Download - asam kafeat
-
SKRIPSI
IDENTIFIKASI SENYAWA ASAM FENOLAT PADA SAYURAN
INDIGENOUS INDONESIA
Oleh:
RIZA ARIS APRIADY
F24050276
2010
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
-
IDENTIFIKASI SENYAWA ASAM FENOLAT PADA SAYURAN
INDIGENOUS INDONESIA
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Fakultas Teknologi Pertanian
Institut Pertanian Bogor
Oleh:
RIZA ARIS APRIADY
F24050276
2010
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
-
Judul Skripsi : Identifikasi Senyawa Asam Fenolat pada Sayuran Indigenous
Indonesia
Nama : Riza Aris Apriady
NIM : F24050276
Menyetujui Dosen Pembimbing,
Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si.
NIP: 19630701.198811.2.001
Mengetahui,
Ketua Departemen,
Dr. Ir. Dahrul Syah
NIP: 19650814.199002.1.001
Tanggal Lulus: 22 Januari 2010
-
Riza Aris Apriady. F24050276. Identifikasi Senyawa Asam Fenolat pada
Sayuran Indigenous Indonesia. Di Bawah Bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan,
M.Si.
ABSTRAK
Jawa Barat merupakan salah satu provinsi penghasil sayur-sayuran yang
memiliki peran cukup signifikan dalam menghasilkan jenis sayur-sayuran di
Indonesia. Spesies sayuran asli Indonesia yang berasal dari
daerah/wilayah/ekosistem tertentu, termasuk spesies pendatang dari wilayah
geografis lain tetapi telah berevolusi dengan iklim dan geografis wilayah
Indonesia dinamakan sayuran indigenous. Beberapa balai penelitian seperti Balai
Penelitian Tanaman Sayuran (Balitsa) bekerjasama dengan Asian Vegetables
Research Development Center (AVRDC) telah melakukan pendataan terhadap
sayuran ini terutama yang mempunyai kandungan gizi dan non gizi yang
bermanfaat secara fisiologis bagi tubuh manusia yaitu vitamin A, zat besi, dan
antioksidan.
Antioksidan merupakan senyawa yang sangat baik untuk menangkap
radikal bebas. Keberadaan senyawa antioksidan ini akan mencegah penyakit
kanker maupun penyakit degeneratif lainnya. Salah satu senyawa antioksidan
yang penting yaitu senyawa polifenol. Senyawa polifenol yang ada di sayuran,
buah-buahan, dan teh dapat mencegah penyakit degeneratif termasuk kanker
melalui aktivitas antioksidatif dan/atau modulasi fungsi beberapa protein.
Salah satu senyawa polifenol yang banyak terdapat pada sayuran yaitu
flavonoid dan asam fenolat. Senyawa asam fenolat (phenolic acids) mendapatkan
perhatian yang lebih dalam beberapa tahun terakhir ini karena pengaruhnya untuk
kesehatan manusia. Sebagai polifenol, asam fenolat merupakan antioksidan yang
sangat kuat dan memiliki aktivitas antibakteri, antivirus, antikarsinogenik,
antiinflamasi, dan aktivitas vasodilatory. Selain itu asam fenolat juga mempunyai
peranan untuk melindungi dari kanker dan penyakit jantung.
Penelitian ini meneliti kandungan asam fenolat (asam klorogenat, asam
kafeat, dan asam ferulat) pada dua puluh empat jenis sayuran indigenous
Indonesia yang berasal dari Jawa Barat yaitu kenikir, kecombrang, kemangi,
katuk, pohpohan, ginseng, takokak, lembayung, terubuk, labu siam, pepaya, mete,
pakis, beluntas, mangkokan putih, mangkokan, kendondong cina, antanan,
antanan beurit, krokot, turi, kelor, dan mengkudu. Bagian tanaman yang
digunakan untuk penelitian ini bisa berupa daun, batang, dan seluruh bagian
tanaman. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu persiapan sampel,
pembuatan kurva standar dan Limit of Detection (LOD), analisis asam fenolat
dengan HPLC, serta analisis statistik. Analisis asam fenolat dengan HPLC
dilakukan secara dua ulangan duplo. Analisis statistik yang digunakan yaitu uji
Tukey pada taraf 5%, uji T pada taraf 1%, dan principal component analysis
(PCA).
Hasil penelitian ini mendapatkan data kisaran asam klorogenat 0.0847.02
mg per 100 gram sampel segar, asam kafeat 0.36 8.65 mg per 100 gram sampel
segar, dan asam ferulat 0.09 5.02 mg per 100 gram sampel segar.
-
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandar Lampung pada tanggal 7 April
1987, penulis adalah anak pertama dari Bapak Drs. Nazarudin,
SH dan Sundari. Penulis memiliki dua orang adik perempuan
yaitu Riska Pahyuni dan Ririn Wirdayani. Penulis menempuh
pendidikan sekolah dasar di SD Negeri 1 Bukit, Musi
Banyuasin, Sumatra Selatan pada tahun 1993-1999, pendidikan
lanjutan tingkat pertama di SLTP Negeri 22 Bandar Lampung pada tahun 1999-
2002, dan pendidikan lanjutan tingkat atas di SMU Negeri 2 Bandar Lampung
pada tahun 2002-2005.
Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur SPMB pada
tahun 2005. Penulis diterima di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB pada
tahun 2006 setelah melalui satu tahun TPB (Tahap Persiapan Bersama). Selama
menjadi mahasiswa di IPB (Institut Pertanian Bogor). Penulis aktif di berbagai
kegiatan baik kegiatan akademik maupun kegiatan ektrakurikuler.
Pada bidang akademik, penulis aktif dalam mengikuti berbagai lomba baik
nasional maupun internasional di antaranya juara 3 dunia dalam lomba DSDC
(Developing Solutions for Developing Countries Competition) di Anaheim,
California pada bulan Juni 2009 dan mendapatkan penghargaan dari Menteri
Pertanian RI terkait dengan prestasi internasional (DSDC), juara 1 debat bahasa
Inggris IPB pada tahun 2007 dan 2008, finalis IEC (Innovative Entrepreneur
Challenge) pada tahun 2008, mendapatkan pendanaan dari DIKTI dalam lomba
program kreativitas mahasiswa, mendapatkan pendanaan dari IPB dalam program
pengembangan kewirausahaan mahasiswa. Selain lomba penulis juga menjadi
presenter dalam 37th
International Forestry Student Symposium 2009, presenter di
National Students Conference UNIKA Soegijapranata Semarang 2008,
mendapatkan beasiswa PPA pada tahun 2006, menjadi asisten praktikum kimia
dan biokimia pangan, menjadi asisten praktikum teknologi pengolahan pangan.
Penulis pernah mengikuti training ISO 9001:2000, ISO 22000:2005, dan Sitem
Manajemen Halal, terlibat dalam The International Technical Forum for
Cooperation and Exchange between Korea and Indonesia pada tahun 2009,
penulis juga aktif dalam mengikuti seminar-seminar yang terkait dengan teknologi
-
pangan maupun kewirausahaan, di antaranya yaitu International Nano Food
Science Technology Conference di Anaheim, California pada tahun 2009, seminar
Wirausaha Muda Mandiri 2009, dan seminar Nasional Ketahanan Pangan Bangsa.
Pada bidang ekstrakurikuler penulis merupakan anggota dari IFT (Institute
of Food Technologist), HMPPI (Himpunan Mahasiswa Peduli Pangan Indonesia),
HIMITEPA (Himpunan Mahasiswa Teknologi Pangan), penulis pernah
mengkoordinatori bidang akademik dan kerohanian di KEMALA (Kesatuan
Mahasiswa Lampung) pada periode tahun 2005-2006. Penulis juga pernah
menjadi ketua FCC (Food Chat Club) pada periode tahun 2008-2009. Penulis
aktif dalam kepanitiaan kegiatan nasional seperti menjadi wakil pada kegiatan the
7th
National Students Paper Competition pada tahun 2008, menjadi PJK pada
kegiatan BAUR 2007, dan menjadi penyuluh dalam kegiatan Penyuluhan
Keamanan Pangan yang diselenggarakan oleh SEAFAST Center IPB. Dalam sela-
sela kesibukan akademik dan penelitian, penulis menyibukkan dirinya dengan
membuka caf bersama teman-temannya, caf tersebut diberi nama FRIENDS 24
CAF yang menjual produk-produk seafood olahan yang siap santap dan siap saji.
Penulis melakukan penelitian dengan judul IDENTIFIKASI
SENYAWA ASAM FENOLAT PADA SAYURAN INDIGENOUS
INDONESIA sebagai syarat untuk meraih gelar sarjana. Penelitian ini
dikerjakan dibawah bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si pada tahun 2010.
-
KATA PENGANTAR
Segala puji bagi Alloh Azza wa jalla yang telah memberikan kekuatan
pada penulis sehingga skripsi dengan judul Identifikasi Senyawa Asam Fenolat
Pada Sayuran Indigenous Indonesia dapat diselesaikan. Shalawat serta salam
semoga selalu tercurah kepada baginda Rasululloh Muhammad SAW karena
beliau telah membawa jalan yang terang benderang kepada manusia. Penulisan
skripsi ini tidak terlepas dalam bantuan berbagai pihak, oleh karena itu penulis
ingin menyampaikan terima kasih kepada:
1. Ayah, Ibu, Riska, dan Ririn yang selalu mendoakan, memberikan nasihat,
motivasi, kasih sayang, dan bantuan materil.
2. Ibu Dr. Ir. Nuri Andarwulan, M.Si selaku dosen pembimbing akademik yang
telah memberikan nasihat, motivasi, dan masukan dalam pembuatan skripsi ini.
3. Dewi Kurniasih, Riska Rudiyanti Dewi selaku teman satu bimbingan yang
selalu memberikan motivasi, masukan, dan doa. Terima kasih atas
kebersamaannya dalam menggapai cita-cita.
4. Teman-teman Friends 24 Cafe (Fahmi, Tiwi, Dilla, Widi, dan Widya).
5. Teman-teman kosan (Dimas, Erwin, Muji, Sobur, Deni, Tri Erza, dan Sigit).
6. Seluruh teman-teman ITP 42 yang telah bersama baik dalam keadaan senang
maupun duka selama lebih kurang tiga tahun.
7. Abah, mba Irin, mba Ria, dan kak Marto yang telah membantu penulis di
Laboratorium SEAFAST Center IPB.
Penulis menyadari skripsi ini tidak lepas dari kesalahan. Oleh karena itu
penulis minta maaf dan dengan senang hati menerima kritik dan saran dari
berbagai pihak. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat untuk
kehidupan manusia.
