, pohpohan, ginseng, takokak, lembayung, terubuk, labu siam, pepaya, mete,

pakis, beluntas, mangkokan putih, mangkokan, kendondong cina, antanan,

antanan beurit, krokot, turi, kelor, dan mengkudu. Bagian tanaman yang

digunakan untuk penelitian ini bisa berupa daun, batang, dan seluruh bagian

tanaman. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu persiapan sampel,

pembuatan kurva standar dan Limit of Detection (LOD), analisis asam fenolat

dengan HPLC, serta analisis statistik. Analisis asam fenolat dengan HPLC

dilakukan secara dua ulangan duplo. Analisis statistik yang digunakan yaitu uji

Tukey pada taraf 5%, uji T pada taraf 1%, dan principal component analysis

(PCA).

Hasil penelitian ini mendapatkan data kisaran asam klorogenat 0.0847.02

mg per 100 gram sampel segar, asam kafeat 0.36 8.65 mg per 100 gram sampel

segar, dan asam ferulat 0.09 5.02 mg per 100 gram sampel segar.

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bandar Lampung pada tanggal 7 April

1987, penulis adalah anak pertama dari Bapak Drs. Nazarudin,

SH dan Sundari. Penulis memiliki dua orang adik perempuan

yaitu Riska Pahyuni dan Ririn Wirdayani. Penulis menempuh

pendidikan sekolah dasar di SD Negeri 1 Bukit, Musi

Banyuasin, Sumatra Selatan pada tahun 1993-1999, pendidikan

lanjutan tingkat pertama di SLTP Negeri 22 Bandar Lampung pada tahun 1999-

2002, dan pendidikan lanjutan tingkat atas di SMU Negeri 2 Bandar Lampung

pada tahun 2002-2005.

Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur SPMB pada

tahun 2005. Penulis diterima di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB pada

tahun 2006 setelah melalui satu tahun TPB (Tahap Persiapan Bersama). Selama

menjadi mahasiswa di IPB (Institut Pertanian Bogor). Penulis aktif di berbagai

kegiatan baik kegiatan akademik maupun kegiatan ektrakurikuler.

Pada bidang akademik, penulis aktif dalam mengikuti berbagai lomba baik

nasional maupun internasional di antaranya juara 3 dunia dalam lomba DSDC

(Developing Solutions for Developing Countries Competition) di Anaheim,

California pada bulan Juni 2009 dan mendapatkan penghargaan dari Menteri

Pertanian RI terkait dengan prestasi internasional (DSDC), juara 1 debat bahasa

Inggris IPB pada tahun 2007 dan 2008, finalis IEC (Innovative Entrepreneur

Challenge) pada tahun 2008, mendapatkan pendanaan dari DIKTI dalam lomba

program kreativitas mahasiswa, mendapatkan pendanaan dari IPB dalam program

pengembangan kewirausahaan mahasiswa. Selain lomba penulis juga menjadi

presenter dalam 37th

International Forestry Student Symposium 2009, presenter di

National Students Conference UNIKA Soegijapranata Semarang 2008,

mendapatkan beasiswa PPA pada tahun 2006, menjadi asisten praktikum kimia

dan biokimia pangan, menjadi asisten praktikum teknologi pengolahan pangan.

Penulis pernah mengikuti training ISO 9001:2000, ISO 22000:2005, dan Sitem

Manajemen Halal, terlibat dalam The International Technical Forum for

Cooperation and Exchange between Korea and Indonesia pada tahun 2009,

penulis juga aktif dalam mengikuti seminar-seminar yang terkait dengan teknologi

pangan maupun kewirausahaan, di antaranya yaitu International Nano Food

Science Technology Conference di Anaheim, California pada tahun 2009, seminar

Wirausaha Muda Mandiri 2009, dan seminar Nasional Ketahanan Pangan Bangsa.

Pada bidang ekstrakurikuler penulis merupakan anggota dari IFT (Institute

of Food Technologist), HMPPI (Himpunan Mahasiswa Peduli Pangan Indonesia),

HIMITEPA (Himpunan Mahasiswa Teknologi Pangan), penulis pernah

mengkoordinatori bidang akademik dan kerohanian di KEMALA (Kesatuan

Mahasiswa Lampung) pada periode tahun 2005-2006. Penulis juga pernah

menjadi ketua FCC (Food Chat Club) pada periode tahun 2008-2009. Penulis

aktif dalam kepanitiaan kegiatan nasional seperti menjadi wakil pada kegiatan the

7th

National Students Paper Competition pada tahun 2008, menjadi PJK pada

kegiatan BAUR 2007, dan menjadi penyuluh dalam kegiatan Penyuluhan

Keamanan Pangan yang diselenggarakan oleh SEAFAST Center IPB. Dalam sela-

sela kesibukan akademik dan penelitian, penulis menyibukkan dirinya dengan

membuka caf bersama teman-temannya, caf tersebut diberi nama FRIENDS 24

CAF yang menjual produk-produk seafood olahan yang siap santap dan siap saji.

Penulis melakukan penelitian dengan judul IDENTIFIKASI

SENYAWA ASAM FENOLAT PADA SAYURAN INDIGENOUS

INDONESIA sebagai syarat untuk meraih gelar sarjana. Penelitian ini

dikerjakan dibawah bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si pada tahun 2010.

KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Alloh Azza wa jalla yang telah memberikan kekuatan

pada penulis sehingga skripsi dengan judul Identifikasi Senyawa Asam Fenolat

Pada Sayuran Indigenous Indonesia dapat diselesaikan. Shalawat serta salam

semoga selalu tercurah kepada baginda Rasululloh Muhammad SAW karena

beliau telah membawa jalan yang terang benderang kepada manusia. Penulisan

skripsi ini tidak terlepas dalam bantuan berbagai pihak, oleh karena itu penulis

ingin menyampaikan terima kasih kepada:

1. Ayah, Ibu, Riska, dan Ririn yang selalu mendoakan, memberikan nasihat,

motivasi, kasih sayang, dan bantuan materil.

2. Ibu Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si selaku dosen pembimbing akademik yang

telah memberikan nasihat, motivasi, dan masukan dalam pembuatan skripsi ini.

3. Dewi Kurniasih, Riska Rudiyanti Dewi selaku teman satu bimbingan yang

selalu memberikan motivasi, masukan, dan doa. Terima kasih atas

kebersamaannya dalam menggapai cita-cita.

4. Teman-teman Friends 24 Cafe (Fahmi, Tiwi, Dilla, Widi, dan Widya).

5. Teman-teman kosan (Dimas, Erwin, Muji, Sobur, Deni, Tri Erza, dan Sigit).

6. Seluruh teman-teman ITP 42 yang telah bersama baik dalam keadaan senang

maupun duka selama lebih kurang tiga tahun.

7. Abah, mba Irin, mba Ria, dan kak Marto yang telah membantu penulis di

Laboratorium SEAFAST Center IPB.

Penulis menyadari skripsi ini tidak lepas dari kesalahan. Oleh karena itu

penulis minta maaf dan dengan senang hati menerima kritik dan saran dari

berbagai pihak. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat untuk

kehidupan manusia.

Bogor, Januari 2010

Penulis

i

ii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR. ........................................................................................ i

DAFTAR ISI. ...................................................................................................... ii

DAFTAR TABEL. .............................................................................................. iv

DAFTAR GAMBAR. ......................................................................................... vi

DAFTAR LAMPIRAN. ..................................................................................... ix

I. PENDAHULUAN. ....................................................................................... 1

A. LATAR BELAKANG. .............................................................................. 1

B. TUJUAN. .................................................................................................. 3

C. MANFAAT. .............................................................................................. 3

II. TINJAUAN PUSTAKA. .............................................................................. 4

A. SAYURAN INDIGENOUS. ...................................................................... 4

B. ASAM FENOLAT (PHENOLIC ACID). .................................................. 6

C. IDENTIFIKASI SENYAWA ASAM FENOLAT. ................................... 13

III. BAHAN DAN METODE. ............................................................................ 16

A. BAHAN DAN ALAT. .............................................................................. 16

1. Bahan. ................................................................................................... 16

2. Alat. ...................................................................................................... 18

B. METODE. ................................................................................................. 18

1. Persiapan Sampel. ................................................................................. 18

2. Pembuatan Kurva Standar dan Limit of Detection (LOD). .................. 20

3. Analisis Asam Fenolat pada Sayuran. .................................................. 21

4. Analisis Statistik. .................................................................................. 23

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN. .................................................................... 30

A. KURVA STANDAR ASAM FENOLAT DAN LIMIT DETEKSI. ......... 30

1. Standar Asam Fenolat Bentuk Tunggal. ............................................... 30

2. Limit Deteksi. ....................................................................................... 32

3. Standar Asam Fenolat Bentuk Campuran. ........................................... 34

B. TOTAL FENOL. ....................................................................................... 36

C. ANALISIS ASAM FENOLAT PADA SAYURAN INDIGENOUS. ...... 38

D. REKAPITULASI HASIL DAN SENYAWA YANG

BELUM TERIDENTIFIKASI PADA SAYURAN INDIGENOUS. ....... 96

iii

E. ANALISIS STATISTIK ..........................................................................105

V. KESIMPULAN DAN SARAN. ....................................................................114

A. KESIMPULAN. ...................................................................................... 114

B. SARAN. .................................................................................................. 115

DAFTAR PUSTAKA. ........................................................................................116

LAMPIRAN. .......................................................................................................120

iv

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Kandungan Senyawa Flavonoid Pada Sebelas Sayuran Indigenous

Jawa Barat (mg/100 gam sampel segar). ......................................... 5

Tabel 2. Kandungan Senyawa Flavonoid Pada Tiga Belas Sayuran

Indigenous Jawa Barat (mg/100 gam sampel segar). ....................... 6

Tabel 3. Dua Puluh Empat Jenis Sayuran Indigenous Indonesia. ...................... 17

Tabel 4. Perhitungan LOD Asam Klorogenat. ................................................... 32

Tabel 5. Perhitungan LOD Asam Kafeat. .......................................................... 33

Tabel 6. Perhitungan LOD Asam Ferulat. .......................................................... 33

Tabel 7. Hasil Penginjeksian Standar Asam Fenolat dalam Bentuk Campuran. 35

Tabel 8. Total Fenol Sayuran Indigenous. ......................................................... 37

Tabel 9. Perhitungan Kandungan Asam Fenolat dengan

Kurva Standar Campuran. .................................................................... 39

Tabel 10. Perhitungan Kandungan Asam Fenolat dengan

Eksternal Standar Campuran. ............................................................... 40

Tabel 11. Perbandingan Perhitungan Kandungan Asam Fenolat

antara Kurva Standar Campuran dan Eksternal Standar Campuran. ... 41

Tabel 12. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Mengkudu. ........... 43

Tabel 13. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Mangkokan. ......... 45