Bogor, Januari 2010
Penulis
i
-
ii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR. ........................................................................................ i
DAFTAR ISI. ...................................................................................................... ii
DAFTAR TABEL. .............................................................................................. iv
DAFTAR GAMBAR. ......................................................................................... vi
DAFTAR LAMPIRAN. ..................................................................................... ix
I. PENDAHULUAN. ....................................................................................... 1
A. LATAR BELAKANG. .............................................................................. 1
B. TUJUAN. .................................................................................................. 3
C. MANFAAT. .............................................................................................. 3
II. TINJAUAN PUSTAKA. .............................................................................. 4
A. SAYURAN INDIGENOUS. ...................................................................... 4
B. ASAM FENOLAT (PHENOLIC ACID). .................................................. 6
C. IDENTIFIKASI SENYAWA ASAM FENOLAT. ................................... 13
III. BAHAN DAN METODE. ............................................................................ 16
A. BAHAN DAN ALAT. .............................................................................. 16
1. Bahan. ................................................................................................... 16
2. Alat. ...................................................................................................... 18
B. METODE. ................................................................................................. 18
1. Persiapan Sampel. ................................................................................. 18
2. Pembuatan Kurva Standar dan Limit of Detection (LOD). .................. 20
3. Analisis Asam Fenolat pada Sayuran. .................................................. 21
4. Analisis Statistik. .................................................................................. 23
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN. .................................................................... 30
A. KURVA STANDAR ASAM FENOLAT DAN LIMIT DETEKSI. ......... 30
1. Standar Asam Fenolat Bentuk Tunggal. ............................................... 30
2. Limit Deteksi. ....................................................................................... 32
3. Standar Asam Fenolat Bentuk Campuran. ........................................... 34
B. TOTAL FENOL. ....................................................................................... 36
C. ANALISIS ASAM FENOLAT PADA SAYURAN INDIGENOUS. ...... 38
D. REKAPITULASI HASIL DAN SENYAWA YANG
BELUM TERIDENTIFIKASI PADA SAYURAN INDIGENOUS. ....... 96
-
iii
E. ANALISIS STATISTIK ..........................................................................105
V. KESIMPULAN DAN SARAN. ....................................................................114
A. KESIMPULAN. ...................................................................................... 114
B. SARAN. .................................................................................................. 115
DAFTAR PUSTAKA. ........................................................................................116
LAMPIRAN. .......................................................................................................120
-
iv
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Kandungan Senyawa Flavonoid Pada Sebelas Sayuran Indigenous
Jawa Barat (mg/100 gam sampel segar). ......................................... 5
Tabel 2. Kandungan Senyawa Flavonoid Pada Tiga Belas Sayuran
Indigenous Jawa Barat (mg/100 gam sampel segar). ....................... 6
Tabel 3. Dua Puluh Empat Jenis Sayuran Indigenous Indonesia. ...................... 17
Tabel 4. Perhitungan LOD Asam Klorogenat. ................................................... 32
Tabel 5. Perhitungan LOD Asam Kafeat. .......................................................... 33
Tabel 6. Perhitungan LOD Asam Ferulat. .......................................................... 33
Tabel 7. Hasil Penginjeksian Standar Asam Fenolat dalam Bentuk Campuran. 35
Tabel 8. Total Fenol Sayuran Indigenous. ......................................................... 37
Tabel 9. Perhitungan Kandungan Asam Fenolat dengan
Kurva Standar Campuran. .................................................................... 39
Tabel 10. Perhitungan Kandungan Asam Fenolat dengan
Eksternal Standar Campuran. ............................................................... 40
Tabel 11. Perbandingan Perhitungan Kandungan Asam Fenolat
antara Kurva Standar Campuran dan Eksternal Standar Campuran. ... 41
Tabel 12. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Mengkudu. ........... 43
Tabel 13. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Mangkokan. ......... 45
Tabel 14. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Labu Siam. . 47
Tabel 15. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Lembayung. 49
Tabel 16. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Katuk. ......... 52
Tabel 17. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Kemangi. .... 54
Tabel 18. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Pakis. .......... 56
Tabel 19. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Pohpohan. ... 59
Tabel 20. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Bunga Pepaya. ..... 61
Tabel 21. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Mangkokan Putih. 63
Tabel 22. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Kenikir. ................ 65
Tabel 23. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Kelor........... 67
Tabel 24. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Kucai. ......... 70
Tabel 25. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak
Daun Jambu Mete. ............................................................................... 72
-
v
Tabel 26. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Buah Takokak. ...... 74
Tabel 27. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Antanan. ................ 77
Tabel 28. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Krokot. .................. 79
Tabel 29. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Antanan Beurit. ..... 81
Tabel 30. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Ginseng. ...... 83
Tabel 31. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak
Bunga Kecombrang. .............................................................................. 85
Tabel 32. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Daun Beluntas. ...... 88
Tabel 33. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Bunga Turi. ........... 90
Tabel 34. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Terubuk. ................ 92
Tabel 35. Perbandingan Luasan Area Kromatografi Ekstrak Kedondong Cina. .. 95
Tabel 36. Kandungan Asam Fenolat Pada Dua Puluh Empat Jenis
Sayuran Indigenous Segar. .................................................................. 97
Tabel 37. Kandungan Asam Fenolat pada Dua Puluh Empat Jenis
Sayuran Indigenous Berdasarkan Bagian yang diteliti. ........................ 98
Tabel 38. Rekapitulasi Kadar Air, Total Fenol, dan Asam Fenolat
Sayuran Indigenous. ............................................................................ 101
Tabel 39. Rekapitulasi Komponen yang Terdeteksi Pada Sampel
Sayuran Indigenous Menggunakan HPLC. ........................................ 103
Tabel 40. Rekapitulasi Area Unknown pada Waktu Retensi Tertentu. .............. 104
Tabel 41. Uji T pada Perhitungan Kandungan Asam Fenolat antara
Kurva Standar Campuran dan Eksternal Standar Campuran. ............. 105
Tabel 42. Akar Ciri (Eigen Value), Proporsi, dan Kumulatif Keragaman
dari Sembilan Variabel. .......................................................................107
Tabel 43. Matriks Korelasi Sembilan Variabel. .................................................. 108
Tabel 44. Nilai-Nilai Vektor dari Hubungan antara Masing-Masing
Variabel dengan Komponen Utama. .................................................. 108
Tabel 45. Akar Ciri, Proporsi, dan Kumulatif Tiga Variabel...............................110
Tabel 46. Matriks Korelasi Total Fenol, Total Flavonoid, dan Total
Asam Fenolat. ......................................................................................111
Tabel 47. Nilai-Nilai Vektor dari Hubungan antara Masing-Masing
Variabel dengan Komponen Utama. ................................................... 111
-
vi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur Kimia : (a) turunan asam benzoat (b) turunan asam. ........ 7
Gambar 2. Jalur Shikimate . ............................................................................... 9
Gambar 3. Biosintesis Hidroksibenzoat, Hidroksinamat, dan Flavonoid. .......... 11
Gambar 4. Biosintesis Asam Klorogenat. ........................................................... 12
Gambar 5. Persiapan Sampel. ............................................................................. 24
Gambar 6. Prosedur Analisis Total Fenol. .......................................................... 25
Gambar 7. Metode Ekstraksi Asam Fenolat dari Sayuran Indigenous. .............. 26
Gambar 8. Metode Hidrolisis Basa. ................................................................... 27
Gambar 9. Metode Hidrolisis Asam. .................................................................. 28
Gambar 10. Metode Pembuatan Standar Asam Fenolat. ...................................... 29
Gambar 11. Kromatogram Standar Asam Klorogenat dengan Analisis HPLC. ... 30
Gambar 12. Kromatogram Standar Asam Kafeat dengan Analisis HPLC. ......... 31
Gambar 13. Kromatogram Standar Asam Ferulat dengan Analisis HPLC. .......... 31
Gambar 14. Kromatogram Standar Campuran dengan Analisis HPLC. ............... 35
Gambar 15. Kurva Standar Campuran Asam Klorogenat. .................................... 35
Gambar 16. Kurva Standar Campuran Asam Kafeat. ........................................... 36
Gambar 17. Kurva Standar Campuran Asam Ferulat ........................................... 36
Gambar 18. Kromatogram Ekstrak Mengkudu dengan Analisis HPLC. .............. 43
Gambar 19. Ko-kromatogram Ekstrak Mengkudu dengan Standar Campuran. ... 43
Gambar 20. Kromatogram Ekstrak Mangkokan dengan Analisis HPLC. ............ 45
Gambar 21. Ko-kromatogram Ekstrak Mangkokan dengan Standar Campuran. . 45
Gambar 22. Kromatogram Ekstrak Daun Labu Siam dengan Analisis HPLC. .... 47
Gambar 23. Ko-kromatogram Ekstrak Daun Labu Siam dengan
Standar Campuran. ............................................................................ 47
Gambar 24. Kromatogram Ekstrak Daun Lembayung dengan Analisis HPLC... 49
Gambar 25. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Lembayung dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 49
Gambar 26. Kromatogram Ekstrak Daun Katuk dengan Analisis HPLC. ........... 52
Gambar 27. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Katuk dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 52
-
vii
Gambar 28. Kromatogram Ekstrak Daun Kemangi dengan Analisis HPLC. ...... 54
Gambar 29. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Kemangi dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 54
Gambar 30. Kromatogram Ekstrak Daun Pakis dengan Analisis HPLC. ............ 56
Gambar 31. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Pakis dengan Standar Campuran. 56
Gambar 32. Kromatogram Ekstrak Daun Pohpohan dengan Analisis HPLC. ..... 59
Gambar 33. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Pohpohan dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 59
Gambar 34. Kromatogram Ekstrak Bunga Pepaya dengan Analisis HPLC. ....... 61
Gambar 35. Ko-Kromatogram Ekstrak Bunga Pepaya dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 61
Gambar 36. Kromatogram Ekstrak Mangkokan Putih dengan Analisis HPLC. .. 63