Tabel 14. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Labu Siam. . 47

Tabel 15. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Lembayung. 49

Tabel 16. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Katuk. ......... 52

Tabel 17. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Kemangi. .... 54

Tabel 18. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Pakis. .......... 56

Tabel 19. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Pohpohan. ... 59

Tabel 20. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Bunga Pepaya. ..... 61

Tabel 21. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Mangkokan Putih. 63

Tabel 22. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Kenikir. ................ 65

Tabel 23. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Kelor........... 67

Tabel 24. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Kucai. ......... 70

Tabel 25. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak

Daun Jambu Mete. ............................................................................... 72

v

Tabel 26. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Buah Takokak. ...... 74

Tabel 27. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Antanan. ................ 77

Tabel 28. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Krokot. .................. 79

Tabel 29. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Antanan Beurit. ..... 81

Tabel 30. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Ginseng. ...... 83

Tabel 31. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak

Bunga Kecombrang. .............................................................................. 85

Tabel 32. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Beluntas. ...... 88

Tabel 33. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Bunga Turi. ........... 90

Tabel 34. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Terubuk. ................ 92

Tabel 35. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Kedondong Cina. .. 95

Tabel 36. Kandungan Asam Fenolat Pada Dua Puluh Empat Jenis

Sayuran Indigenous Segar. .................................................................. 97

Tabel 37. Kandungan Asam Fenolat pada Dua Puluh Empat Jenis

Sayuran Indigenous Berdasarkan Bagian yang diteliti. ........................ 98

Tabel 38. Rekapitulasi Kadar Air, Total Fenol, dan Asam Fenolat

Sayuran Indigenous. ............................................................................ 101

Tabel 39. Rekapitulasi Komponen yang Terdeteksi Pada Sampel

Sayuran Indigenous Menggunakan HPLC. ........................................ 103

Tabel 40. Rekapitulasi Area Unknown pada Waktu Retensi Tertentu. .............. 104

Tabel 41. Uji T pada Perhitungan Kandungan Asam Fenolat antara

Kurva Standar Campuran dan Eksternal Standar Campuran. ............. 105

Tabel 42. Akar Ciri (Eigen Value), Proporsi, dan Kumulatif Keragaman

dari Sembilan Variabel. .......................................................................107

Tabel 43. Matriks Korelasi Sembilan Variabel. .................................................. 108

Tabel 44. Nilai-Nilai Vektor dari Hubungan antara Masing-Masing

Variabel dengan Komponen Utama. .................................................. 108

Tabel 45. Akar Ciri, Proporsi, dan Kumulatif Tiga Variabel...............................110

Tabel 46. Matriks Korelasi Total Fenol, Total Flavonoid, dan Total

Asam Fenolat. ......................................................................................111

Tabel 47. Nilai-Nilai Vektor dari Hubungan antara Masing-Masing

Variabel dengan Komponen Utama. ................................................... 111

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur Kimia : (a) turunan asam benzoat (b) turunan asam. ........ 7

Gambar 2. Jalur Shikimate . ............................................................................... 9

Gambar 3. Biosintesis Hidroksibenzoat, Hidroksinamat, dan Flavonoid. .......... 11

Gambar 4. Biosintesis Asam Klorogenat. ........................................................... 12

Gambar 5. Persiapan Sampel. ............................................................................. 24

Gambar 6. Prosedur Analisis Total Fenol. .......................................................... 25

Gambar 7. Metode Ekstraksi Asam Fenolat dari Sayuran Indigenous. .............. 26

Gambar 8. Metode Hidrolisis Basa. ................................................................... 27

Gambar 9. Metode Hidrolisis Asam. .................................................................. 28

Gambar 10. Metode Pembuatan Standar Asam Fenolat. ...................................... 29

Gambar 11. Kromatogram Standar Asam Klorogenat dengan Analisis HPLC. ... 30

Gambar 12. Kromatogram Standar Asam Kafeat dengan Analisis HPLC. ......... 31

Gambar 13. Kromatogram Standar Asam Ferulat dengan Analisis HPLC. .......... 31

Gambar 14. Kromatogram Standar Campuran dengan Analisis HPLC. ............... 35

Gambar 15. Kurva Standar Campuran Asam Klorogenat. .................................... 35

Gambar 16. Kurva Standar Campuran Asam Kafeat. ........................................... 36

Gambar 17. Kurva Standar Campuran Asam Ferulat ........................................... 36

Gambar 18. Kromatogram Ekstrak Mengkudu dengan Analisis HPLC. .............. 43

Gambar 19. Ko-kromatogram Ekstrak Mengkudu dengan Standar Campuran. ... 43

Gambar 20. Kromatogram Ekstrak Mangkokan dengan Analisis HPLC. ............ 45

Gambar 21. Ko-kromatogram Ekstrak Mangkokan dengan Standar Campuran. . 45

Gambar 22. Kromatogram Ekstrak Daun Labu Siam dengan Analisis HPLC. .... 47

Gambar 23. Ko-kromatogram Ekstrak Daun Labu Siam dengan

Standar Campuran. ............................................................................ 47

Gambar 24. Kromatogram Ekstrak Daun Lembayung dengan Analisis HPLC... 49

Gambar 25. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Lembayung dengan

Standar Campuran. ........................................................................... 49

Gambar 26. Kromatogram Ekstrak Daun Katuk dengan Analisis HPLC. ........... 52

Gambar 27. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Katuk dengan


vii

Gambar 28. Kromatogram Ekstrak Daun Kemangi dengan Analisis HPLC. ...... 54

Gambar 29. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Kemangi dengan


Gambar 30. Kromatogram Ekstrak Daun Pakis dengan Analisis HPLC. ............ 56

Gambar 31. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Pakis dengan Standar Campuran. 56

Gambar 32. Kromatogram Ekstrak Daun Pohpohan dengan Analisis HPLC. ..... 59

Gambar 33. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Pohpohan dengan


Gambar 34. Kromatogram Ekstrak Bunga Pepaya dengan Analisis HPLC. ....... 61

Gambar 35. Ko-Kromatogram Ekstrak Bunga Pepaya dengan


Gambar 36. Kromatogram Ekstrak Mangkokan Putih dengan Analisis HPLC. .. 63

Gambar 37. Ko-Kromatogram Ekstrak Mangkokan Putih dengan

Standar Campuran. ............................................................................ 63

Gambar 38. Kromatogram Ekstrak Kenikir dengan Analisis HPLC. .................. 65

Gambar 39. Ko-Kromatogram Ekstrak Kenikir dengan Standar Campuran. ...... 65

Gambar 40. Kromatogram Ekstrak Daun Kelor dengan Analisis HPLC............. 67

Gambar 41. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Kelor dengan


Gambar 42. Kromatogram Ekstrak Daun Kucai dengan Analisis HPLC. ........... 70

Gambar 43. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Kucai dengan Standar Campuran. 70

Gambar 44. Kromatogram Ekstrak Daun Jambu Mete dengan Analisis HPLC. . 72

Gambar 45. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Jambu Mete dengan


Gambar 46. Kromatogram Ekstrak Buah Takokak dengan Analisis HPLC. ....... 74

Gambar 47. Ko-Kromatogram Ekstrak Buah Takokak dengan


Gambar 48. Kromatogram Ekstrak Antanan dengan Analisis HPLC. ................. 77

Gambar 49. Ko-Kromatogram Ekstrak Antanan dengan Standar Campuran. ..... 77

Gambar 50. Kromatogram Ekstrak Krokot dengan Analisis HPLC. ................... 79

Gambar 51. Ko-Kromatogram Ekstrak Krokot dengan Standar Campuran. ....... 79

Gambar 52. Kromatogram Ekstrak Antanan Beurit dengan Analisis HPLC . ..... 81

viii

Gambar 53. Ko-Kromatogram Ekstrak Antanan Beurit dengan


Gambar 54. Kromatogram Ekstrak Daun Ginseng dengan Analisis HPLC. ....... 83

Gambar 55. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Ginseng dengan


Gambar 56. Kromatogram Ekstrak Bunga Kecombrang dengan

Analisis HPLC. ................................................................................ 85

Gambar 57. Ko-Kromatogram Ekstrak Bunga Kecombrang dengan


Gambar 58. Kromatogram Ekstrak Daun Beluntas dengan Analisis HPLC. ....... 88

Gambar 59. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Beluntas dengan


Gambar 60. Kromatogram Ekstrak Bunga Turi dengan Analisis HPLC. ............ 90

Gambar 61. Ko-Kromatogram Ekstrak Bunga Turi dengan Standar Campuran. 90

Gambar 62. Kromatogram Ekstrak Terubuk dengan Analisis HPLC. ................. 92

Gambar 63. Ko-Kromatogram Ekstrak Terubuk dengan Standar Campuran. ..... 92

Gambar 64. Kromatogram Ekstrak Kedondong Cina dengan Analisis HPLC. ... 95

Gambar 65. Ko-Kromatogram Ekstrak Kedondong Cina dengan


Gambar 66. Biplot Hubungan Total Fenol, Asam Klorogenat, Asam Kafeat,

Asam Ferulat, Myricetin, Luteolin, Quercetin, Apigenin,

dan Kaempferol. ............................................................................ 109

Gambar 67. Biplot Hubungan Antara Total Fenol, Total Asam Fenolat,

dan Total Flavonoid. .......................................................................112

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar Dua Puluh Empat Sayuran Indigenous Indonesia. ........ 120

Lampiran 2. Uji Tukeys Kadar Air Sayuran Indigenous Indonesia. ..............122

Lampiran 3. Uji Tukeys Total Fenol Sayuran Indigenous Indonesia. ............124

Lampiran 4. Uji Tukeys Asam Fenolat Pada Sayuran Indigenous

Indonesia......................................................................................126

Lampiran 5. Uji Tukeys Asam Klorogenat Sayuran Indigenous Indonesia. ..128

Lampiran 6. Uji Tukeys Asam Kafeat Sayuran Indigenous Indonesia. .........130

Lampiran 7. Uji Tukey Asam Ferulat Sayuran Indigenous Indonesia. ............132

Lampiran 8. Kadar Air Sayuran Indigenous Indonesia. ...................................134

Lampiran 9. Kadar Air Freeze Drier Sayuran Indigenous Indonesia. .............137

Lampiran 10. Kurva Standar Total Fenol . ........................................................140

Lampiran 11. Total Fenol Sayuran Indigenous Indonesia. ................................141

Lampiran 12. Asam Klorogenat Sayuran Indigenous dengan

Perhitungan Kurva Standar Campuran. ......................................147

Lampiran 13. Asam Kafeat Sayuran Indigenous dengan


Lampiran 14. Asam Ferulat Sayuran Indigenous dengan


Lampiran 15. Asam Klorogenat Sayuran Indigenous dengan

Perhitungan Eksternal Standar Campuran. ..................................165

Lampiran 16. Kafeat Acid Sayuran Indigenous dengan


Lampiran 17. Asam Ferulat Sayuran Indigenous dengan


1

I. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Indonesia merupakan negara yang kaya sumber daya alam baik hasil

perikanan, pertanian, maupun perkebunan. Tanaman sayuran di Indonesia

sangat banyak dan bervariasi. Akan tetapi masih banyak dari sayuran tersebut

yang belum dimanfaatkan dan diidentifikasi secara ilmiah kandungan senyawa

yang bermanfaat untuk kesehatan tubuh manusia. Pemanfaatannya masih

terbatas hanya sebagai lalapan maupun campuran gulai. Sayuran sangat

diperlukan oleh tubuh untuk memenuhi asupan vitamin, mineral, dan serat

seseorang setiap harinya.