Gambar 37. Ko-Kromatogram Ekstrak Mangkokan Putih dengan
Standar Campuran. ............................................................................ 63
Gambar 38. Kromatogram Ekstrak Kenikir dengan Analisis HPLC. .................. 65
Gambar 39. Ko-Kromatogram Ekstrak Kenikir dengan Standar Campuran. ...... 65
Gambar 40. Kromatogram Ekstrak Daun Kelor dengan Analisis HPLC............. 67
Gambar 41. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Kelor dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 67
Gambar 42. Kromatogram Ekstrak Daun Kucai dengan Analisis HPLC. ........... 70
Gambar 43. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Kucai dengan Standar Campuran. 70
Gambar 44. Kromatogram Ekstrak Daun Jambu Mete dengan Analisis HPLC. . 72
Gambar 45. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Jambu Mete dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 72
Gambar 46. Kromatogram Ekstrak Buah Takokak dengan Analisis HPLC. ....... 74
Gambar 47. Ko-Kromatogram Ekstrak Buah Takokak dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 74
Gambar 48. Kromatogram Ekstrak Antanan dengan Analisis HPLC. ................. 77
Gambar 49. Ko-Kromatogram Ekstrak Antanan dengan Standar Campuran. ..... 77
Gambar 50. Kromatogram Ekstrak Krokot dengan Analisis HPLC. ................... 79
Gambar 51. Ko-Kromatogram Ekstrak Krokot dengan Standar Campuran. ....... 79
Gambar 52. Kromatogram Ekstrak Antanan Beurit dengan Analisis HPLC . ..... 81
-
viii
Gambar 53. Ko-Kromatogram Ekstrak Antanan Beurit dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 81
Gambar 54. Kromatogram Ekstrak Daun Ginseng dengan Analisis HPLC. ....... 83
Gambar 55. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Ginseng dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 83
Gambar 56. Kromatogram Ekstrak Bunga Kecombrang dengan
Analisis HPLC. ................................................................................ 85
Gambar 57. Ko-Kromatogram Ekstrak Bunga Kecombrang dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 85
Gambar 58. Kromatogram Ekstrak Daun Beluntas dengan Analisis HPLC. ....... 88
Gambar 59. Ko-Kromatogram Ekstrak Daun Beluntas dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 88
Gambar 60. Kromatogram Ekstrak Bunga Turi dengan Analisis HPLC. ............ 90
Gambar 61. Ko-Kromatogram Ekstrak Bunga Turi dengan Standar Campuran. 90
Gambar 62. Kromatogram Ekstrak Terubuk dengan Analisis HPLC. ................. 92
Gambar 63. Ko-Kromatogram Ekstrak Terubuk dengan Standar Campuran. ..... 92
Gambar 64. Kromatogram Ekstrak Kedondong Cina dengan Analisis HPLC. ... 95
Gambar 65. Ko-Kromatogram Ekstrak Kedondong Cina dengan
Standar Campuran. ........................................................................... 95
Gambar 66. Biplot Hubungan Total Fenol, Asam Klorogenat, Asam Kafeat,
Asam Ferulat, Myricetin, Luteolin, Quercetin, Apigenin,
dan Kaempferol. ............................................................................ 109
Gambar 67. Biplot Hubungan Antara Total Fenol, Total Asam Fenolat,
dan Total Flavonoid. .......................................................................112
-
ix
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Gambar Dua Puluh Empat Sayuran Indigenous Indonesia. ........ 120
Lampiran 2. Uji Tukeys Kadar Air Sayuran Indigenous Indonesia. ..............122
Lampiran 3. Uji Tukeys Total Fenol Sayuran Indigenous Indonesia. ............124
Lampiran 4. Uji Tukeys Asam Fenolat Pada Sayuran Indigenous
Indonesia......................................................................................126
Lampiran 5. Uji Tukeys Asam Klorogenat Sayuran Indigenous Indonesia. ..128
Lampiran 6. Uji Tukeys Asam Kafeat Sayuran Indigenous Indonesia. .........130
Lampiran 7. Uji Tukey Asam Ferulat Sayuran Indigenous Indonesia. ............132
Lampiran 8. Kadar Air Sayuran Indigenous Indonesia. ...................................134
Lampiran 9. Kadar Air Freeze Drier Sayuran Indigenous Indonesia. .............137
Lampiran 10. Kurva Standar Total Fenol . ........................................................140
Lampiran 11. Total Fenol Sayuran Indigenous Indonesia. ................................141
Lampiran 12. Asam Klorogenat Sayuran Indigenous dengan
Perhitungan Kurva Standar Campuran. ......................................147
Lampiran 13. Asam Kafeat Sayuran Indigenous dengan
Perhitungan Kurva Standar Campuran. ......................................153
Lampiran 14. Asam Ferulat Sayuran Indigenous dengan
Perhitungan Kurva Standar Campuran. ......................................159
Lampiran 15. Asam Klorogenat Sayuran Indigenous dengan
Perhitungan Eksternal Standar Campuran. ..................................165
Lampiran 16. Kafeat Acid Sayuran Indigenous dengan
Perhitungan Eksternal Standar Campuran. ..................................171
Lampiran 17. Asam Ferulat Sayuran Indigenous dengan
Perhitungan Eksternal Standar Campuran. ..................................177
-
1
I. PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Indonesia merupakan negara yang kaya sumber daya alam baik hasil
perikanan, pertanian, maupun perkebunan. Tanaman sayuran di Indonesia
sangat banyak dan bervariasi. Akan tetapi masih banyak dari sayuran tersebut
yang belum dimanfaatkan dan diidentifikasi secara ilmiah kandungan senyawa
yang bermanfaat untuk kesehatan tubuh manusia. Pemanfaatannya masih
terbatas hanya sebagai lalapan maupun campuran gulai. Sayuran sangat
diperlukan oleh tubuh untuk memenuhi asupan vitamin, mineral, dan serat
seseorang setiap harinya.
Jawa Barat merupakan salah satu provinsi penghasil sayur-sayuran yang
memiliki peran cukup signifikan dalam menghasilkan jenis sayur-sayuran di
Indonesia. Spesies sayuran asli Indonesia yang berasal dari
daerah/wilayah/ekosistem tertentu, termasuk spesies pendatang dari wilayah
geografis lain tetapi telah berevolusi dengan iklim dan geografis wilayah
Indonesia dinamakan sayuran indigenous (Anonim, 2007). Beberapa balai
penelitian seperti Balai Penelitian Tanaman Sayuran (Balitsa) bekerjasama
dengan Asian Vegetables Research Development Center (AVRDC) telah
melakukan pendataan terhadap sayuran ini terutama yang mempunyai
kandungan gizi dan non gizi yang bermanfaat secara fisiologis bagi tubuh
manusia yaitu vitamin A, zat besi, dan antioksidan.
Antioksidan merupakan senyawa yang sangat baik untuk menangkap
radikal bebas. Keberadaan senyawa antioksidan ini akan mencegah penyakit
kanker maupun penyakit degeneratif lainnya. Salah satu senyawa antioksidan
yang penting yaitu senyawa polifenol. Senyawa polifenol yang ada pada
sayuran, buah-buahan, dan teh dapat mencegah penyakit degeneratif termasuk
kanker melalui aktivitas antioksidatif dan/atau modulasi fungsi beberapa
protein. Contohnya konsumsi senyawa polifenol dapat mereduksi kematian
akibat penyakit jantung koroner (Hertog, 1995) dengan cara menekan oksidasi
lipoprotein berat jenis rendah (Meyer, 1998). Polifenol menunjukkan sifat
antagonis dengan reseptor karsinogenesis seperti faktor pertumbuhan
-
2
asepidermal (Agullo, 1997), dan reseptor arylhidrokarbon (Ashida et al., 2000).
Polifenol mengatur sekresi senyawa sitokin, meregulasi siklus sel (Frey et al.,
2001) dan ekspresi protein kinase dalam proliferasi sel tumor (Kobuchi et al.,
1999). Senyawa polifenol juga menginduksi ekspresi enzim antikarsinogenik
(Williamson et al., 1996). Dalam percobaan pada hewan, konsumsi senyawa
polifenol dapat menekan karsinogenesis dari beberapa karsinogen (Yang et al.,
2001). Kemampuan yang dimiliki oleh polifenol untuk menangkap radikal
bebas serta memiliki aktivitas antioksidan mempunyai peranan yang penting
untuk melindungi sel dan jaringan dari stres oksidatif dan efek biologis lain
yang berhubungan dengan penyakit kronis (Rimbach et al., 2005). Senyawa
polifenol dapat menekan efek di dalam usus. seperti efek dalam mengikat besi,
menangkap nitrogen reaktif, klorin, dan spesies oksigen, serta menghambat
cyclooxygenases dan lipoxygenases (Halliwell et al., 2005).
Salah satu senyawa polifenol yang banyak terdapat di sayuran yaitu
flavonoid dan asam fenolat. Batari (2007) telah melakukan penelitian terhadap
sebelas jenis sayuran indigenous Jawa Barat yaitu kenikir, beluntas,
mangkokan, kemangi, pohpohan, katuk, antanan, ginseng, kecombrang,
kedondong cina, dan krokot mengenai kandungan senyawa flavonoid (Flavonol
dan Flavone) pada sayuran tersebut. Selain itu Rahmat (2009) juga telah
melakukan penelitian mengenai kandungan senyawa flavonoid (Flavonol dan
Flavone) pada tiga belas jenis sayuran indigenous Jawa Barat yaitu mengkudu,
mangkokan putih, labu siam, lembayung, pakis, pepaya, kelor, kucai, turi,
jambu mete, terubuk, takokak, dan antanan beurit.
Pada penelitian ini dilakukan identifikasi senyawa asam fenolat yang
terdapat pada sayuran indigenous Indonesia yang berasal dari Jawa Barat.
Asam fenolat memiliki dua jenis golongan yaitu golongan asam hidroksinamat
dan golongan asam hidroksibenzoat. Asam fenolat yang dominan terdapat pada
sayuran adalah golongan asam hidroksinamat (Shahidi dan Naczk, 1995).
Bentuk senyawa asam hidroksinamat yang terdapat pada sayuran yaitu asam p-
koumarat, asam ferulat, asam kafeat, dan asam klorogenat. Sedangkan menurut
hasil penelitian Sakakibara et al. (2003) senyawa asam fenolat yang banyak
terdapat pada sayuran yaitu asam ferulat, asam kafeat, dan asam klorogenat.
-
3
Dengan demikian pada penelitian ini diidentifikasi keberadaan senyawa asam
ferulat, asam kafeat, dan asam klorogenat pada sayuran indigenous Indonesia
yang berasal dari Jawa Barat.
Jenis sayuran yang digunakan pada penelitian ini adalah sayuran lokal
yang banyak dan sering dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia. Bagian
tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian yang sering
dikonsumsi oleh masyarakat. Sayuran yang digunakan dalam penelitian ini
adalah sayuran yang digunakan juga oleh Batari (2007) yaitu kenikir, beluntas,
mangkokan, kemangi, pohpohan, katuk, antanan, ginseng, kecombrang,
kedondong cina, dan krokot maupun yang digunakan oleh Rahmat (2009) yaitu
mengkudu, mangkokan putih, labu siam, lembayung, pakis, pepaya, kelor,
kucai, turi, jambu mete, terubuk, takokak, dan antanan beurit.
B. TUJUAN
Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi kandungan komponen
asam fenolat (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat) pada dua puluh
empat jenis sayuran indigenous Indonesia.
C. MANFAAT
Manfaat penelitian ini adalah mendapatkan data mengenai kandungan
komponen asam fenolat (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat) pada
dua puluh empat jenis sayuran indigenous Indonesia sehingga dapat
dimanfaatkan lebih lanjut.
-
4
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. SAYURAN INDIGENOUS
Sayuran indigenous Indonesia adalah spesies sayuran asli Indonesia yang
berasal dari daerah/wilayah/ekosistem tertentu, termasuk spesies pendatang
dari wilayah geografis lain tetapi telah berevolusi dengan iklim dan geografis
wilayah Indonesia (Anonim, 2007). Sayuran ini biasa digunakan oleh
masyarakat sebagai lalapan, campuran gulai, maupun obat.
Perkembangan budaya dan teknologi menyebabkan perkembangan
sayuran indigenous menjadi terdesak, maka potensi sayuran ini harus digali
dan dikaji kembali untuk mendapatkan manfaat yang lebih baik dalam
meningkatkan gizi keluarga. Pada penelitian ini diidentifikasi kandungan asam
fenolat dari sayuran indigenous tersebut. Sayur yang digunakan adalah sayur-
sayuran yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat dan banyak tumbuh di
Indonesia yang berasal dari provinsi Jawa Barat. Bagian dari sayur-sayuran
indigenous yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian yang biasa
dikonsumsi (dapat berupa batang, daun, bunga atau seluruh bagian tanaman).
Sayuran tersebut diantaranya adalah Kenikir (Cosmos caudatus H.B.K),
beluntas (Pluchea indica (L.) Less.), mangkokan putih (Nothopanax
scutellarium (Burm.f.) Fosb.), mangkokan (Nothopanax scutellarius (Burm.f.)
Merr.), kendondong cina (Polyscias pinnata), kecombrang (Etlingera elatior
(Jack) R.M.Sm.), kemangi (Ocimum americanum L.), katuk (Sauropus
androgynus (L.) Merr.), antanan (Centelia asiatica (L.) Urb.), antanan beurit
(Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.), pohpohan (Pilea melastomoides (Poir.)