Jawa Barat merupakan salah satu provinsi penghasil sayur-sayuran yang

memiliki peran cukup signifikan dalam menghasilkan jenis sayur-sayuran di

Indonesia. Spesies sayuran asli Indonesia yang berasal dari

daerah/wilayah/ekosistem tertentu, termasuk spesies pendatang dari wilayah

geografis lain tetapi telah berevolusi dengan iklim dan geografis wilayah

Indonesia dinamakan sayuran indigenous (Anonim, 2007). Beberapa balai

penelitian seperti Balai Penelitian Tanaman Sayuran (Balitsa) bekerjasama

dengan Asian Vegetables Research Development Center (AVRDC) telah

melakukan pendataan terhadap sayuran ini terutama yang mempunyai

kandungan gizi dan non gizi yang bermanfaat secara fisiologis bagi tubuh

manusia yaitu vitamin A, zat besi, dan antioksidan.

Antioksidan merupakan senyawa yang sangat baik untuk menangkap

radikal bebas. Keberadaan senyawa antioksidan ini akan mencegah penyakit

kanker maupun penyakit degeneratif lainnya. Salah satu senyawa antioksidan

yang penting yaitu senyawa polifenol. Senyawa polifenol yang ada pada

sayuran, buah-buahan, dan teh dapat mencegah penyakit degeneratif termasuk

kanker melalui aktivitas antioksidatif dan/atau modulasi fungsi beberapa

protein. Contohnya konsumsi senyawa polifenol dapat mereduksi kematian

akibat penyakit jantung koroner (Hertog, 1995) dengan cara menekan oksidasi

lipoprotein berat jenis rendah (Meyer, 1998). Polifenol menunjukkan sifat

antagonis dengan reseptor karsinogenesis seperti faktor pertumbuhan

2

asepidermal (Agullo, 1997), dan reseptor arylhidrokarbon (Ashida et al., 2000).

Polifenol mengatur sekresi senyawa sitokin, meregulasi siklus sel (Frey et al.,

2001) dan ekspresi protein kinase dalam proliferasi sel tumor (Kobuchi et al.,

1999). Senyawa polifenol juga menginduksi ekspresi enzim antikarsinogenik

(Williamson et al., 1996). Dalam percobaan pada hewan, konsumsi senyawa

polifenol dapat menekan karsinogenesis dari beberapa karsinogen (Yang et al.,

2001). Kemampuan yang dimiliki oleh polifenol untuk menangkap radikal

bebas serta memiliki aktivitas antioksidan mempunyai peranan yang penting

untuk melindungi sel dan jaringan dari stres oksidatif dan efek biologis lain

yang berhubungan dengan penyakit kronis (Rimbach et al., 2005). Senyawa

polifenol dapat menekan efek di dalam usus. seperti efek dalam mengikat besi,

menangkap nitrogen reaktif, klorin, dan spesies oksigen, serta menghambat

cyclooxygenases dan lipoxygenases (Halliwell et al., 2005).

Salah satu senyawa polifenol yang banyak terdapat di sayuran yaitu

flavonoid dan asam fenolat. Batari (2007) telah melakukan penelitian terhadap

sebelas jenis sayuran indigenous Jawa Barat yaitu kenikir, beluntas,

mangkokan, kemangi, pohpohan, katuk, antanan, ginseng, kecombrang,

kedondong cina, dan krokot mengenai kandungan senyawa flavonoid (Flavonol

dan Flavone) pada sayuran tersebut. Selain itu Rahmat (2009) juga telah

melakukan penelitian mengenai kandungan senyawa flavonoid (Flavonol dan

Flavone) pada tiga belas jenis sayuran indigenous Jawa Barat yaitu mengkudu,

mangkokan putih, labu siam, lembayung, pakis, pepaya, kelor, kucai, turi,

jambu mete, terubuk, takokak, dan antanan beurit.

Pada penelitian ini dilakukan identifikasi senyawa asam fenolat yang

terdapat pada sayuran indigenous Indonesia yang berasal dari Jawa Barat.

Asam fenolat memiliki dua jenis golongan yaitu golongan asam hidroksinamat

dan golongan asam hidroksibenzoat. Asam fenolat yang dominan terdapat pada

sayuran adalah golongan asam hidroksinamat (Shahidi dan Naczk, 1995).

Bentuk senyawa asam hidroksinamat yang terdapat pada sayuran yaitu asam p-

koumarat, asam ferulat, asam kafeat, dan asam klorogenat. Sedangkan menurut

hasil penelitian Sakakibara et al. (2003) senyawa asam fenolat yang banyak

terdapat pada sayuran yaitu asam ferulat, asam kafeat, dan asam klorogenat.

3

Dengan demikian pada penelitian ini diidentifikasi keberadaan senyawa asam

ferulat, asam kafeat, dan asam klorogenat pada sayuran indigenous Indonesia

yang berasal dari Jawa Barat.

Jenis sayuran yang digunakan pada penelitian ini adalah sayuran lokal

yang banyak dan sering dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia. Bagian

tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian yang sering

dikonsumsi oleh masyarakat. Sayuran yang digunakan dalam penelitian ini

adalah sayuran yang digunakan juga oleh Batari (2007) yaitu kenikir, beluntas,

mangkokan, kemangi, pohpohan, katuk, antanan, ginseng, kecombrang,

kedondong cina, dan krokot maupun yang digunakan oleh Rahmat (2009) yaitu

mengkudu, mangkokan putih, labu siam, lembayung, pakis, pepaya, kelor,

kucai, turi, jambu mete, terubuk, takokak, dan antanan beurit.

B. TUJUAN

Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi kandungan komponen

asam fenolat (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat) pada dua puluh

empat jenis sayuran indigenous Indonesia.

C. MANFAAT

Manfaat penelitian ini adalah mendapatkan data mengenai kandungan

komponen asam fenolat (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat) pada

dua puluh empat jenis sayuran indigenous Indonesia sehingga dapat

dimanfaatkan lebih lanjut.

4

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. SAYURAN INDIGENOUS

Sayuran indigenous Indonesia adalah spesies sayuran asli Indonesia yang

berasal dari daerah/wilayah/ekosistem tertentu, termasuk spesies pendatang

dari wilayah geografis lain tetapi telah berevolusi dengan iklim dan geografis

wilayah Indonesia (Anonim, 2007). Sayuran ini biasa digunakan oleh

masyarakat sebagai lalapan, campuran gulai, maupun obat.

Perkembangan budaya dan teknologi menyebabkan perkembangan

sayuran indigenous menjadi terdesak, maka potensi sayuran ini harus digali

dan dikaji kembali untuk mendapatkan manfaat yang lebih baik dalam

meningkatkan gizi keluarga. Pada penelitian ini diidentifikasi kandungan asam

fenolat dari sayuran indigenous tersebut. Sayur yang digunakan adalah sayur-

sayuran yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat dan banyak tumbuh di

Indonesia yang berasal dari provinsi Jawa Barat. Bagian dari sayur-sayuran

indigenous yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian yang biasa

dikonsumsi (dapat berupa batang, daun, bunga atau seluruh bagian tanaman).

Sayuran tersebut diantaranya adalah Kenikir (Cosmos caudatus H.B.K),

beluntas (Pluchea indica (L.) Less.), mangkokan putih (Nothopanax

scutellarium (Burm.f.) Fosb.), mangkokan (Nothopanax scutellarius (Burm.f.)

Merr.), kendondong cina (Polyscias pinnata), kecombrang (Etlingera elatior

(Jack) R.M.Sm.), kemangi (Ocimum americanum L.), katuk (Sauropus

androgynus (L.) Merr.), antanan (Centelia asiatica (L.) Urb.), antanan beurit

(Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.), pohpohan (Pilea melastomoides (Poir.)

Bl.), ginseng (Talinum triangulare (Jacq.) Willd.), krokot (Portulaca oleracea

L.), turi (Sesbania grandiflora (L.) Pers.), kucai (Allium schoenoprasum L.),

takokak (Solanum torvum Swartz), kelor (Moringa pterygosperma Gaertn.),

mengkudu (Morinda citrifolia L.), lembayung (Vigna unguiculata (L.) Walp.),

terubuk (Saccharum edule Hassk.), labu siam (Sechium edule (Jacq.) Swartz.),

pepaya (Carica papaya L.), jambu mete (Anacardium occidentale L.), dan

pakis (Arcypteris irregularis (C.Presl) Ching.).

5

Batari (2007) telah melakukan penelitian terhadap sebelas sayuran

indigenous Indonesia yaitu kenikir, beluntas, mangkokan, kemangi, pohpohan,

katuk, antanan, ginseng, kecombrang, kedondong cina, dan krokot. Penelitian

Batari (2007) menunjukkan bahwa kesebelas sayuran indigenous Jawa Barat

tersebut mengandung senyawa flavonoid (flavonol dan flavones), lihat Tabel 1.

Rahmat (2009) telah melakukan penelitian yang serupa pada tiga belas sayuran

indigenous Jawa Barat yaitu mengkudu, mangkokan putih, labu siam,

lembayung, pakis, pepaya, kelor, kucai, turi, jambu mete, terubuk, takokak, dan

antanan beurit. Penelitian Rahmat (2009) menunjukkan bahwa ketiga belas

sayuran indigenous Jawa Barat tersebut mengandung senyawa flavonoid

(flavonol dan flavone), lihat Tabel 2. Senyawa flavonoid adalah salah satu

antioksidan yang penting bagi tubuh manusia untuk menjaga kesehatan.

Sayuran indigenous di atas mengandung senyawa flavonoid (antioksidan)

sehingga baik untuk menjaga kesehatan tubuh manusia.

Sampel

Flavonoid (mg/100 gram sampel segar) Total Fenol

(mg/100 gram

sampel segar) Flavonol Flavon

Myricetin Quercetin Kaempferol Luteolin Apigenin

Kenikir - 51.28 0.90 - - 150.01

Beluntas 0.90 5.21 0.28 - - 83.12

Mangkokan - 3.69 1.74 - - 94.30

Kecombrang - 1.18 - - - 80.61

Kemangi - 1.89 2.47 2.12 0.74 81.18

Katuk - 4.50 138.14 - - 149.32

Kedondong Cina - 28.48 23.71 - - 79.06

Antanan 0.13 12.31 8.57 - - 46.32

Pohpohan - 1.76 0.25 0.33 - 70.11

Daun ginseng - 0.41 3.52 - - 48.91

Krokot - 0.30 - - - 33.46

Tabel 1. Kandungan Senyawa Flavonoid pada Sebelas Sayuran Indigenous

Jawa Barat (mg/100 gram sampel segar)

Ket :

- : Tidak terdeteksi Sumber : Batari (2007)

6

B. ASAM FENOLAT (PHENOLIC ACID)

Senyawa asam fenolat mendapatkan perhatian yang lebih dalam beberapa

tahun terakhir ini karena pengaruhnya terhadap kesehatan manusia. Sebagai

polifenol, asam fenolat merupakan antioksidan yang sangat kuat dan memiliki

aktivitas antibakteri, antivirus, antikarsinogenik, antiinflamasi, dan aktivitas

vasodilatory (Duthie et al., 2000). Selain itu asam fenolat juga mempunyai

peranan untuk melindungi dari kanker dan penyakit jantung (Manach, 2004).

Asam fenolat merupakan metabolit sekunder yang sering ditemukan pada

tanaman. Senyawa asam fenolat mempunyai peranan yang penting pada

tumbuhan yaitu sebagai bahan pendukung dinding sel (Wallace dan Fry, 1994).

Asam fenolat membentuk bagian integral pada struktur dinding sel, umumnya

dalam bentuk bahan polymeric seperti lignin, membantu proses mekanik, dan

halangan bagi invasi mikroba. Lignin merupakan senyawa organik yang paling

banyak di bumi setelah selulosa (Wallace dan Fry, 1994). Turunan asam

fenolat terdiri dari dua jenis yaitu asam hidroksibenzoat dan asam

Sampel

Konsentrasi Flavonoid (mg/100 gram sampel segar)

Total Fenol

(mg/100 gram

sampel segar)

Flavonol Flavon

Myricetin Quercetin Kaempferol Luteolin Apigenin

Bunga turi - 2.76 18.47 - - 31.62

Kucai 2.69 4.46 7.65 - - 35.04

Takokak 2.30 0.66 - - - 92.91

Daun kelor - 95.84 20.79 1.32 - 133.59

Pucuk

mengkudu - 23.67 9.75 - - 39.23

Lembayung - 27.35 3.33 - 12.97 49.53

Terubuk - 0.44 - - - 23.73

Mangkokan - 12.67 12.95 - 6.87 74.19

Daun labu

siam 12.49 13.81 9.72 - - 74.27

Bunga papaya - 18.85 5.47 - 11.95 44.47

Pucuk mete 8.28 125.39 9.91 - - 614.72

Pakis - 7.42 2.10 - - 34.57

Antanan beurit 1.57 37.51 10.85 - - 121.06

Tabel 2. Kandungan Senyawa Flavonoid pada Tiga Belas Sayuran

Indigenous Jawa Barat (mg/100 gram sampel segar)

Ket :

- : Tidak terdeteksi Sumber : Rahmat (2009)

7

hidroksinamat. Perbedaan kedua turunan dari senyawa asam fenolat ini terletak

pada pola hidroksilasi dan metoksilasi cincin aromatiknya. Struktur kimia

kedua senyawa tersebut dapat dilihat pada Gambar 1. Aktivitas biologis yang

penting pada senyawa benzoat, klorogenat, kafeat, ferulat, dan asam galat

adalah kemampuan aktivitas sitoprotektifnya dan kemampuan dalam

menghambat karsinogenesis, mutagenesis, dan generasi tumor (Birosova,

2005).

Gambar 1. Struktur Kimia : (a) turunan asam benzoat (b) turunan asam

sinamat (Mattila et al., 2002)

Senyawa asam fenolat pada tumbuhan disintesis oleh tumbuhan melalui

jalur Shikimate (Hkkinen, 2000). Jalur shikimate merupakan hasil dari

biosintesis senyawa chorismate yang dapat berfungsi sebagai prekursor

terbentuknya biosintesis senyawa aromatik asam amino triptofan, fenilalanin,

dan tirosin. Jalur shikimate biasa terdapat pada tumbuhan dan mikroorganisme.

Shikimate disintesis dari substrat fosfoenolpiruvat dan eritrosa 4-fosfat. Kedua

prekursor ini merupakan hasil dari jalur glikolisis dan jalur fosfat pentosa dan

mengalami kondensasi menjadi 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate

(DAHP) oleh enzim DAHP synthase. Tahapan selanjutnya yaitu pembentukan

3-dehydroquinate oleh enzim 3-dehydroquinate synthase, 3-dehydroshikimate

oleh enzim 3-dehydroquinate dehydratase, dan terakhir shikimate oleh enzim

shikimate dehydrogenase. Shikimate kemudian dirubah menjadi shikimate 3-

phosphate oleh enzim shikimate kinase, dan setelah itu menjadi 5-

(a)

(b)

8

enolpyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP) oleh enzim 5-enolpyruvylshikimate

3-phosphate synthase. EPSP kemudian dirubah menjadi chorismate oleh enzim

chorismate synthase. Chorismate adalah cabang untuk membentuk asam amino

aromatik, yaitu triptofan pada bagian yang satu, dan fenilalanin serta tirosin

pada bagian yang lainnya. Jika diperhatikan secara seksama pada bagian akhir

jalur shikimate, biosintesis fenilalanin dan tirosin terdapat pada Gambar 2

karena mereka merupakan prekursor kelas penting yaitu senyawa asam fenolat,

fenilpropanoid, dan beberapa kelas senyawa asam fenolat lainnya. Pada proses

ini membutuhkan perubahan chorismate menjadi prephenate yang dikatalisis

oleh chorismate mutase dan arogenate yang dikatalisis oleh prephenat

aminotransferase. Enzim arogenate dehydratase merubah arogenate menjadi

fenilalanin, sedangkan enzim arogenate dehydrogenase menghasilkan tirosin.

Jalur biosintesis shikimate (Shikimate Pathway) pada tumbuhan dapat dilihat

pada Gambar 2.

Pembentukan asam hidroksinamat (kafeat, ferulat, 5-hydroxyferrulic, dan

asam sinapat) dari asam p-koumarat membutuhkan dua jenis reaksi yaitu

hidroksilasi dan metilasi. Adanya pelekatan Gugus Hidroksil pada asam p-

koumarat akan membentuk asam kafeat (Gambar 3), pembentukan ini

dikatalisis oleh monophenol mono-oxygenases, grup enzim tanaman yang

sudah sangat terkenal (Macheix et al., 1990). Metilasi pada asam kafeat akan

membentuk asam ferulat, yang bersamaan dengan asam p-koumarat,

merupakan prekursor lignin (Gambar 3). Metilasi ini dikatalisis oleh

omethyltransferase (Macheix et al., 1990). Asam kafeat merupakan substrat

untuk 5-hydroxyferrulic acid, yang akan menghasilkan asam sinapat sebagai

hasil dari o-metilasi.

Pembentukan turunan asam hidroksinamat membutuhkan pembentukan

hydroxycinnamte-CoAs, contoh p-coumaroyl-CoA dikatalisis oleh

hydroxycinnamoyl-CoA ligase atau oleh oglycosyl transferase.

hydroxycinnamate-CoAs masuk kedalam berbagai macam reaksi

phenylpropanoid. (Gambar 3), seperti kondensasi dengan malonyl-CoA

membentuk flavonoid atau reduksi NADPH-dependent membentuk lignin.

Selain itu hydroxycinnamate-CoAs dapat berkonjugasi dengan asam organik

9

(Strack, 1997). Di biosintesis turunan gula asam hidroksinamat, transfer

glukosa dari uridine diphosphoglucose menjadi asam hidroksinamat dikatalisis

oleh glucosyl transferase (Strack, 1997).

Gambar 2. Jalur shikimate (Vermerris dan Nicholson, 2006)

Ket:

Enzim yang terlibat dalam jalur shikimate yaitu: (a) DAHP synthase (E.C. 2.5.1.54), (b) 3-dehydroquinate synthase (E.C. 4.2.3.4), (c) 3-dehydroquinate dehydratase (E.C. 4.2.1.10), (d) shikimate dehydrogenase (E.C. 1.1.1.25), (e) shikimate kinase (E.C 2.7.1.71), (f) 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (E.C. 2.5.1.19), (g) chorismate synthase (E.C. 4.2.3.5), (h) chorismate mutase (E.C. 5.4.99.5), (i) prephenate aminotransferase (E.C. 2.6.1.78 and E.C. 2.6.1.79), (j) arogenate dehydratase (E.C. 4.2.1.91), dan (k) arogenate dehydrogenase (E.C. 1.3.1.43, E.C. 1.3.1.78, E.C. 1.3.1.79).

10

Banyak jalur untuk biosintesis asam hidroksibenzoat pada tanaman, jalur

pembentukan ini tergantung dari jenis tanamannya. Asam hidroksibenzoat

dapat dibentuk dari jalur shikimate (Gambar 3), terutama dari dehydroshikimic

acid. Reaksi ini merupakan reaksi utama untuk pembentukan gallic acid

(Haddock et al., 1982). Selain itu asam hidroksibenzoat juga dapat dibentuk

melalui degradasi asam hidroksinamat, sama seperti proses oksidasi pada

asam lemak, senyawa antaranya yaitu cinnamoyl-CoA esters (Macheix et al.,

1990) (Gambar 3). Asam hidroksibenzoat dapat juga dibentuk melalui

degradasi senyawa flavonoid (Strack, 1997). Penjelasan lebih detail mengenai

proses pembentukan hidroksibenzoat, hidroksinamat, dan flavonoid melalui

jalur shikimate dapat dilihat pada Gambar 3. Senyawa asam klorogenat

merupakan senyawa ester dari gabungan senyawa asam kafeat dan senyawa

quinic acids. Secara ringkas pembentukan asam klorogenat dapat dilihat pada

Gambar 4.

Asam hidroksibenzoat pada tumbuhan biasanya terdapat dalam bentuk

terikat. Asam hidroksibenzoat merupakan komponen struktur kompleks seperti

lignin dan tannin yang dapat dihidrolisis (Shahidi et al., 1995). Asam

hidroksibenzoat juga ditemukan dalam bentuk asam organik dan turunan gula

(Schuster dan Herrmann, 1985). Secara umum kandungan asam

hidroksibenzoat di dalam tumbuhan rendah kecuali blackberry, raspberry

(Morsel dan Herrmann, 1974), black currant, red currant (Stohr dan

Herrmann, 1975a), dan strawberry (Stohr dan Herrmann, 1975b). Senyawa

hidroksibenzoat banyak terdapat pada sayuran seperti bawang (Schmidtlein dan

Herrmann, 1975a) dan horseradish (Schmidtlein dan Herrmann, 1975b),

dengan komponen asam hidroksibenzoat yang dominan yaitu senyawa

protocatechuic, p-hydroxybenzoic, dan gallic acid.