Bl.), ginseng (Talinum triangulare (Jacq.) Willd.), krokot (Portulaca oleracea
L.), turi (Sesbania grandiflora (L.) Pers.), kucai (Allium schoenoprasum L.),
takokak (Solanum torvum Swartz), kelor (Moringa pterygosperma Gaertn.),
mengkudu (Morinda citrifolia L.), lembayung (Vigna unguiculata (L.) Walp.),
terubuk (Saccharum edule Hassk.), labu siam (Sechium edule (Jacq.) Swartz.),
pepaya (Carica papaya L.), jambu mete (Anacardium occidentale L.), dan
pakis (Arcypteris irregularis (C.Presl) Ching.).
-
5
Batari (2007) telah melakukan penelitian terhadap sebelas sayuran
indigenous Indonesia yaitu kenikir, beluntas, mangkokan, kemangi, pohpohan,
katuk, antanan, ginseng, kecombrang, kedondong cina, dan krokot. Penelitian
Batari (2007) menunjukkan bahwa kesebelas sayuran indigenous Jawa Barat
tersebut mengandung senyawa flavonoid (flavonol dan flavones), lihat Tabel 1.
Rahmat (2009) telah melakukan penelitian yang serupa pada tiga belas sayuran
indigenous Jawa Barat yaitu mengkudu, mangkokan putih, labu siam,
lembayung, pakis, pepaya, kelor, kucai, turi, jambu mete, terubuk, takokak, dan
antanan beurit. Penelitian Rahmat (2009) menunjukkan bahwa ketiga belas
sayuran indigenous Jawa Barat tersebut mengandung senyawa flavonoid
(flavonol dan flavone), lihat Tabel 2. Senyawa flavonoid adalah salah satu
antioksidan yang penting bagi tubuh manusia untuk menjaga kesehatan.
Sayuran indigenous di atas mengandung senyawa flavonoid (antioksidan)
sehingga baik untuk menjaga kesehatan tubuh manusia.
Sampel
Flavonoid (mg/100 gram sampel segar) Total Fenol
(mg/100 gram
sampel segar) Flavonol Flavon
Myricetin Quercetin Kaempferol Luteolin Apigenin
Kenikir - 51.28 0.90 - - 150.01
Beluntas 0.90 5.21 0.28 - - 83.12
Mangkokan - 3.69 1.74 - - 94.30
Kecombrang - 1.18 - - - 80.61
Kemangi - 1.89 2.47 2.12 0.74 81.18
Katuk - 4.50 138.14 - - 149.32
Kedondong Cina - 28.48 23.71 - - 79.06
Antanan 0.13 12.31 8.57 - - 46.32
Pohpohan - 1.76 0.25 0.33 - 70.11
Daun ginseng - 0.41 3.52 - - 48.91
Krokot - 0.30 - - - 33.46
Tabel 1. Kandungan Senyawa Flavonoid pada Sebelas Sayuran Indigenous
Jawa Barat (mg/100 gram sampel segar)
Ket :
- : Tidak terdeteksi Sumber : Batari (2007)
-
6
B. ASAM FENOLAT (PHENOLIC ACID)
Senyawa asam fenolat mendapatkan perhatian yang lebih dalam beberapa
tahun terakhir ini karena pengaruhnya terhadap kesehatan manusia. Sebagai
polifenol, asam fenolat merupakan antioksidan yang sangat kuat dan memiliki
aktivitas antibakteri, antivirus, antikarsinogenik, antiinflamasi, dan aktivitas
vasodilatory (Duthie et al., 2000). Selain itu asam fenolat juga mempunyai
peranan untuk melindungi dari kanker dan penyakit jantung (Manach, 2004).
Asam fenolat merupakan metabolit sekunder yang sering ditemukan pada
tanaman. Senyawa asam fenolat mempunyai peranan yang penting pada
tumbuhan yaitu sebagai bahan pendukung dinding sel (Wallace dan Fry, 1994).
Asam fenolat membentuk bagian integral pada struktur dinding sel, umumnya
dalam bentuk bahan polymeric seperti lignin, membantu proses mekanik, dan
halangan bagi invasi mikroba. Lignin merupakan senyawa organik yang paling
banyak di bumi setelah selulosa (Wallace dan Fry, 1994). Turunan asam
fenolat terdiri dari dua jenis yaitu asam hidroksibenzoat dan asam
Sampel
Konsentrasi Flavonoid (mg/100 gram sampel segar)
Total Fenol
(mg/100 gram
sampel segar)
Flavonol Flavon
Myricetin Quercetin Kaempferol Luteolin Apigenin
Bunga turi - 2.76 18.47 - - 31.62
Kucai 2.69 4.46 7.65 - - 35.04
Takokak 2.30 0.66 - - - 92.91
Daun kelor - 95.84 20.79 1.32 - 133.59
Pucuk
mengkudu - 23.67 9.75 - - 39.23
Lembayung - 27.35 3.33 - 12.97 49.53
Terubuk - 0.44 - - - 23.73
Mangkokan - 12.67 12.95 - 6.87 74.19
Daun labu
siam 12.49 13.81 9.72 - - 74.27
Bunga papaya - 18.85 5.47 - 11.95 44.47
Pucuk mete 8.28 125.39 9.91 - - 614.72
Pakis - 7.42 2.10 - - 34.57
Antanan beurit 1.57 37.51 10.85 - - 121.06
Tabel 2. Kandungan Senyawa Flavonoid pada Tiga Belas Sayuran
Indigenous Jawa Barat (mg/100 gram sampel segar)
Ket :
- : Tidak terdeteksi Sumber : Rahmat (2009)
-
7
hidroksinamat. Perbedaan kedua turunan dari senyawa asam fenolat ini terletak
pada pola hidroksilasi dan metoksilasi cincin aromatiknya. Struktur kimia
kedua senyawa tersebut dapat dilihat pada Gambar 1. Aktivitas biologis yang
penting pada senyawa benzoat, klorogenat, kafeat, ferulat, dan asam galat
adalah kemampuan aktivitas sitoprotektifnya dan kemampuan dalam
menghambat karsinogenesis, mutagenesis, dan generasi tumor (Birosova,
2005).
Gambar 1. Struktur Kimia : (a) turunan asam benzoat (b) turunan asam
sinamat (Mattila et al., 2002)
Senyawa asam fenolat pada tumbuhan disintesis oleh tumbuhan melalui
jalur Shikimate (Hkkinen, 2000). Jalur shikimate merupakan hasil dari
biosintesis senyawa chorismate yang dapat berfungsi sebagai prekursor
terbentuknya biosintesis senyawa aromatik asam amino triptofan, fenilalanin,
dan tirosin. Jalur shikimate biasa terdapat pada tumbuhan dan mikroorganisme.
Shikimate disintesis dari substrat fosfoenolpiruvat dan eritrosa 4-fosfat. Kedua
prekursor ini merupakan hasil dari jalur glikolisis dan jalur fosfat pentosa dan
mengalami kondensasi menjadi 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate
(DAHP) oleh enzim DAHP synthase. Tahapan selanjutnya yaitu pembentukan
3-dehydroquinate oleh enzim 3-dehydroquinate synthase, 3-dehydroshikimate
oleh enzim 3-dehydroquinate dehydratase, dan terakhir shikimate oleh enzim
shikimate dehydrogenase. Shikimate kemudian dirubah menjadi shikimate 3-
phosphate oleh enzim shikimate kinase, dan setelah itu menjadi 5-
(a)
(b)
-
8
enolpyruvylshikimate 3-phosphate (EPSP) oleh enzim 5-enolpyruvylshikimate
3-phosphate synthase. EPSP kemudian dirubah menjadi chorismate oleh enzim
chorismate synthase. Chorismate adalah cabang untuk membentuk asam amino
aromatik, yaitu triptofan pada bagian yang satu, dan fenilalanin serta tirosin
pada bagian yang lainnya. Jika diperhatikan secara seksama pada bagian akhir
jalur shikimate, biosintesis fenilalanin dan tirosin terdapat pada Gambar 2
karena mereka merupakan prekursor kelas penting yaitu senyawa asam fenolat,
fenilpropanoid, dan beberapa kelas senyawa asam fenolat lainnya. Pada proses
ini membutuhkan perubahan chorismate menjadi prephenate yang dikatalisis
oleh chorismate mutase dan arogenate yang dikatalisis oleh prephenat
aminotransferase. Enzim arogenate dehydratase merubah arogenate menjadi
fenilalanin, sedangkan enzim arogenate dehydrogenase menghasilkan tirosin.
Jalur biosintesis shikimate (Shikimate Pathway) pada tumbuhan dapat dilihat
pada Gambar 2.
Pembentukan asam hidroksinamat (kafeat, ferulat, 5-hydroxyferrulic, dan
asam sinapat) dari asam p-koumarat membutuhkan dua jenis reaksi yaitu
hidroksilasi dan metilasi. Adanya pelekatan Gugus Hidroksil pada asam p-
koumarat akan membentuk asam kafeat (Gambar 3), pembentukan ini
dikatalisis oleh monophenol mono-oxygenases, grup enzim tanaman yang
sudah sangat terkenal (Macheix et al., 1990). Metilasi pada asam kafeat akan
membentuk asam ferulat, yang bersamaan dengan asam p-koumarat,
merupakan prekursor lignin (Gambar 3). Metilasi ini dikatalisis oleh
omethyltransferase (Macheix et al., 1990). Asam kafeat merupakan substrat
untuk 5-hydroxyferrulic acid, yang akan menghasilkan asam sinapat sebagai
hasil dari o-metilasi.
Pembentukan turunan asam hidroksinamat membutuhkan pembentukan
hydroxycinnamte-CoAs, contoh p-coumaroyl-CoA dikatalisis oleh
hydroxycinnamoyl-CoA ligase atau oleh oglycosyl transferase.
hydroxycinnamate-CoAs masuk kedalam berbagai macam reaksi
phenylpropanoid. (Gambar 3), seperti kondensasi dengan malonyl-CoA
membentuk flavonoid atau reduksi NADPH-dependent membentuk lignin.
Selain itu hydroxycinnamate-CoAs dapat berkonjugasi dengan asam organik
-
9
(Strack, 1997). Di biosintesis turunan gula asam hidroksinamat, transfer
glukosa dari uridine diphosphoglucose menjadi asam hidroksinamat dikatalisis
oleh glucosyl transferase (Strack, 1997).
Gambar 2. Jalur shikimate (Vermerris dan Nicholson, 2006)
Ket:
Enzim yang terlibat dalam jalur shikimate yaitu: (a) DAHP synthase (E.C. 2.5.1.54), (b) 3-dehydroquinate synthase (E.C. 4.2.3.4), (c) 3-dehydroquinate dehydratase (E.C. 4.2.1.10), (d) shikimate dehydrogenase (E.C. 1.1.1.25), (e) shikimate kinase (E.C 2.7.1.71), (f) 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (E.C. 2.5.1.19), (g) chorismate synthase (E.C. 4.2.3.5), (h) chorismate mutase (E.C. 5.4.99.5), (i) prephenate aminotransferase (E.C. 2.6.1.78 and E.C. 2.6.1.79), (j) arogenate dehydratase (E.C. 4.2.1.91), dan (k) arogenate dehydrogenase (E.C. 1.3.1.43, E.C. 1.3.1.78, E.C. 1.3.1.79).