Asam hidroksinamat banyak terdapat di dalam bahan pangan yang

berasal dari tumbuh-tumbuhan. Asam hidroksinamat biasanya terdapat dalam

bentuk terikat dan jarang ditemukan dalam bentuk bebasnya. Proses

pengolahan buah dan sayuran dengan (Azar et al., 1987), sterilisasi (Rivas dan

Luh, 1968) dan fermentasi dalam pembuatan anggur (Singleton, 1980)

berkontribusi dalam pembentukan asam hidroksinamat bebas di dalam produk.

11

Keterangan:

: Reaksi yang dikatalisis oleh satu jenis enzim

: Reaksi yang dikatalisis oleh lebih dari satu jenis enzim

CA4H : cinnamic acid 4-hydroxylase

CHS : chalcone synthase

4CL : 4-coumarate: coenzyme a ligase

PAL : phenylalanine ammonialyase

Gambar 3. Biosintesis hidroksibenzoat, hidroksinamat, dan flavonoid (Hkkinen,

2000)

12

Gambar 4. Biosintesis asam klorogenat (Cadenas dan Packer, 2002)

Senyawa asam kafeat merupakan asam hidroksinamat yang banyak

ditemukan pada buah-buahan. Asam kafeat banyak ditemukan pada plums,

apel, apricots, blueberries, dan tomat dengan kandungan asam kafeat lebih dari

75 %. Senyawa asam p-koumarat merupakan senyawa asam hidroksinamat

yang banyak terdapat pada buah sitrus dan nanas (Macheix et al., 1989).

Mattila dan Hellstrm (2007) menambahkan bahwa senyawa asam

hidroksinamat yang banyak ditemukan yaitu kafeat, p-koumarat, dan asam

ferulat, biasanya terdapat di bahan pangan dalam bentuk ester sederhana

dengan quinic acid atau glukosa. Bentuk terikat dari senyawa asam

hidroksinamat ditemukan dalam bentuk ester asam hidroksinamat yaitu quinic,

13

shikimic, tartaric acids, dan senyawa turunan gulanya. Mattila dan Hellstrm

(2007) menambahkan bahwa asam hidroksinamat yang terkenal dalam bentuk

terikat yaitu asam klorogenat yang merupakan gabungan dari asam kafeat dan

quinic acids. Sedangkan menurut hasil penelitian (Sakakibara et al., 2003)

senyawa asam fenolat yang banyak terdapat pada sayuran yaitu asam ferulat,

asam kafeat, dan asam klorogenat.

C. IDENTIFIKASI SENYAWA ASAM FENOLAT

Analisis kimia dengan metode kromatografi didasarkan pada pemisahan

komponen yang terpartisi diantara dua fase dalam suatu kesetimbangan

dinamis dan mengalir. Proses ini dilakukan dengan menggerakkan suatu fase

secara mekanis (fase gerak), relatif terhadap fase lainnya.

Secara teori pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh

jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya, sehingga

memastikan kesetimbangan yang baik antar fase. Persyaratan kedua agar

pemisahan baik adalah fase gerak harus bergerak dengan cepat sehingga difusi

sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, pada

sebagian besar sistem kromatografi digunakan penjerap atau penyangga berupa

serbuk halus. Untuk memaksa fase gerak bergerak lebih cepat melalui fase

diam yang terbagi pada serbuk halus harus digunakan tekanan tinggi. Dengan

dipenuhinya kedua persayaratan tersebut, diperoleh teknik kromatografi cair

yang paling kuat yakni HPLC (High Performance Liquid Chromatography).

Jadi pada HPLC fase gerak dialirkan dengan cepat dan hasilnya dideteksi

dengan instrumen.

Komponen utama dari sistem HPLC adalah pompa (tekanan tetap dan

volume tetap), penginjeksi, kolom (ekternal dan internal), detektor, dan

rekorder atau sistem data yang terintegrasi (Rounds dan Gregor, 2003).

Parameter-parameter yang akan mempengaruhi sistem kerja pada HPLC antara

lain diameter dari kolom HPLC, ukuran partikel, ukuran lubang pada fase

diam, dan tekanan pompa.

Terdapat lima tipe HPLC yaitu normal phase chromatography, reversed

phase chromatography, ion-exchange chromatography, size-exclusion

14

chromatography, dan affinity chromatography (Rounds dan Gregor, 2003).

Pada penelitian ini, tipe HPLC yang digunakan adalah reversed phase

chromatography (RP-HPLC). Fase diam dari HPLC jenis ini adalah senyawa

nonpolar, sedangkan fase geraknya polar. Karena hal tersebutlah maka

komponen yang akan keluar dahulu adalah komponen yang polar dibandingkan

yang nonpolar.

Lebih dari 70% teknik pemisahan dengan metode HPLC menggunakan

tipe reversed phase. Beberapa contoh teknik pemisahan yang menggunakan

metode RP-HPLC adalah analisis protein dari tanaman, protein dari biji-bijian,

analisis vitamin larut air dan larut lemak, pemisahan karbohidrat, dan

penentuan unsur-unsur pokok dari minuman ringan. reversed phase HPLC

dengan metode deteksi yang sangat bervariasi, digunakan untuk menganalisis

lemak (Rounds dan Gregor, 2003).

Antioksidan, seperti butylated hydroxylanisole (BHA) dan butylated

hydroxytoluene (BHT), dapat diekstrak dari bahan pangan kering dan dianalisis

dengan menggunakan detektor UV dan fluoresens secara bersamaan. Bahan

pangan basah, pigmen (seperti klorofil, karotenoid, dan antosianin), dan

komponen Asam Fenolat (seperti vanili) dapat pula dianalisis dengan

menggunakan metode RP-HPLC (Rounds dan Gregor, 2003).

Kolom reversed phase chromatography lebih sulit untuk rusak

dibandingkan dengan kolom silika normal. Hal ini dikarenakan kolom RP-

HPLC terdiri atas alkil turunan silika dan tidak pernah digunakan dengan

larutan basa (karena larutan basa akan menghancurkan ikatan silika). Kolom

RP-HPLC dapat digunakan dengan larutan asam tetapi tidak boleh kontak

terlalu lama karena asam dapat menimbulkan korosi pada logam yang ada

dalam peralatan HPLC. Kandungan logam pada kolom HPLC harus dijaga agar

tetap rendah supaya dapat memberikan hasil terbaik pada pemisahan

komponen. Salah satu cara untuk mengetahui kandungan logam di dalam

kolom HPLC adalah dengan menginjeksikan campuran dari 2,2- dan 4,4-

bipiridin. Bila terdapat ion logam di permukaan silika, maka senyawa 2,2-

bipiridin akan mengkelat logam tersebut dan peak dari senyawa yang akan

15

diidentifikasi menjadi tidak teratur sehingga dapat memberikan hasil yang

tidak sesuai.

Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendeteksi komponen fenolik

dalam bahan pangan dengan metode HPLC. Komponen fenolik merupakan

senyawa aromatik, oleh karena itu, senyawa tersebut akan memberikan

penyerapan yang baik pada panjang gelombang sinar UV. Asam fenolat

merupakan bagian dari senyawa fenolik. Panjang gelombang yang digunakan

untuk menentukan komponen asam fenolat yaitu 290 nm untuk asam kafeat,

asam ferulat, dan asam klorogenat. (Singh et al., 2008). Fase gerak yang

digunakan dalam identifikasi senyawa asam fenolat dengan HPLC adalah

metanol-0.4% asam asetat (80:20, v/v) (Singh et al., 2008).

Pemisahan senyawa asam fenolat dilakukan menggunakan kolom RP C-

18 (4.6 x 150 mm, 5m) dengan kolom guard C-18. Fase gerak yang

digunakan yaitu metanol-0.4% asam asetat (80:20, v/v), laju alir 1 mL/menit,

panjang gelombang 290 nm, dan kondisi isokratik (Singh et al., 2008).

Keuntungan utama dari HPLC adalah kemampuannya untuk menangkap

komponen dengan stabilitas panas yang terbatas ataupun yang bersifat volatil.

HPLC merupakan metode yang sangat sensitif, tepat, selektif, dan memiliki

tingkat otomatisasi yang tinggi, sehingga lebih sederhana dalam

pengoperasiannya. Di samping itu, HPLC banyak digunakan untuk analisis

karena kemudahan injeksi, deteksi, dan pengolahan data serta dapat digunakan

untuk berbagai macam sampel seperti sampel cairan, padatan yang dilarutkan,

maupun sampel yang labil terhadap pemanasan. Modern HPLC telah banyak

diaplikasikan seperti pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan penghitungan

komponen yang bervariasi.

16

III. BAHAN DAN METODE

A. BAHAN DAN ALAT

1. Bahan

Bahan-bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah bahan

untuk membuat larutan standar asam fenolat, bahan untuk membuat ekstrak

sayuran indigenous, dan bahan untuk analisis kimia. Bahan-bahan yang

digunakan dalam pembuatan larutan standar adalah standar asam kafeat

(Sigma-Aldrich), standar asam ferulat (Sigma-Aldrich), dan standar asam

klorogenat (Sigma-Aldrich), water for chromatography (MERCK), dan

methanol HPLC grade (MERCK).

Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan ekstrak sayuran

adalah dua puluh empat jenis sayuran indigenous Indonesia yang berasal

dari provinsi Jawa Barat yaitu kenikir, kecombrang, kemangi, katuk,

pohpohan, ginseng, takokak, lembayung, terubuk, labu siam, pepaya, mete,

pakis, beluntas, mangkokan putih, mangkokan, kendondong cina, antanan,

antanan beurit, krokot, turi, kelor dan mengkudu. Bagian yang digunakan

dalam penelitian ini bisa berupa daun, batang, dan seluruh bagian tanaman,

methanol (MERCK), BHA (Sigma-Aldrich), asam asetat (MERCK), dan

aquadest. Kedua puluh empat jenis sayuran tersebut telah berhasil

diidentifikasi oleh pihak Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat

Penelitian Biologi-LIPI Bogor dengan Kepala Bidang Botani LIPI adalah

Dr. Eko Baroto Walujo, APU. Tabel 3 menunjukkan secara lengkap kedua

puluh empat jenis sayuran indigenous Indonesia yang berasal dari provinsi

Jawa Barat, bagian yang digunakan dalam penelitian, serta daerah tempat

asal sayuran indigenous tersebut diperoleh.

Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis kimia adalah methanol

(MERCK), asam asetat (MERCK), alufo, water for chromatography

(MERCK), folin ciocalteu (MERCK), Na2CO3 (MERCK), aquadest, standar

asam galat (Sigma-Aldrich), dan etanol (MERCK).

17

Tabel 3. Dua Puluh Empat Jenis Sayuran Indigenous Indonesia

Spesies Nama

Indonesia

Bagian yang

digunakan Sumber

Morinda citrifolia L. Mengkudu Daun Muda Kebun Petani

Dramaga

Nothopanax scutellarius (Burm.f.)

Merr. Mangkokan Daun Muda

Kebun Petani

Dramaga

Sechium edule (Jacq.) Swartz. Labu Siam Daun Muda Pasar Bogor

Vigna unguiculata (L.) Walp. Lembayung Daun Muda Pasar Bogor

Sauropus androgynus (L.) Merr. Katuk Daun Muda Pasar Bogor

Ocimum americanum L. Kemangi Daun Muda Pasar Bogor

Arcypteris irregularis (C.Presl)

Ching Pakis Daun Muda Pasar Bogor

Pilea melastomoides Pohpohan Daun Muda Pasar Bogor

Carica papaya L. Pepaya Bunga Pasar Bogor

Nothopanax scutellarium (Burm.f.)

Fosb.

Mangkokan

Putih Daun Muda

Kebun Petani

Dramaga

Cosmos caudatus H.B.K. Kenikir Daun Muda Pasar Bogor

Moringa pterygosperma Gaertn. Kelor Daun Muda Kebun Petani

Dramaga

Allium schoenoprasum L. Kucai Seluruh Bagian Pasar Bogor

Anacardium occidentale L. Jambu Mete Daun Muda Pasar Bogor

Solanum torvum Swartz. Takokak Buah Pasar Bogor

Centelia asiatica (L.) Urb. Antanan Seluruh Bagian Kebun Petani

Dramaga

Portulaca oleracea L. Krokot Daun dan

Batang

Kebun Petani

Dramaga

Hydrocotyle sibthorpioides Lmk. Antanan Beurit Seluruh Bagian Kebun Petani

Dramaga

Talinum triangulare (Jacq.) Willd. Ginseng Daun Muda Pasar Bogor

Etlingera elatior (Jack) R.M.Sm. kecombrang Bunga Pasar Bogor

Pluchea indica (L.) Less. Beluntas Daun Muda Kebun Petani

Dramaga

Sesbania grandiflora (L.) Pers. Turi Bunga Kebun Petani

Dramaga

Saccharum edule Hassk Terubuk Bunga Pasar Bogor

Polyscias pinnata Kedondong

cina Daun Muda

Kebun Petani

Dramaga

18

2. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat untuk

membuat larutan standar, ekstrak sayuran, dan analisis. Pada pembuatan

larutan standar alat-alat yang digunakan adalah labu takar, gelas ukur, pipet

mohr, pipet tetes, neraca analitik, dan spatula. Alat-alat yang digunakan

untuk membuat ekstrak sayuran adalah freezer, blender, freeze dryer, Buchi

Rotavapor, neraca analitik, blender kering, labu takar, gelas piala, gelas

ukur, pipet mohr, pipet tetes, spatula, baskom, botol gelap, ultrasonic

Branson 3510,VELP Scientific vortex, IEC Centra-8 centrifuge, dan pisau.

Pada proses analisis, alat-alat yang digunakan adalah High Performance

Liquid Chromatography (HPLC) UV Vis Hewlet Packard Agilent 1100

series. Kolom HPLC RP C-18 (4.6 x 150 mm, 5m), alat injektor sampel

HPLC, filter syringe 0.45m (PTFE), vial, oven, neraca analitik, desikator,

VELP Scientific vortex, labu takar, gelas piala, tabung reaksi, spatula,

gegep, ultrasonic Branson 3510, Shimadzu UV-2450 UV Vis

spectrophotometer, IEC Centra-8 centrifuge, dan cawan alumunium.

B. METODE

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu persiapan sampel,

pembuatan kurva standar dan Limit of Detection (LOD), analisis asam fenolat

dengan HPLC, serta analisis statistik. Analisis asam fenolat dengan HPLC

dilakukan secara dua ulangan duplo.

1. Persiapan Sampel

Mula-mula sampel dicuci sampai bersih, kemudian ditiriskan.

Selanjutnya sayuran dibekukan dalam freezer selama satu malam untuk

memudahkan proses pengeringan vakum. Waktu pengeringan dengan freeze

dryer dapat berlangsung selama satu sampai dua hari tergantung dari

banyaknya sampel. Setelah sampel kering, dilakukan penghancuran

menggunakan blender kering sampai dihasilkan sampel kering bubuk yang

lolos ayakan 32 mesh. Sampel tersebut kemudian dikemas dalam plastik

ber-seal dan disimpan dalam freezer. Sampel siap untuk digunakan dalam

19

ekstraksi. Tahap persiapan sampel dapat dilihat pada Gambar 5. Selanjutnya

dilakukan analisis kadar air dan total fenol pada sampel. Analisis kadar air

dilakukan secara satu ulangan duplo sedangkan analisis total fenol

dilakukan secara dua ulangan duplo.

Analisis Kadar Air menggunakan metode yang dikembangkan oleh

AOAC (1984). Penetapan kadar air merupakan cara untuk mengukur

banyaknya air yang terdapat di dalam suatu bahan pangan. Analisis kadar air

dilakukan pada sampel sayuran segar (awal) dan pada sampel sayuran

setelah freeze drying. Penentuan kadar air ini dilakukan dengan metode

pengeringan dengan oven biasa. Prinsip dari metode ini adalah air

dikeluarkan dari sampel dengan cara menguapkan air yang terdapat dalam

bahan pangan.

Persiapan yang perlu dilakukan adalah cawan alumunium yang akan

digunakan terlebih dahulu dikeringkan dalam oven pada suhu 100oC selama

15 menit kemudian didinginkan dalam desikator Selama 10 menit.

Selanjutnya cawan ditimbang dengan menggunakan neraca analitik. Sampel

ditimbang sebanyak kurang lebih 5 gram kemudian dikeringkan dalam oven

selama kurang lebih 6 jam. Setelah itu didinginkan dalam desikator

kemudian ditimbang. Sampel kembali dikeringkan dalam oven selama 30

menit lalu ditimbang kembali. Perlakuan terakhir ini diulangi terus hingga

diperoleh berat kering yang relatif konstan (berat dianggap konstan jika

selisih berat sampel kering yang ditimbang 0,0003 gram).

W = bobot contoh sebelum dikeringkan (g)

W1 = bobot (contoh + cawan) sesudah dikeringkan (g)

W2 = bobot cawan kosong (g)

Analisis Total Fenol menggunkan metode yang dikembangkan oleh

Shetty et al. (1995) yang dikutip oleh Ishartani (2004). Penentuan total fenol

bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fenol pada sampel. Sampel

kering beku bubuk mula-mula diambil sebanyak 50.0 mg dan dilarutkan

Kadar air (%) = W - (W1-W2) x 100%

W

20

dalam 2.5 mL etanol 95%, kemudian divorteks. Setelah itu dilakukan

sentrifuse terhadap campuran tersebut selama 5 menit dengan kecepatan

putaran 358 g. Supernatan diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke

dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 0.50 mL etanol 95%, 2.5 mL

aquadest, dan 2.5 mL reagen folin ciocalteu 50%. Campuran tersebut

didiamkan dahulu selama 5 menit, lalu ditambahkan 0.5 mL Na2CO3 5%

dan divorteks. Setelah itu, sampel disimpan dalam ruang gelap selama satu

jam, lalu dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 725 nm. Prosedur penentuan total fenol dapat dilihat secara

ringkas pada Gambar 6. Standar yang digunakan dalam penentuan total

fenol adalah asam galat yang dibeli dari Sigma-Aldrich. Standar asam galat

dibuat dengan variasi konsentrasi antara 50 250 mg/L.

2. Pembuatan Kurva Standar dan Limit of Detection (LOD)

a. Pembuatan larutan Standar (Mattila dan kumpulainen, 2002)

Sebanyak 24 mg standar yang tersedia dilarutkan dalam 12 mL methanol

62.5%, sehingga diperoleh standar stock dengan konsentrasi 2000

g/mL. selanjutnya diambil 3.125 mL dari standar stock dimasukan ke

dalam labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan methanol 62.5% hingga

volume mencapai 10 mL, sehingga konsentrasi yang diperoleh adalah

625 g/mL. Setelah itu dibuat larutan standar campuran dengan cara

mencampur ketiga standar yang ada. Volume untuk larutan standar yang

dicampur sama besar yaitu 1:1 (v/v). Larutan standar campuran yang

digunakan dalam penelitian ini terdiri atas lima konsentrasi, yaitu 125,

250, 375, 500, dan 625 g/mL. Pembuatan larutan standar campuran

dengan konsentrasi 125, 250, 375, 500, dan 625 g/mL dilakukan dengan

melakukan pengenceran dari larutan standar campuran yang memiliki

konsentrasi 625 g/mL. Proses pembuatan larutan standar yang

dibutuhkan pada penelitian ini dapat dilihat secara ringkas pada Gambar

10.

21

b. Injeksi larutan standar ke kolom HPLC (Singh et al., 2008).

Larutan standar campuran dengan berbagai konsentrasi tersebut

diinjeksikan ke dalam kolom RP C-18 (4.6 x 150 mm, 5m) dengan

kolom guard C-18. Fase gerak yang digunakan yaitu metanol-0.4%

asam asetat (80:20, v/v), laju alir 1 mL/menit, volume yang diinjeksikan

20 l, panjang gelombang 290 nm, dan kondisi isokratik.

c. Pembuatan kurva standar

Hasil dari kromatogram standar campuran pada berbagai konsentrasi

(125, 250, 375, 500, dan 625 g/mL ) kemudian dimasukkan ke dalam

satu grafik. Dari data masing-masing, dibuat persamaan garis untuk

masing-masing standar yang akan digunakan pada perhitungan Limit of

Detection (LOD) masing-masing standar. Persamaan garis tersebut juga

digunakan pada perhitungan komponen asam fenolat yang terdapat di

sampel.

d. Perhitungan limit deteksi (Rounds dan Nielsen, 2000)

Limit of Detection (LOD) atau limit deteksi diperoleh dengan cara

menginjeksikan standar campuran sebanyak sepuluh kali. Konsentrasi

yang digunakan untuk menentukan LOD adalah konsentrasi yang

terendah yaitu 125 g/mL. Setelah diperoleh kesepuluh area tersebut,

dimasukkan kedalam persamaan kurva standar masing-masing, sehingga

diperoleh konsentrasi dan standar deviasinya. Besarnya LOD adalah tiga

kali dari nilai standar deviasi.

3. Analisis Asam Fenolat pada Sayuran

a. Ekstraksi Senyawa Asam Fenolat dari Sayuran Indigenous (Mattila dan Kumpulainen, 2002) dengan modifikasi

Ekstraksi senyawa asam fenolat dari sayuran indigenous Indonesia

melalui tiga tahap yaitu tahap pertama pengekstrakan dengan methanol

62.5%, tahap kedua hidrolisis basa, dan tahap ketiga hidrolisis asam.