-
10
Banyak jalur untuk biosintesis asam hidroksibenzoat pada tanaman, jalur
pembentukan ini tergantung dari jenis tanamannya. Asam hidroksibenzoat
dapat dibentuk dari jalur shikimate (Gambar 3), terutama dari dehydroshikimic
acid. Reaksi ini merupakan reaksi utama untuk pembentukan gallic acid
(Haddock et al., 1982). Selain itu asam hidroksibenzoat juga dapat dibentuk
melalui degradasi asam hidroksinamat, sama seperti proses oksidasi pada
asam lemak, senyawa antaranya yaitu cinnamoyl-CoA esters (Macheix et al.,
1990) (Gambar 3). Asam hidroksibenzoat dapat juga dibentuk melalui
degradasi senyawa flavonoid (Strack, 1997). Penjelasan lebih detail mengenai
proses pembentukan hidroksibenzoat, hidroksinamat, dan flavonoid melalui
jalur shikimate dapat dilihat pada Gambar 3. Senyawa asam klorogenat
merupakan senyawa ester dari gabungan senyawa asam kafeat dan senyawa
quinic acids. Secara ringkas pembentukan asam klorogenat dapat dilihat pada
Gambar 4.
Asam hidroksibenzoat pada tumbuhan biasanya terdapat dalam bentuk
terikat. Asam hidroksibenzoat merupakan komponen struktur kompleks seperti
lignin dan tannin yang dapat dihidrolisis (Shahidi et al., 1995). Asam
hidroksibenzoat juga ditemukan dalam bentuk asam organik dan turunan gula
(Schuster dan Herrmann, 1985). Secara umum kandungan asam
hidroksibenzoat di dalam tumbuhan rendah kecuali blackberry, raspberry
(Morsel dan Herrmann, 1974), black currant, red currant (Stohr dan
Herrmann, 1975a), dan strawberry (Stohr dan Herrmann, 1975b). Senyawa
hidroksibenzoat banyak terdapat pada sayuran seperti bawang (Schmidtlein dan
Herrmann, 1975a) dan horseradish (Schmidtlein dan Herrmann, 1975b),
dengan komponen asam hidroksibenzoat yang dominan yaitu senyawa
protocatechuic, p-hydroxybenzoic, dan gallic acid.
Asam hidroksinamat banyak terdapat di dalam bahan pangan yang
berasal dari tumbuh-tumbuhan. Asam hidroksinamat biasanya terdapat dalam
bentuk terikat dan jarang ditemukan dalam bentuk bebasnya. Proses
pengolahan buah dan sayuran dengan (Azar et al., 1987), sterilisasi (Rivas dan
Luh, 1968) dan fermentasi dalam pembuatan anggur (Singleton, 1980)
berkontribusi dalam pembentukan asam hidroksinamat bebas di dalam produk.
-
11
Keterangan:
: Reaksi yang dikatalisis oleh satu jenis enzim
: Reaksi yang dikatalisis oleh lebih dari satu jenis enzim
CA4H : cinnamic acid 4-hydroxylase
CHS : chalcone synthase
4CL : 4-coumarate: coenzyme a ligase
PAL : phenylalanine ammonialyase
Gambar 3. Biosintesis hidroksibenzoat, hidroksinamat, dan flavonoid (Hkkinen,
2000)
-
12
Gambar 4. Biosintesis asam klorogenat (Cadenas dan Packer, 2002)
Senyawa asam kafeat merupakan asam hidroksinamat yang banyak
ditemukan pada buah-buahan. Asam kafeat banyak ditemukan pada plums,
apel, apricots, blueberries, dan tomat dengan kandungan asam kafeat lebih dari
75 %. Senyawa asam p-koumarat merupakan senyawa asam hidroksinamat
yang banyak terdapat pada buah sitrus dan nanas (Macheix et al., 1989).
Mattila dan Hellstrm (2007) menambahkan bahwa senyawa asam
hidroksinamat yang banyak ditemukan yaitu kafeat, p-koumarat, dan asam
ferulat, biasanya terdapat di bahan pangan dalam bentuk ester sederhana
dengan quinic acid atau glukosa. Bentuk terikat dari senyawa asam
hidroksinamat ditemukan dalam bentuk ester asam hidroksinamat yaitu quinic,
-
13
shikimic, tartaric acids, dan senyawa turunan gulanya. Mattila dan Hellstrm
(2007) menambahkan bahwa asam hidroksinamat yang terkenal dalam bentuk
terikat yaitu asam klorogenat yang merupakan gabungan dari asam kafeat dan
quinic acids. Sedangkan menurut hasil penelitian (Sakakibara et al., 2003)
senyawa asam fenolat yang banyak terdapat pada sayuran yaitu asam ferulat,
asam kafeat, dan asam klorogenat.
C. IDENTIFIKASI SENYAWA ASAM FENOLAT
Analisis kimia dengan metode kromatografi didasarkan pada pemisahan
komponen yang terpartisi diantara dua fase dalam suatu kesetimbangan
dinamis dan mengalir. Proses ini dilakukan dengan menggerakkan suatu fase
secara mekanis (fase gerak), relatif terhadap fase lainnya.
Secara teori pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh
jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya, sehingga
memastikan kesetimbangan yang baik antar fase. Persyaratan kedua agar
pemisahan baik adalah fase gerak harus bergerak dengan cepat sehingga difusi
sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, pada
sebagian besar sistem kromatografi digunakan penjerap atau penyangga berupa
serbuk halus. Untuk memaksa fase gerak bergerak lebih cepat melalui fase
diam yang terbagi pada serbuk halus harus digunakan tekanan tinggi. Dengan
dipenuhinya kedua persayaratan tersebut, diperoleh teknik kromatografi cair
yang paling kuat yakni HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Jadi pada HPLC fase gerak dialirkan dengan cepat dan hasilnya dideteksi
dengan instrumen.
Komponen utama dari sistem HPLC adalah pompa (tekanan tetap dan
volume tetap), penginjeksi, kolom (ekternal dan internal), detektor, dan
rekorder atau sistem data yang terintegrasi (Rounds dan Gregor, 2003).
Parameter-parameter yang akan mempengaruhi sistem kerja pada HPLC antara
lain diameter dari kolom HPLC, ukuran partikel, ukuran lubang pada fase
diam, dan tekanan pompa.
Terdapat lima tipe HPLC yaitu normal phase chromatography, reversed
phase chromatography, ion-exchange chromatography, size-exclusion
-
14
chromatography, dan affinity chromatography (Rounds dan Gregor, 2003).
Pada penelitian ini, tipe HPLC yang digunakan adalah reversed phase
chromatography (RP-HPLC). Fase diam dari HPLC jenis ini adalah senyawa
nonpolar, sedangkan fase geraknya polar. Karena hal tersebutlah maka
komponen yang akan keluar dahulu adalah komponen yang polar dibandingkan
yang nonpolar.
Lebih dari 70% teknik pemisahan dengan metode HPLC menggunakan
tipe reversed phase. Beberapa contoh teknik pemisahan yang menggunakan
metode RP-HPLC adalah analisis protein dari tanaman, protein dari biji-bijian,
analisis vitamin larut air dan larut lemak, pemisahan karbohidrat, dan
penentuan unsur-unsur pokok dari minuman ringan. reversed phase HPLC
dengan metode deteksi yang sangat bervariasi, digunakan untuk menganalisis
lemak (Rounds dan Gregor, 2003).
Antioksidan, seperti butylated hydroxylanisole (BHA) dan butylated
hydroxytoluene (BHT), dapat diekstrak dari bahan pangan kering dan dianalisis
dengan menggunakan detektor UV dan fluoresens secara bersamaan. Bahan
pangan basah, pigmen (seperti klorofil, karotenoid, dan antosianin), dan
komponen Asam Fenolat (seperti vanili) dapat pula dianalisis dengan
menggunakan metode RP-HPLC (Rounds dan Gregor, 2003).
Kolom reversed phase chromatography lebih sulit untuk rusak
dibandingkan dengan kolom silika normal. Hal ini dikarenakan kolom RP-
HPLC terdiri atas alkil turunan silika dan tidak pernah digunakan dengan
larutan basa (karena larutan basa akan menghancurkan ikatan silika). Kolom
RP-HPLC dapat digunakan dengan larutan asam tetapi tidak boleh kontak
terlalu lama karena asam dapat menimbulkan korosi pada logam yang ada
dalam peralatan HPLC. Kandungan logam pada kolom HPLC harus dijaga agar
tetap rendah supaya dapat memberikan hasil terbaik pada pemisahan
komponen. Salah satu cara untuk mengetahui kandungan logam di dalam
kolom HPLC adalah dengan menginjeksikan campuran dari 2,2- dan 4,4-
bipiridin. Bila terdapat ion logam di permukaan silika, maka senyawa 2,2-
bipiridin akan mengkelat logam tersebut dan peak dari senyawa yang akan
-
15
diidentifikasi menjadi tidak teratur sehingga dapat memberikan hasil yang
tidak sesuai.
Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendeteksi komponen fenolik
dalam bahan pangan dengan metode HPLC. Komponen fenolik merupakan
senyawa aromatik, oleh karena itu, senyawa tersebut akan memberikan
penyerapan yang baik pada panjang gelombang sinar UV. Asam fenolat
merupakan bagian dari senyawa fenolik. Panjang gelombang yang digunakan
untuk menentukan komponen asam fenolat yaitu 290 nm untuk asam kafeat,
asam ferulat, dan asam klorogenat. (Singh et al., 2008). Fase gerak yang
digunakan dalam identifikasi senyawa asam fenolat dengan HPLC adalah
metanol-0.4% asam asetat (80:20, v/v) (Singh et al., 2008).
Pemisahan senyawa asam fenolat dilakukan menggunakan kolom RP C-
18 (4.6 x 150 mm, 5m) dengan kolom guard C-18. Fase gerak yang
digunakan yaitu metanol-0.4% asam asetat (80:20, v/v), laju alir 1 mL/menit,
panjang gelombang 290 nm, dan kondisi isokratik (Singh et al., 2008).
Keuntungan utama dari HPLC adalah kemampuannya untuk menangkap
komponen dengan stabilitas panas yang terbatas ataupun yang bersifat volatil.
HPLC merupakan metode yang sangat sensitif, tepat, selektif, dan memiliki
tingkat otomatisasi yang tinggi, sehingga lebih sederhana dalam
pengoperasiannya. Di samping itu, HPLC banyak digunakan untuk analisis
karena kemudahan injeksi, deteksi, dan pengolahan data serta dapat digunakan
untuk berbagai macam sampel seperti sampel cairan, padatan yang dilarutkan,
maupun sampel yang labil terhadap pemanasan. Modern HPLC telah banyak
diaplikasikan seperti pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan penghitungan
komponen yang bervariasi.
-
16
III. BAHAN DAN METODE
A. BAHAN DAN ALAT
1. Bahan
Bahan-bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah bahan
untuk membuat larutan standar asam fenolat, bahan untuk membuat ekstrak
sayuran indigenous, dan bahan untuk analisis kimia. Bahan-bahan yang
digunakan dalam pembuatan larutan standar adalah standar asam kafeat
(Sigma-Aldrich), standar asam ferulat (Sigma-Aldrich), dan standar asam
klorogenat (Sigma-Aldrich), water for chromatography (MERCK), dan
methanol HPLC grade (MERCK).
Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan ekstrak sayuran
adalah dua puluh empat jenis sayuran indigenous Indonesia yang berasal
dari provinsi Jawa Barat yaitu kenikir, kecombrang, kemangi, katuk,
pohpohan, ginseng, takokak, lembayung, terubuk, labu siam, pepaya, mete,
pakis, beluntas, mangkokan putih, mangkokan, kendondong cina, antanan,
antanan beurit, krokot, turi, kelor dan mengkudu. Bagian yang digunakan
dalam penelitian ini bisa berupa daun, batang, dan seluruh bagian tanaman,
methanol (MERCK), BHA (Sigma-Aldrich), asam asetat (MERCK), dan
aquadest. Kedua puluh empat jenis sayuran tersebut telah berhasil
diidentifikasi oleh pihak Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat
Penelitian Biologi-LIPI Bogor dengan Kepala Bidang Botani LIPI adalah
Dr. Eko Baroto Walujo, APU. Tabel 3 menunjukkan secara lengkap kedua
puluh empat jenis sayuran indigenous Indonesia yang berasal dari provinsi
Jawa Barat, bagian yang digunakan dalam penelitian, serta daerah tempat
asal sayuran indigenous tersebut diperoleh.
Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis kimia adalah methanol
(MERCK), asam asetat (MERCK), alufo, water for chromatography
(MERCK), folin ciocalteu (MERCK), Na2CO3 (MERCK), aquadest, standar
asam galat (Sigma-Aldrich), dan etanol (MERCK).
-
17
Tabel 3. Dua Puluh Empat Jenis Sayuran Indigenous Indonesia
Spesies Nama
Indonesia
Bagian yang
digunakan Sumber
Morinda citrifolia L. Mengkudu Daun Muda Kebun Petani
Dramaga
Nothopanax scutellarius (Burm.f.)
Merr. Mangkokan Daun Muda
Kebun Petani
Dramaga
Sechium edule (Jacq.) Swartz. Labu Siam Daun Muda Pasar Bogor
Vigna unguiculata (L.) Walp. Lembayung Daun Muda Pasar Bogor
Sauropus androgynus (L.) Merr. Katuk Daun Muda Pasar Bogor
Ocimum americanum L. Kemangi Daun Muda Pasar Bogor
Arcypteris irregularis (C.Presl)
Ching Pakis Daun Muda Pasar Bogor
Pilea melastomoides Pohpohan Daun Muda Pasar Bogor
Carica papaya L. Pepaya Bunga Pasar Bogor
Nothopanax scutellarium (Burm.f.)
Fosb.
Mangkokan
Putih Daun Muda
Kebun Petani
Dramaga
Cosmos caudatus H.B.K. Kenikir Daun Muda Pasar Bogor
Moringa pterygosperma Gaertn. Kelor Daun Muda Kebun Petani
Dramaga
Allium schoenoprasum L. Kucai Seluruh Bagian Pasar Bogor
Anacardium occidentale L. Jambu Mete Daun Muda Pasar Bogor
Solanum torvum Swartz. Takokak Buah Pasar Bogor
Centelia asiatica (L.) Urb. Antanan Seluruh Bagian Kebun Petani
Dramaga
Portulaca oleracea L. Krokot Daun dan
Batang
Kebun Petani
Dramaga
Hydrocotyle sibthorpioides Lmk. Antanan Beurit Seluruh Bagian Kebun Petani
Dramaga
Talinum triangulare (Jacq.) Willd. Ginseng Daun Muda Pasar Bogor
Etlingera elatior (Jack) R.M.Sm. kecombrang Bunga Pasar Bogor
Pluchea indica (L.) Less. Beluntas Daun Muda Kebun Petani
Dramaga
Sesbania grandiflora (L.) Pers. Turi Bunga Kebun Petani
Dramaga
Saccharum edule Hassk Terubuk Bunga Pasar Bogor
Polyscias pinnata Kedondong
cina Daun Muda
Kebun Petani
Dramaga
-
18
2. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat untuk
membuat larutan standar, ekstrak sayuran, dan analisis. Pada pembuatan
larutan standar alat-alat yang digunakan adalah labu takar, gelas ukur, pipet
mohr, pipet tetes, neraca analitik, dan spatula. Alat-alat yang digunakan
untuk membuat ekstrak sayuran adalah freezer, blender, freeze dryer, Buchi
Rotavapor, neraca analitik, blender kering, labu takar, gelas piala, gelas
ukur, pipet mohr, pipet tetes, spatula, baskom, botol gelap, ultrasonic
Branson 3510,VELP Scientific vortex, IEC Centra-8 centrifuge, dan pisau.
Pada proses analisis, alat-alat yang digunakan adalah High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) UV Vis Hewlet Packard Agilent 1100
series. Kolom HPLC RP C-18 (4.6 x 150 mm, 5m), alat injektor sampel
HPLC, filter syringe 0.45m (PTFE), vial, oven, neraca analitik, desikator,
VELP Scientific vortex, labu takar, gelas piala, tabung reaksi, spatula,
gegep, ultrasonic Branson 3510, Shimadzu UV-2450 UV Vis
spectrophotometer, IEC Centra-8 centrifuge, dan cawan alumunium.
B. METODE
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu persiapan sampel,
pembuatan kurva standar dan Limit of Detection (LOD), analisis asam fenolat
dengan HPLC, serta analisis statistik. Analisis asam fenolat dengan HPLC
dilakukan secara dua ulangan duplo.
1. Persiapan Sampel
Mula-mula sampel dicuci sampai bersih, kemudian ditiriskan.
Selanjutnya sayuran dibekukan dalam freezer selama satu malam untuk
memudahkan proses pengeringan vakum. Waktu pengeringan dengan freeze
dryer dapat berlangsung selama satu sampai dua hari tergantung dari
banyaknya sampel. Setelah sampel kering, dilakukan penghancuran
menggunakan blender kering sampai dihasilkan sampel kering bubuk yang
lolos ayakan 32 mesh. Sampel tersebut kemudian dikemas dalam plastik
ber-seal dan disimpan dalam freezer. Sampel siap untuk digunakan dalam
-
19
ekstraksi. Tahap persiapan sampel dapat dilihat pada Gambar 5. Selanjutnya
dilakukan analisis kadar air dan total fenol pada sampel. Analisis kadar air
dilakukan secara satu ulangan duplo sedangkan analisis total fenol
dilakukan secara dua ulangan duplo.
Analisis Kadar Air menggunakan metode yang dikembangkan oleh
AOAC (1984). Penetapan kadar air merupakan cara untuk mengukur
banyaknya air yang terdapat di dalam suatu bahan pangan. Analisis kadar air
dilakukan pada sampel sayuran segar (awal) dan pada sampel sayuran
setelah freeze drying. Penentuan kadar air ini dilakukan dengan metode
pengeringan dengan oven biasa. Prinsip dari metode ini adalah air
dikeluarkan dari sampel dengan cara menguapkan air yang terdapat dalam
bahan pangan.
Persiapan yang perlu dilakukan adalah cawan alumunium yang akan
digunakan terlebih dahulu dikeringkan dalam oven pada suhu 100oC selama
15 menit kemudian didinginkan dalam desikator Selama 10 menit.
Selanjutnya cawan ditimbang dengan menggunakan neraca analitik. Sampel
ditimbang sebanyak kurang lebih 5 gram kemudian dikeringkan dalam oven
selama kurang lebih 6 jam. Setelah itu didinginkan dalam desikator
kemudian ditimbang. Sampel kembali dikeringkan dalam oven selama 30
menit lalu ditimbang kembali. Perlakuan terakhir ini diulangi terus hingga
diperoleh berat kering yang relatif konstan (berat dianggap konstan jika
selisih berat sampel kering yang ditimbang 0,0003 gram).
W = bobot contoh sebelum dikeringkan (g)
W1 = bobot (contoh + cawan) sesudah dikeringkan (g)
W2 = bobot cawan kosong (g)
Analisis Total Fenol menggunkan metode yang dikembangkan oleh
Shetty et al. (1995) yang dikutip oleh Ishartani (2004). Penentuan total fenol
bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fenol pada sampel. Sampel
kering beku bubuk mula-mula diambil sebanyak 50.0 mg dan dilarutkan
Kadar air (%) = W - (W1-W2) x 100%
W
-
20
dalam 2.5 mL etanol 95%, kemudian divorteks. Setelah itu dilakukan
sentrifuse terhadap campuran tersebut selama 5 menit dengan kecepatan
putaran 358 g. Supernatan diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke
dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 0.50 mL etanol 95%, 2.5 mL
aquadest, dan 2.5 mL reagen folin ciocalteu 50%. Campuran tersebut
didiamkan dahulu selama 5 menit, lalu ditambahkan 0.5 mL Na2CO3 5%
dan divorteks. Setelah itu, sampel disimpan dalam ruang gelap selama satu
jam, lalu dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 725 nm. Prosedur penentuan total fenol dapat dilihat secara
ringkas pada Gambar 6. Standar yang digunakan dalam penentuan total
fenol adalah asam galat yang dibeli dari Sigma-Aldrich. Standar asam galat
dibuat dengan variasi konsentrasi antara 50 250 mg/L.
2. Pembuatan Kurva Standar dan Limit of Detection (LOD)
a. Pembuatan larutan Standar (Mattila dan kumpulainen, 2002)
Sebanyak 24 mg standar yang tersedia dilarutkan dalam 12 mL methanol
62.5%, sehingga diperoleh standar stock dengan konsentrasi 2000
g/mL. selanjutnya diambil 3.125 mL dari standar stock dimasukan ke
dalam labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan methanol 62.5% hingga
volume mencapai 10 mL, sehingga konsentrasi yang diperoleh adalah
625 g/mL. Setelah itu dibuat larutan standar campuran dengan cara
mencampur ketiga standar yang ada. Volume untuk larutan standar yang
dicampur sama besar yaitu 1:1 (v/v). Larutan standar campuran yang
digunakan dalam penelitian ini terdiri atas lima konsentrasi, yaitu 125,
250, 375, 500, dan 625 g/mL. Pembuatan larutan standar campuran
dengan konsentrasi 125, 250, 375, 500, dan 625 g/mL dilakukan dengan
melakukan pengenceran dari larutan standar campuran yang memiliki
konsentrasi 625 g/mL. Proses pembuatan larutan standar yang
dibutuhkan pada penelitian ini dapat dilihat secara ringkas pada Gambar
10.
-
21
b. Injeksi larutan standar ke kolom HPLC (Singh et al., 2008).
Larutan standar campuran dengan berbagai konsentrasi tersebut
diinjeksikan ke dalam kolom RP C-18 (4.6 x 150 mm, 5m) dengan
kolom guard C-18. Fase gerak yang digunakan yaitu metanol-0.4%
asam asetat (80:20, v/v), laju alir 1 mL/menit, volume yang diinjeksikan
20 l, panjang gelombang 290 nm, dan kondisi isokratik.
c. Pembuatan kurva standar
Hasil dari kromatogram standar campuran pada berbagai konsentrasi
(125, 250, 375, 500, dan 625 g/mL ) kemudian dimasukkan ke dalam
satu grafik. Dari data masing-masing, dibuat persamaan garis untuk
masing-masing standar yang akan digunakan pada perhitungan Limit of
Detection (LOD) masing-masing standar. Persamaan garis tersebut juga
digunakan pada perhitungan komponen asam fenolat yang terdapat di
sampel.
d. Perhitungan limit deteksi (Rounds dan Nielsen, 2000)
Limit of Detection (LOD) atau limit deteksi diperoleh dengan cara
menginjeksikan standar campuran sebanyak sepuluh kali. Konsentrasi
yang digunakan untuk menentukan LOD adalah konsentrasi yang
terendah yaitu 125 g/mL. Setelah diperoleh kesepuluh area tersebut,
dimasukkan kedalam persamaan kurva standar masing-masing, sehingga
diperoleh konsentrasi dan standar deviasinya. Besarnya LOD adalah tiga
kali dari nilai standar deviasi.