Tahap pertama yaitu pelarutan sebanyak 0.5 gram sampel kering beku ke

dalam 7 mL methanol 62,5% yang mengandung 10% asam asetat

(85:15;v/v) dan 2 g/L BHA sebagai antioksidan. Kemudian divortex agar

campuran homogen. Selanjutnya sampel tersebut di ultrasonik selama 30

22

menit. Kemudian volume sampel dibuat menjadi 10 mL dengan cara

menambahkan air destilata (aquadest) ke dalamnya. Setelah itu diambil 1

mL sampel, kemudian disaring dengan penyaring berdiameter 0.45m

filter syringe (PTFE) maka didapatkan asam fenolat yang larut (soluble

phenolic acid) dan sampel tersebut siap untuk diinjeksikan ke dalam

kolom HPLC. Tahap kedua adalah hidrolisis basa, 9 mL sampel sisa

pengekstrakan tahap pertama dilanjutkan dengan proses hidrolisis basa.

Hasil ekstrak sampel dari hidrolisis basa merupakan insoluble phenolic

acid. Selanjutnya hasil ekstrak tersebut diinjeksikan ke kolom HPLC.

Tahap ketiga ialah hidrolisis asam, tahapan ini melanjutkan tahap kedua

yaitu melakukan proses hidrolisis asam pada lapisan aqueous hasil

pengekstrakan dengan tahap kedua. Hasil pengekstrakan tahap ketiga ini

merupakan insoluble phenolic acid yang tahan proses hidrolisis basa.

Setelah itu hasil pengekstrakan diinjeksikan ke kolom HPLC. Hidrolisis

basa dan asam dilakukan karena asam fenolat berada dalam bentuk

terikat, dengan demikian fungsi dari hidrolisis basa dan asam di sini

untuk membebaskan asam fenolat tersebut dari berbagai senyawa lainnya

yang ada di tanaman. Setelah dapat maka sampel siap untuk diinjeksikan

ke kolom HPLC. Pada proses awal pengujian ekstrak sampel sayuran

melalui ketiga tahapan ekstraksi menunjukkan bahwa senyawa asam

fenolat yang diinginkan (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat)

terdapat pada ekstrak sampel yang menggunakan tahapan ekstraksi tahap

pertama tanpa dilanjutkan ke tahap kedua dan ketiga. Oleh karena itu

proses penelitian selanjutnya hanya menggunakan tahapan ekstraksi

tahap pertama saja. Prosedur ekstraksi asam fenolat dari sayuran

indigenous dapat dilihat pada Gambar 7. Adapun prosedur hidrolisis basa

dan hidrolisis asam dapat dilihat pada Gambar 8 dan 9.

. b. Injeksi ekstrak sampel ke kolom HPLC (Singh et al., 2008).

Ekstrak sampel yang telah disaring dengan syringe filter 0.45 m,

diinjeksikan ke dalam kolom RP C-18 (4.6 x 150 mm, 5m) dengan

kolom guard C-18. Fase gerak yang digunakan yaitu metanol-0.4% asam

23

asetat (80:20, v/v), laju alir 1 mL/menit, volume yang diinjeksikan 20 l,

panjang gelombang 290 nm, dan kondisi isokratik.

c. Pembuatan Ko-kromatogram

Pembuatan ko-kromatogram dilakukan dengan cara menginjeksikan

ektrak sampel yang telah ditambahkan standar campuran. Volume

pencampuran yang digunakan yaitu 1:1 (v/v). Konsentrasi standar

campuran yang digunakan adalah konsentrasi tertinggi yaitu 625 g/mL.

Pembuatan ko-kromatogram ini bertujuan memvalidasi keberadaan

senyawa asam fenolat yang diinginkan (asam klorogenat, asam kafeat,

dan asam ferulat) pada sampel. Standar campuran yang digunakan untuk

membuat ko-kromatogram berfungsi sebagai eksternal standar.

d. Identifikasi asam fenolat pada sampel

Hasil dari kromatogram sampel kemudian dibandingkan dengan

kromatogram standar campuran. Penentuan komponen yang terdapat

pada sampel dilihat berdasarkan waktu retensi masing-masing standar.

Dari area yang diperoleh, dihitung konsentrasinya dengan menggunakan

persamaan garis dari kurva standar campuran yang sudah diperoleh.

Selain itu dilakukan pula perhitungan dengan menggunakan eksternal

standar, yaitu dengan membandingkan luas area komponen pada sampel

dengan luas area pada standar campuran. Standar campuran yang

digunakan sebagai eksternal standar adalah standar campuran dengan

konsentrasi yang tertinggi (625 g/mL).

4. Analisis Statistik

Analisis statistik yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari uji

Tukey, uji T, dan Principal Component Analysis (PCA). Uji Tukey

digunakan pada taraf 5% untuk melihat apakah perlakuan yang diberikan

pada sampel berpengaruh nyata atau tidak. Uji T digunakan untuk

membandingkan perhitungan kandungan asam fenolat antara kurva standar

campuran dan eksternal standar campuran pada sampel pada taraf 1%. PCA

(Principal Component Analysis) merupakan metode statistik yang dapat

mengidentifikasi suatu keragaman dinamakan principal component analysis

24

yang dapat menjelaskan jumlah keragaman dari yang terbesar hingga yang

jumlah keragaman terkecil yang tersembunyi. Analisis ini dapat

menjelaskan 75 % - 90 % dari total keragaman dalam data yang mempunyai

25 sampai 30 variabel hanya dengan dua sampai tiga principal component

(Meilgaard et al., 1999).

Gambar 5. Persiapan sampel

Penyimpanan dalam freezer

Sampel kering beku (bubuk)

Sampel

Pencucian

Penghancuran dengan blender kering

Freeze drying selama 48 jam

Sampel kering beku

Pembekuan selama 24 jam

Penirisan

25

Gambar 6. Prosedur analisis total fenol

endapan

50.0 miligram sampel

kering beku (bubuk)

0.5 ml supernatan

supernatan

Pelarutan

Pemusingan selama 5 menit

dengan kecepatan 358 g

2.5 ml

etanol 95%

0.5 ml etanol 95%

2.5 ml Folin

Ciocalteau 50%

2.5 ml aquadest

0.5 ml

Na2CO3 5%

Pencampuran

Pendiaman selama 5 menit

Pencampuran

Penyimpanan dalam ruang

gelap selama 1 jam

Pembacaan absorbansi dengan spektrofotometer

pada panjang gelombang 725 nm

26

Gambar 7. Metode ekstraksi asam fenolat dari sayuran indigenous

9 ml sampel sisanya dilakukan

Hidrolisis basa (Tahap 2)

kemudian hidrolisis asam (Tahap 3)

Ambil 1 ml sampel (Tahap 1)

Soluble Phenolic

Acid

Insoluble

Phenolic Acid

(Pencampuran sampai volume 10 ml)

7 ml Campuran

Metanol 62.5%

(2 g/L BHA 10%

Asam Asetat

(85:15;v/v))

0.5 g sampel

kering beku

Gelas piala

100 ml

Vortex

Ultrasonik 30 menit

Gelas piala

100 ml Aquadest

Saring dengan saringan

berdiameter 0.45m

syringe filter (PTFE)

27

Gambar 8. Metode hidrolisis basa

Ditutup, Stirer (magnetic stirer) selama 16 jam pada suhu ruangan (20 oC)

Pemipetan lapisan organic phase (supernatan)

12 ml Air destilata

(1% Asam

Askorbat dan

0.415% EDTA) dan

5 ml NaOH 10 M

Sentrifuse 201 g selama 10 menit

Pengekstrakan 3x (15 ml campuran dietil eter dingin dan etil asetat (1:1;v/v))

Vortex 45 detik

Pengaturan pH menjadi pH 2 dengan HCl 6N

Terdapat 2 lapisan yaitu lapisan organic phase dan aqueous

Lakukan hidrolisis asam

pada lapisan aqueous

Evaporasi dengan rotary vacuum

Residu dilarutkan kembali sebanyak 3kali

dalam 1.5 ml metanol/air (75:25;v/v), buat

sampai volume 5 ml (labu takar)

penyaringan dengan diameter 0.45m Syringe

Filter (PTFE)

Gelas

piala 50

ml

9 ml

sampel

Disemprotkan nitrogen

Insoluble Phenolic Acid

28

Gambar 9. Metode hidrolisis asam

Pemipetan lapisan organic phase (supernatan)

Lapisan aqueous

Gelas piala

50 ml 2.5 ml HCl

pekat 12 N

Pengekstrakan 3x (15 ml campuran dietil eter dingin dan etil asetat (1:1;v/v))

Sentrifuse 201 g selama 10 menit

Inkubasi dalam water bath suhu 85oC selama 30 menit

Vortex 45 detik

Terdapat 2 lapisan yaitu lapisan organic phase dan aqueous

residu (lapisan

aqueous)

Evaporasi dengan rotary vacuum

Residu dilarutkan kembali sebanyak 3kali

dalam 1.5 ml metanol/air (75:25;v/v), buat

sampai volume 5 ml (Labu takar)

penyaringan dengan diameter 0.45m Syringe

Filter (PTFE)

Insoluble Phenolic Acid

29

Gambar 10. Metode pembuatan standar asam fenolat

24 mg standar

asam fenolat

Pelarutan

12 ml MeOH(aq)

62.5%

Standar stock

MeOH(aq)

62,5%

3.125 ml

standar stock

Larutan standar

asam fenolat

Pencampuran

(sampai volume 10 ml)

Labu takar 10 ml

30

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. KURVA STANDAR ASAM FENOLAT DAN LIMIT DETEKSI

1. Standar Asam Fenolat Bentuk Tunggal

Pembuatan standar asam fenolat dalam bentuk tunggal ditujukan

untuk mengetahui waktu retensi dari masing-masing standar asam fenolat

sehingga dapat diketahui benar kapan munculnya senyawa yang

diidentifikasi. Konsentrasi yang digunakan dalam pembuatan standar

tunggal ini yaitu 625 g/mL untuk masing-masing standar asam fenolat.

Hasil penginjeksian masing-masing standar asam fenolat yang digunakan

dijelaskan sebagai berikut:

a. Asam klorogenat

Puncak senyawa asam klorogenat muncul pada kisaran menit ke-2.0

sampai menit ke-2.2. Gambar 11 menunjukkan kromatogram standar

asam klorogenat pada konsentrasi 625 g/mL dengan analisis HPLC.

Gambar 11. Kromatogram standar asam klorogenat dengan

analisis HPLC

31

b. Asam kafeat

Puncak senyawa asam kafeat muncul pada kisaran menit ke-2.8 sampai

ke-3.2. Gambar 12 menunjukkan kromatogram asam kafeat pada

konsentrasi 625 g/mL dengan analisis HPLC.

Gambar 12. Kromatogram standar asam kafeat dengan analisis HPLC

c. Asam ferulat

Puncak senyawa asam ferulat muncul pada kisaran menit ke-6.7 sampai

ke-7.3. Gambar 13 menunjukkan kromatogram asam ferulat pada

konsentrasi 625 g/mL dengan analisis HPLC.

]

Gambar 13. Kromatogram standar asam ferulat dengan analisis

HPLC

32

2. Limit Deteksi

Perhitungan limit deteksi dilakukan dengan cara menginjeksikan standar

campuran sebanyak sepuluh kali. Konsentrasi yang digunakan untuk

menentukan LOD adalah konsentrasi yang terendah yaitu 125 g/mL.

Setelah diperoleh kesepuluh area tersebut, dimasukkan kedalam persamaan

kurva standar masing-masing, sehingga diperoleh konsentrasi dan standar

deviasinya. Besarnya LOD adalah tiga kali dari nilai standar deviasi

(Rounds dan Nielsen, 2000). Berikut ini hasil perhitungan LOD untuk

masing-masing standar asam fenolat.

a. Asam klorogenat

Nilai limit deteksi senyawa asam klorogenat yaitu 0.97 (g/mL) . untuk

lebih jelas mengenai cara perhitungannya lihat Tabel 4.

b. Asam kafeat

Nilai limit deteksi senyawa asam kafeat yaitu 0.83 (g/mL) . untuk lebih

jelas mengenai cara perhitungannya lihat Tabel. 5

replication Area (g/mL)

1 5486.82 126.67

2 5474.69 126.38

3 5455.19 125.92

4 5477.87 126.46

5 5461.85 126.08

6 5444.66 125.67

7 5470.33 126.28

8 5477.17 126.44

9 5453.63 125.89

10 5454.06 125.90

Mean (X) 5465.63 126.17

Stdev 13.65 0.32

% RSD 0.25 0.26

LOD= 3x stdev 0.97

LOD= 0.97

Tabel 4. Perhitungan LOD Asam klorogenat

33

c. Asam ferulat

Nilai limit deteksi senyawa asam ferulat yaitu 0.80 (g/mL) . untuk lebih

jelas mengenai cara perhitungannya lihat Tabel 6.

Tabel 6. Perhitungan LOD Asam ferulat


1 10909.70 127.36

2 10898.30 127.23

3 10851.10 126.71

4 10854.25 126.75

5 10874.70 126.97

6 10869.25 126.91

7 10919.40 127.47

8 10855.40 126.76

9 10905.70 127.32

10 10883.10 127.07

Mean (X) 10882.09 127.05

Stdev 25.04 0.28

% RSD 0.23 0.22

LOD= 3x stdev 0.83

LOD= 0.83


1 11255.40 127.95

2 11290.50 128.35

3 11289.10 128.33

4 11288.90 128.33

5 11244.80 127.83

6 11282.10 128.26

7 11260.90 128.02

8 11229.80 127.67

9 11230.30 127.67

10 11268.80 128.11

Mean (X) 11264.06 128.05

Stdev 23.71 0.27

% RSD 0.21 0.21

LOD= 3x stdev 0.80

LOD= 0.80

Tabel 5. Perhitungan LOD Asam kafeat

34

3. Standar Asam Fenolat Bentuk Campuran

Pada sayuran terdapat berbagai macam jenis senyawa fenolik baik

senyawa asam fenolat, flavonoid, maupun senyawa-senyawa fenolik

dalam bentuk lainnya. Pembuatan standar asam fenolat dalam bentuk

campuran dimaksudkan agar dapat mengetahui urutan keluar dan waktu

retensi masing-masing standar asam fenolat ketika dicampur

sebagaimana yang terjadi pada sampel sayuran yang dianalisis.

Pembuatan standar campuran dilakukan dengan cara mencampur

ketiga standar asam fenolat dengan perbandingan 1:1 pada tingkat

konsentrasi yang sama yaitu pada konsentrasi 625 g/mL. Adapun

konsentrasi yang dibuat untuk standar campuran yaitu 125, 250, 375,

500, dan 625 g/mL. Pembuatan variasi konsentrasi tersebut dengan cara

mengencerkan standar asam fenolat dalam bentuk campuran pada

konsentrasi 625 g/mL. Data dari hasil penginjeksian standar campuran

dibuat kurva standar campuran dan persamaan garis untuk masing-

masing standar asam fenolat dalam bentuk campuran. Persamaan garis

yang didapat dari kurva standar campuran akan digunakan untuk

melakukan perhitungan senyawa asam fenolat yang terdapat pada sampel

sayuran indigenous. Contoh kromatogram standar campuran yang

menggunakan konsentrasi tertinggi 625 g/mL dapat dilihat pada

Gambar 14.

Persamaan garis untuk asam klorogenat yaitu y = 42.34x + 123.6,

dengan nilai r2 = 0.999. LOD asam klorogenat = 0.97 (g/mL) Kurva

standar campuran asam klorogenat dapat dilihat pada Gambar 15.

Persamaan garis asam kafeat yaitu y = 90.07x -561.7, dengan nilai r2 =

0.998. LOD asam kafeat = 0.83 (g/mL). Kurva standar campuran asam

kafeat dapat dilihat pada Gambar 16. Persamaan garis asam ferulat yaitu

y = 88.66x -88.99, dengan nilai r2 = 0.999. LOD asam ferulat = 0.80

(g/mL). Kurva standar campuran asam ferulat dapat dilihat pada Gambar

17. Data hasil penginjeksian standar asam fenolat dalam bentuk

campuran dapat dilihat pada Tabel 7.

35

Tabel 7. Hasil penginjeksian standar asam fenolat dalam bentuk campuran

Gambar 14. Kromatogram standar campuran dengan analisis HPLC

Gambar 15. Kurva standar asam klorogenat dalam bentuk campuran

No Standar Asam

Fenolat

Rt/waktu

retensi (menit

ke-)

Persamaan kurva

standar campuran

Limit deteksi

(LOD) g/mL

1 Asam

klorogenat 2.0-2.2 y = 42.34x + 123.6 0.97

2 Asam kafeat 2.8-3.2 y = 90.07x -561.7 0.83

3 Asam ferulat 6.7-7.3 y = 88.66x -88.99 0.80

Konsentrasi

(g/mL) Area

0 0

125 5391

250 10959

375 15773

500 21734

625 26285

36

Gambar 16. Kurva standar asam kafeat dalam bentuk campuran

Gambar 17. Kurva standar asam ferulat dalam bentuk campuran

B. TOTAL FENOL

Total fenol merupakan perkiraan kasar jumlah senyawa fenolik yang

terdapat dalam suatu bahan. Pengukuran total fenol yang dilakukan dalam

penelitian ini menggunakan metode yang mereaksikan ekstrak bahan dengan

senyawa folin. Senyawa folin dapat bereaksi dengan gugus kromofor pada

fenolik dan dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang

725 nm.

Pengukuran total fenol dilakukan dengan membandingkan fenol yang ada

dalam bahan dengan kurva standar fenol yang dibuat dari asam galat. Selain

asam galat kurva standar juga dapat mengunakan asam tanat. Pemilihan bahan

yang akan dijadikan standar tergantung bentuk mayoritas fenol yang terdapat

dalam bahan yang diuji. Pada sampel kali ini total fenol mayoritas berupa

polimer asam galat.

Konsentrasi

(g/mL) Area

0 0

125 10788

250 20602

375 33613

500 44570

625 55941

Konsentrasi

(g/mL) Area

0 0

125 11232

250 21681

375 32807

500 44738

625 55252

37

Perhitungan total fenol pada sampel dilakukan dengan menggunakan

persamaan garis dari kurva standar asam galat. Konsentrasi asam galat yang

dibuat adalah 50,100, 150, 200, dan 250 mg/L. Persamaan garis total fenol

yaitu y = 0.0036x-0.0280 dengan nilai r2 = 0.9963. Kurva standar asam galat

dapat dilihat pada Lampiran 10. Perhitungan total fenol, pada sampel dilakukan

berdasarkan berat basah dan berat kering sampel. Basis berat basah berarti

kandungan fenol dihitung sebanyak berapa miligram dalam 100 gram sampel

segar, sedangkan perhitungan berdasarkan basis kering berarti kandungan fenol

dihitung sebanyak berapa miligram dalam 100 gram sampel kering. Dari hasil

analisis total fenol dua puluh empat sampel, diketahui bahwa total fenol

terbanyak berdasarkan berat kering terdapat pada daun jambu mete (4418.4

mg) dan terkecil pada mangkokan (227.7 mg). Nilai total fenol dari dua puluh

empat sampel yang dianalisis dapat dilihat pada Tabel 8 dan untuk perhitungan

total fenol pada sampel selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 11.

No Sampel Wet Basis Dry Basis

[ ] (mg / 100 g sampel segar) [ ] (mg/ 100 g sampel kering)

1 Mengkudu 72.72 499.99

2 Mangkokan 40.36 227.74

3 Daun Labu Siam 66.46 498.94

4 Daun Lembayung 112.55 719.83

5 Daun Katuk 138.01 632.66

6 Daun Kemangi 86.89 690.72

7 Daun Pakis 61.56 573.51

8 Daun Pohpohan 121.52 986.69

9 Bunga Pepaya 66.75 601.90

10 Mangkokan Putih 179.88 1016.83

11 Daun Kenikir 342.06 1736.69

12 Daun Kelor 107.00 432.75

13 Daun Kucai 21.01 272.86

14 Daun Jambu Mete 847.41 4418.38

15 Buah Takokak 158.92 790.12

16 Antanan 200.52 1097.23

17 Krokot 82.66 692.69

18 Antanan Beurit 144.81 922.37

19 Daun Ginseng 64.64 790.76

20 Bunga kecombrang 256.99 2511.45

21 Daun Beluntas 742.54 3868.59

22 Bunga Turi 38.43 393.19

23 Terubuk 87.65 754.68

24 Kedondong cina 189.08 1297.72

Tabel 8. Total Fenol Sayuran Indigenous

38

C. ANALISIS ASAM FENOLAT PADA SAYURAN INDIGENOUS

Hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap dua puluh empat jenis

sayuran indigenous Indonesia mengenai kandungan asam fenolat (asam

klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat), didapatkan bahwa sebagian besar

sayuran indigenous Indonesia mengandung asam fenolat terutama asam

klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat. Hanya sebagian kecil yang tidak

mengandung ketiga senyawa asam fenolat tersebut diantaranya yaitu

mengkudu, daun jambu mete, daun beluntas, dan kedondong cina yang hanya

mengandung klorogenat dan asam ferulat, sedangkan daun pakis dan antanan

beurit hanya mengandung klorogenat dan asam kafeat, terakhir bunga turi

hanya mengandung asam ferulat.

Penentuan asam fenolat (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat)

pada sampel

asam kafeat

Documents