3. Analisis Asam Fenolat pada Sayuran
a. Ekstraksi Senyawa Asam Fenolat dari Sayuran Indigenous (Mattila dan Kumpulainen, 2002) dengan modifikasi
Ekstraksi senyawa asam fenolat dari sayuran indigenous Indonesia
melalui tiga tahap yaitu tahap pertama pengekstrakan dengan methanol
62.5%, tahap kedua hidrolisis basa, dan tahap ketiga hidrolisis asam.
Tahap pertama yaitu pelarutan sebanyak 0.5 gram sampel kering beku ke
dalam 7 mL methanol 62,5% yang mengandung 10% asam asetat
(85:15;v/v) dan 2 g/L BHA sebagai antioksidan. Kemudian divortex agar
campuran homogen. Selanjutnya sampel tersebut di ultrasonik selama 30
-
22
menit. Kemudian volume sampel dibuat menjadi 10 mL dengan cara
menambahkan air destilata (aquadest) ke dalamnya. Setelah itu diambil 1
mL sampel, kemudian disaring dengan penyaring berdiameter 0.45m
filter syringe (PTFE) maka didapatkan asam fenolat yang larut (soluble
phenolic acid) dan sampel tersebut siap untuk diinjeksikan ke dalam
kolom HPLC. Tahap kedua adalah hidrolisis basa, 9 mL sampel sisa
pengekstrakan tahap pertama dilanjutkan dengan proses hidrolisis basa.
Hasil ekstrak sampel dari hidrolisis basa merupakan insoluble phenolic
acid. Selanjutnya hasil ekstrak tersebut diinjeksikan ke kolom HPLC.
Tahap ketiga ialah hidrolisis asam, tahapan ini melanjutkan tahap kedua
yaitu melakukan proses hidrolisis asam pada lapisan aqueous hasil
pengekstrakan dengan tahap kedua. Hasil pengekstrakan tahap ketiga ini
merupakan insoluble phenolic acid yang tahan proses hidrolisis basa.
Setelah itu hasil pengekstrakan diinjeksikan ke kolom HPLC. Hidrolisis
basa dan asam dilakukan karena asam fenolat berada dalam bentuk
terikat, dengan demikian fungsi dari hidrolisis basa dan asam di sini
untuk membebaskan asam fenolat tersebut dari berbagai senyawa lainnya
yang ada di tanaman. Setelah dapat maka sampel siap untuk diinjeksikan
ke kolom HPLC. Pada proses awal pengujian ekstrak sampel sayuran
melalui ketiga tahapan ekstraksi menunjukkan bahwa senyawa asam
fenolat yang diinginkan (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat)
terdapat pada ekstrak sampel yang menggunakan tahapan ekstraksi tahap
pertama tanpa dilanjutkan ke tahap kedua dan ketiga. Oleh karena itu
proses penelitian selanjutnya hanya menggunakan tahapan ekstraksi
tahap pertama saja. Prosedur ekstraksi asam fenolat dari sayuran
indigenous dapat dilihat pada Gambar 7. Adapun prosedur hidrolisis basa
dan hidrolisis asam dapat dilihat pada Gambar 8 dan 9.
. b. Injeksi ekstrak sampel ke kolom HPLC (Singh et al., 2008).
Ekstrak sampel yang telah disaring dengan syringe filter 0.45 m,
diinjeksikan ke dalam kolom RP C-18 (4.6 x 150 mm, 5m) dengan
kolom guard C-18. Fase gerak yang digunakan yaitu metanol-0.4% asam
-
23
asetat (80:20, v/v), laju alir 1 mL/menit, volume yang diinjeksikan 20 l,
panjang gelombang 290 nm, dan kondisi isokratik.
c. Pembuatan Ko-kromatogram
Pembuatan ko-kromatogram dilakukan dengan cara menginjeksikan
ektrak sampel yang telah ditambahkan standar campuran. Volume
pencampuran yang digunakan yaitu 1:1 (v/v). Konsentrasi standar
campuran yang digunakan adalah konsentrasi tertinggi yaitu 625 g/mL.
Pembuatan ko-kromatogram ini bertujuan memvalidasi keberadaan
senyawa asam fenolat yang diinginkan (asam klorogenat, asam kafeat,
dan asam ferulat) pada sampel. Standar campuran yang digunakan untuk
membuat ko-kromatogram berfungsi sebagai eksternal standar.
d. Identifikasi asam fenolat pada sampel
Hasil dari kromatogram sampel kemudian dibandingkan dengan
kromatogram standar campuran. Penentuan komponen yang terdapat
pada sampel dilihat berdasarkan waktu retensi masing-masing standar.
Dari area yang diperoleh, dihitung konsentrasinya dengan menggunakan
persamaan garis dari kurva standar campuran yang sudah diperoleh.
Selain itu dilakukan pula perhitungan dengan menggunakan eksternal
standar, yaitu dengan membandingkan luas area komponen pada sampel
dengan luas area pada standar campuran. Standar campuran yang
digunakan sebagai eksternal standar adalah standar campuran dengan
konsentrasi yang tertinggi (625 g/mL).
4. Analisis Statistik
Analisis statistik yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari uji
Tukey, uji T, dan Principal Component Analysis (PCA). Uji Tukey
digunakan pada taraf 5% untuk melihat apakah perlakuan yang diberikan
pada sampel berpengaruh nyata atau tidak. Uji T digunakan untuk
membandingkan perhitungan kandungan asam fenolat antara kurva standar
campuran dan eksternal standar campuran pada sampel pada taraf 1%. PCA
(Principal Component Analysis) merupakan metode statistik yang dapat
mengidentifikasi suatu keragaman dinamakan principal component analysis
-
24
yang dapat menjelaskan jumlah keragaman dari yang terbesar hingga yang
jumlah keragaman terkecil yang tersembunyi. Analisis ini dapat
menjelaskan 75 % - 90 % dari total keragaman dalam data yang mempunyai
25 sampai 30 variabel hanya dengan dua sampai tiga principal component
(Meilgaard et al., 1999).
Gambar 5. Persiapan sampel
Penyimpanan dalam freezer
Sampel kering beku (bubuk)
Sampel
Pencucian
Penghancuran dengan blender kering
Freeze drying selama 48 jam
Sampel kering beku
Pembekuan selama 24 jam
Penirisan
-
25
Gambar 6. Prosedur analisis total fenol
endapan
50.0 miligram sampel
kering beku (bubuk)
0.5 ml supernatan
supernatan
Pelarutan
Pemusingan selama 5 menit
dengan kecepatan 358 g
2.5 ml
etanol 95%
0.5 ml etanol 95%
2.5 ml Folin
Ciocalteau 50%
2.5 ml aquadest
0.5 ml
Na2CO3 5%
Pencampuran
Pendiaman selama 5 menit
Pencampuran
Penyimpanan dalam ruang
gelap selama 1 jam
Pembacaan absorbansi dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 725 nm
-
26
Gambar 7. Metode ekstraksi asam fenolat dari sayuran indigenous
9 ml sampel sisanya dilakukan
Hidrolisis basa (Tahap 2)
kemudian hidrolisis asam (Tahap 3)
Ambil 1 ml sampel (Tahap 1)
Soluble Phenolic
Acid
Insoluble
Phenolic Acid
(Pencampuran sampai volume 10 ml)
7 ml Campuran
Metanol 62.5%
(2 g/L BHA 10%
Asam Asetat
(85:15;v/v))
0.5 g sampel
kering beku
Gelas piala
100 ml
Vortex
Ultrasonik 30 menit
Gelas piala
100 ml Aquadest
Saring dengan saringan
berdiameter 0.45m
syringe filter (PTFE)
-
27
Gambar 8. Metode hidrolisis basa
Ditutup, Stirer (magnetic stirer) selama 16 jam pada suhu ruangan (20 oC)
Pemipetan lapisan organic phase (supernatan)
12 ml Air destilata
(1% Asam
Askorbat dan
0.415% EDTA) dan
5 ml NaOH 10 M
Sentrifuse 201 g selama 10 menit
Pengekstrakan 3x (15 ml campuran dietil eter dingin dan etil asetat (1:1;v/v))
Vortex 45 detik
Pengaturan pH menjadi pH 2 dengan HCl 6N
Terdapat 2 lapisan yaitu lapisan organic phase dan aqueous
Lakukan hidrolisis asam
pada lapisan aqueous
Evaporasi dengan rotary vacuum
Residu dilarutkan kembali sebanyak 3kali
dalam 1.5 ml metanol/air (75:25;v/v), buat
sampai volume 5 ml (labu takar)
penyaringan dengan diameter 0.45m Syringe
Filter (PTFE)
Gelas
piala 50
ml
9 ml
sampel
Disemprotkan nitrogen
Insoluble Phenolic Acid
-
28
Gambar 9. Metode hidrolisis asam
Pemipetan lapisan organic phase (supernatan)
Lapisan aqueous
Gelas piala
50 ml 2.5 ml HCl
pekat 12 N
Pengekstrakan 3x (15 ml campuran dietil eter dingin dan etil asetat (1:1;v/v))
Sentrifuse 201 g selama 10 menit
Inkubasi dalam water bath suhu 85oC selama 30 menit
Vortex 45 detik
Terdapat 2 lapisan yaitu lapisan organic phase dan aqueous
residu (lapisan
aqueous)
Evaporasi dengan rotary vacuum
Residu dilarutkan kembali sebanyak 3kali
dalam 1.5 ml metanol/air (75:25;v/v), buat
sampai volume 5 ml (Labu takar)
penyaringan dengan diameter 0.45m Syringe
Filter (PTFE)
Insoluble Phenolic Acid
-
29
Gambar 10. Metode pembuatan standar asam fenolat
24 mg standar
asam fenolat
Pelarutan
12 ml MeOH(aq)
62.5%
Standar stock
MeOH(aq)
62,5%
3.125 ml
standar stock
Larutan standar
asam fenolat
Pencampuran
(sampai volume 10 ml)
Labu takar 10 ml
-
30
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. KURVA STANDAR ASAM FENOLAT DAN LIMIT DETEKSI
1. Standar Asam Fenolat Bentuk Tunggal
Pembuatan standar asam fenolat dalam bentuk tunggal ditujukan
untuk mengetahui waktu retensi dari masing-masing standar asam fenolat
sehingga dapat diketahui benar kapan munculnya senyawa yang
diidentifikasi. Konsentrasi yang digunakan dalam pembuatan standar
tunggal ini yaitu 625 g/mL untuk masing-masing standar asam fenolat.
Hasil penginjeksian masing-masing standar asam fenolat yang digunakan
dijelaskan sebagai berikut:
a. Asam klorogenat
Puncak senyawa asam klorogenat muncul pada kisaran menit ke-2.0
sampai menit ke-2.2. Gambar 11 menunjukkan kromatogram standar
asam klorogenat pada konsentrasi 625 g/mL dengan analisis HPLC.
Gambar 11. Kromatogram standar asam klorogenat dengan
analisis HPLC
-
31
b. Asam kafeat
Puncak senyawa asam kafeat muncul pada kisaran menit ke-2.8 sampai
ke-3.2. Gambar 12 menunjukkan kromatogram asam kafeat pada
konsentrasi 625 g/mL dengan analisis HPLC.
Gambar 12. Kromatogram standar asam kafeat dengan analisis HPLC
c. Asam ferulat
Puncak senyawa asam ferulat muncul pada kisaran menit ke-6.7 sampai
ke-7.3. Gambar 13 menunjukkan kromatogram asam ferulat pada
konsentrasi 625 g/mL dengan analisis HPLC.
]
Gambar 13. Kromatogram standar asam ferulat dengan analisis
HPLC
-
32
2. Limit Deteksi
Perhitungan limit deteksi dilakukan dengan cara menginjeksikan standar
campuran sebanyak sepuluh kali. Konsentrasi yang digunakan untuk
menentukan LOD adalah konsentrasi yang terendah yaitu 125 g/mL.
Setelah diperoleh kesepuluh area tersebut, dimasukkan kedalam persamaan
kurva standar masing-masing, sehingga diperoleh konsentrasi dan standar
deviasinya. Besarnya LOD adalah tiga kali dari nilai standar deviasi
(Rounds dan Nielsen, 2000). Berikut ini hasil perhitungan LOD untuk
masing-masing standar asam fenolat.
a. Asam klorogenat
Nilai limit deteksi senyawa asam klorogenat yaitu 0.97 (g/mL) . untuk
lebih jelas mengenai cara perhitungannya lihat Tabel 4.
b. Asam kafeat
Nilai limit deteksi senyawa asam kafeat yaitu 0.83 (g/mL) . untuk lebih
jelas mengenai cara perhitungannya lihat Tabel. 5
replication Area (g/mL)
1 5486.82 126.67
2 5474.69 126.38
3 5455.19 125.92
4 5477.87 126.46
5 5461.85 126.08
6 5444.66 125.67
7 5470.33 126.28
8 5477.17 126.44
9 5453.63 125.89
10 5454.06 125.90
Mean (X) 5465.63 126.17
Stdev 13.65 0.32
% RSD 0.25 0.26
LOD= 3x stdev 0.97
LOD= 0.97
Tabel 4. Perhitungan LOD Asam klorogenat
-
33
c. Asam ferulat
Nilai limit deteksi senyawa asam ferulat yaitu 0.80 (g/mL) . untuk lebih
jelas mengenai cara perhitungannya lihat Tabel 6.
Tabel 6. Perhitungan LOD Asam ferulat
replication Area (g/mL)
1 10909.70 127.36
2 10898.30 127.23
3 10851.10 126.71
4 10854.25 126.75
5 10874.70 126.97
6 10869.25 126.91
7 10919.40 127.47
8 10855.40 126.76
9 10905.70 127.32
10 10883.10 127.07
Mean (X) 10882.09 127.05
Stdev 25.04 0.28
% RSD 0.23 0.22
LOD= 3x stdev 0.83
LOD= 0.83
replication Area (g/mL)
1 11255.40 127.95
2 11290.50 128.35
3 11289.10 128.33
4 11288.90 128.33
5 11244.80 127.83
6 11282.10 128.26
7 11260.90 128.02
8 11229.80 127.67
9 11230.30 127.67
10 11268.80 128.11
Mean (X) 11264.06 128.05
Stdev 23.71 0.27
% RSD 0.21 0.21
LOD= 3x stdev 0.80
LOD= 0.80
Tabel 5. Perhitungan LOD Asam kafeat
-
34
3. Standar Asam Fenolat Bentuk Campuran
Pada sayuran terdapat berbagai macam jenis senyawa fenolik baik
senyawa asam fenolat, flavonoid, maupun senyawa-senyawa fenolik
dalam bentuk lainnya. Pembuatan standar asam fenolat dalam bentuk
campuran dimaksudkan agar dapat mengetahui urutan keluar dan waktu
retensi masing-masing standar asam fenolat ketika dicampur
sebagaimana yang terjadi pada sampel sayuran yang dianalisis.
Pembuatan standar campuran dilakukan dengan cara mencampur
ketiga standar asam fenolat dengan perbandingan 1:1 pada tingkat
konsentrasi yang sama yaitu pada konsentrasi 625 g/mL. Adapun
konsentrasi yang dibuat untuk standar campuran yaitu 125, 250, 375,
500, dan 625 g/mL. Pembuatan variasi konsentrasi tersebut dengan cara
mengencerkan standar asam fenolat dalam bentuk campuran pada
konsentrasi 625 g/mL. Data dari hasil penginjeksian standar campuran
dibuat kurva standar campuran dan persamaan garis untuk masing-
masing standar asam fenolat dalam bentuk campuran. Persamaan garis
yang didapat dari kurva standar campuran akan digunakan untuk
melakukan perhitungan senyawa asam fenolat yang terdapat pada sampel
sayuran indigenous. Contoh kromatogram standar campuran yang
menggunakan konsentrasi tertinggi 625 g/mL dapat dilihat pada
Gambar 14.
Persamaan garis untuk asam klorogenat yaitu y = 42.34x + 123.6,
dengan nilai r2 = 0.999. LOD asam klorogenat = 0.97 (g/mL) Kurva
standar campuran asam klorogenat dapat dilihat pada Gambar 15.
Persamaan garis asam kafeat yaitu y = 90.07x -561.7, dengan nilai r2 =
0.998. LOD asam kafeat = 0.83 (g/mL). Kurva standar campuran asam
kafeat dapat dilihat pada Gambar 16. Persamaan garis asam ferulat yaitu
y = 88.66x -88.99, dengan nilai r2 = 0.999. LOD asam ferulat = 0.80
(g/mL). Kurva standar campuran asam ferulat dapat dilihat pada Gambar
17. Data hasil penginjeksian standar asam fenolat dalam bentuk
campuran dapat dilihat pada Tabel 7.
-
35
Tabel 7. Hasil penginjeksian standar asam fenolat dalam bentuk campuran
Gambar 14. Kromatogram standar campuran dengan analisis HPLC
Gambar 15. Kurva standar asam klorogenat dalam bentuk campuran
No Standar Asam
Fenolat
Rt/waktu
retensi (menit
ke-)
Persamaan kurva
standar campuran
Limit deteksi
(LOD) g/mL
1 Asam
klorogenat 2.0-2.2 y = 42.34x + 123.6 0.97
2 Asam kafeat 2.8-3.2 y = 90.07x -561.7 0.83
3 Asam ferulat 6.7-7.3 y = 88.66x -88.99 0.80
Konsentrasi
(g/mL) Area
0 0
125 5391
250 10959
375 15773
500 21734
625 26285
-
36
Gambar 16. Kurva standar asam kafeat dalam bentuk campuran
Gambar 17. Kurva standar asam ferulat dalam bentuk campuran
B. TOTAL FENOL
Total fenol merupakan perkiraan kasar jumlah senyawa fenolik yang
terdapat dalam suatu bahan. Pengukuran total fenol yang dilakukan dalam
penelitian ini menggunakan metode yang mereaksikan ekstrak bahan dengan
senyawa folin. Senyawa folin dapat bereaksi dengan gugus kromofor pada
fenolik dan dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
725 nm.
Pengukuran total fenol dilakukan dengan membandingkan fenol yang ada
dalam bahan dengan kurva standar fenol yang dibuat dari asam galat. Selain
asam galat kurva standar juga dapat mengunakan asam tanat. Pemilihan bahan
yang akan dijadikan standar tergantung bentuk mayoritas fenol yang terdapat
dalam bahan yang diuji. Pada sampel kali ini total fenol mayoritas berupa
polimer asam galat.
Konsentrasi
(g/mL) Area
0 0
125 10788
250 20602
375 33613
500 44570
625 55941
Konsentrasi
(g/mL) Area
0 0
125 11232
250 21681
375 32807
500 44738
625 55252
-
37
Perhitungan total fenol pada sampel dilakukan dengan menggunakan
persamaan garis dari kurva standar asam galat. Konsentrasi asam galat yang
dibuat adalah 50,100, 150, 200, dan 250 mg/L. Persamaan garis total fenol
yaitu y = 0.0036x-0.0280 dengan nilai r2 = 0.9963. Kurva standar asam galat
dapat dilihat pada Lampiran 10. Perhitungan total fenol, pada sampel dilakukan
berdasarkan berat basah dan berat kering sampel. Basis berat basah berarti
kandungan fenol dihitung sebanyak berapa miligram dalam 100 gram sampel
segar, sedangkan perhitungan berdasarkan basis kering berarti kandungan fenol
dihitung sebanyak berapa miligram dalam 100 gram sampel kering. Dari hasil
analisis total fenol dua puluh empat sampel, diketahui bahwa total fenol
terbanyak berdasarkan berat kering terdapat pada daun jambu mete (4418.4
mg) dan terkecil pada mangkokan (227.7 mg). Nilai total fenol dari dua puluh
empat sampel yang dianalisis dapat dilihat pada Tabel 8 dan untuk perhitungan
total fenol pada sampel selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 11.
No Sampel Wet Basis Dry Basis
[ ] (mg / 100 g sampel segar) [ ] (mg/ 100 g sampel kering)
1 Mengkudu 72.72 499.99
2 Mangkokan 40.36 227.74
3 Daun Labu Siam 66.46 498.94
4 Daun Lembayung 112.55 719.83
5 Daun Katuk 138.01 632.66
6 Daun Kemangi 86.89 690.72
7 Daun Pakis 61.56 573.51
8 Daun Pohpohan 121.52 986.69
9 Bunga Pepaya 66.75 601.90
10 Mangkokan Putih 179.88 1016.83
11 Daun Kenikir 342.06 1736.69
12 Daun Kelor 107.00 432.75
13 Daun Kucai 21.01 272.86
14 Daun Jambu Mete 847.41 4418.38
15 Buah Takokak 158.92 790.12
16 Antanan 200.52 1097.23
17 Krokot 82.66 692.69
18 Antanan Beurit 144.81 922.37
19 Daun Ginseng 64.64 790.76
20 Bunga kecombrang 256.99 2511.45
21 Daun Beluntas 742.54 3868.59
22 Bunga Turi 38.43 393.19
23 Terubuk 87.65 754.68
24 Kedondong cina 189.08 1297.72
Tabel 8. Total Fenol Sayuran Indigenous
-
38
C. ANALISIS ASAM FENOLAT PADA SAYURAN INDIGENOUS
Hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap dua puluh empat jenis
sayuran indigenous Indonesia mengenai kandungan asam fenolat (asam
klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat), didapatkan bahwa sebagian besar
sayuran indigenous Indonesia mengandung asam fenolat terutama asam
klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat. Hanya sebagian kecil yang tidak
mengandung ketiga senyawa asam fenolat tersebut diantaranya yaitu
mengkudu, daun jambu mete, daun beluntas, dan kedondong cina yang hanya
mengandung klorogenat dan asam ferulat, sedangkan daun pakis dan antanan
beurit hanya mengandung klorogenat dan asam kafeat, terakhir bunga turi
hanya mengandung asam ferulat.
Penentuan asam fenolat (asam klorogenat, asam kafeat, dan asam ferulat)
pada sampel