kolom hplc

Pendahuluan

KCKT atau HPLC merupakan suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa

diamnya berupa cairan atau padat. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim

fase gerak ke dalam kolom.

Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya

diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen

tersebut (kuantitatif)

Komponen HPLC

Kolom HPLCKolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus yang panjangnya antara 3 dan 15 cm dan pada dinding bagian dalam kadang-kadang dilapisi dengan material inert seperti kaca atau PEEKÂ ®. Kolom bisa terbuat dari sejenis plastik disebut cartridge, atau terbuat dari stainless steel.

Kolom pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) merupakan bagian yang sangat penting, sebab pemisahan komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.

Oleh karena itu ada beberapa hal yang harus diperhatikan, yaitu

1. Pemilihan kolom yang sesuai

2. Pemeliharaan kolom

3. Uji terhadap spesifikasi kolom (walaupun kolom tersebut merupakan kolom yang siap dipakai).

http://www.catatankimia.com

Pemilihan kolom merupakan langkah yang pertama dan utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap performan kromatogram

Jenis-jenis kolom HPLC

Kolom HPLC

Konvensional

Microbore

High Speed

Ditinjau dari ukurannya (panjang dan diameternya)

Jenis-jenis Kolom

http://www.catatankimia.com

Jenis-jenis kolom HPLC

Kolom HPLC

Kolom Fase Normal

Kolom Fase Terbalik

Dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya

Fase Diam Kolom Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang

dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.

Dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya, maka kolom HPLC dibedakan atas Kolom Fasa Normal dan Kolom Fasa Terbalik (Reversed Phase Column).

http://www.catatankimia.com

Kolom Fasa Normal Kromatografi dengan kolom konvensional mempunyai

fasa diam normal yang bersifat polar, misalnya silika gel. Sedangkan fasa geraknya bersifat non polar, sehingga analit yang akan dipisahkan adalah analit yang bersifat non polar.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

http://www.catatankimia.com

Kolom Fase Terbalik

Kolom fasa terbalik adalah kolom yang fasa diamnya bersifat non polar, sedangkan fasa geraknya bersifat polar, kebalikan dari fasa normal.

Pemilihan Kolom

Ada beberapa cara yang dapat digunakan yaitu :

1. Tetapkan Tujuan Pemisahan Anda. Tentukan apakah aplikasi Anda membutuhkan resolusi tinggi, waktu analisis singkat,maksimum sensitivitas, waktu hidup kolom yang panjang, biaya operasi yang rendah, atau faktor penting lainnya.

2. Menyamakan kolom yang digunakan untuk analit lain yang serupa

3. Mendapatkan informasi dari pustaka

Mekanisme Kerja di Dalam Kolom

Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama

Penggunaan KolomBanyak faktor harus diperhatikan di dalam menggunakan kolom, agar kolom dapat berfungsi dengan baik dalam waktu yang relatif panjang. Faktor-faktor yang harus diperhatikan tersebut seperti:

1. Kualitas Pelarut

2. Larutan Pencuci Kolom

3. Pelarut untuk menyimpan kolom

4. Penggunaan pre coloum

Hal-hal lain yang perlu diperhatikan yaitu pengeluaran gas (‘de-gas’) dengan menarik gelembung udara dari dalam media dengan menggunakan peralatan pompa vakum.

Pelarut untuk menyimpan kolom

Umumnya jenis pelarut  yang digunakan untuk menyimapan kolom harus disesuaikan dengan jenis kolomnya. Sebagai contoh :

1. Kolom penukar ion disimpan dalam metanol atau air. Metanol lebih disukai karena dapat mencegah pertumbuhan bakteri.

2. Kolom fasa terikat tak polar disimpan dalam metanol. Asetonitril tidak dianjurkan untuk dipakai di sini karena selain harganya mahal, asetonitril ini dapat terurai membentuk pengotor pada kolom.

3. Kolom fasa terikat polar disimpan dalam heptana atau metanol.

4. Kolom silika disimpan dalam heptana.

Di dalam penyimpanannya jangan sekali-kali kolom dibiarkan kering. Pada kolom yang kering dapat terjadi kekosongan karena paking kolom dapat mengkerut dari dinding kolom atau karena pengerutan paking kolom itu sendiri.

Untuk memperpanjang umur kolom, seringkali didahului oleh suatu precolumn atau penjaga kolom.

http://www.catatankimia.com

Precolumn

Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena diletakkan sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm dan biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran lebih besar dari ukuran partikel kolom utama.

Pre-colum dilengkapi dengan filter (saringan). Hal tersebut sangat penting untuk memperoleh hasil pemisahan yang sempurna serta untuk menghindari terjadinya penyumbatan (blocking) di dalam kolom sehingga self life kolom lebih panjang dan melestarikan kinerjanya..

http://www.catatankimia.com

Penutup 1. Kolom pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT/HPLC) merupakan bagian yang sangat penting, sebab pemisahan komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.

2. Pemilihan kolom merupakan langkah yang pertama dan utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap performan kromatogram.

TERIMA KASIH

Mekanisme Kerja di Dalam Kolom Didalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen

campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama.

Setiap komponen campuran yang keluar dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Precolumn ini, yang mempertahankan senyawa dengan Rf = 0, secara berkala berubah. Hal ini juga dianjurkan sebelum analisis, solusi untuk lulus sampel melalui filter ukuran pori kurang dari 0,5 mikrom.

Sebelum digunakan sebaiknya kolom dialiri dengan pelarut pengembang yang kuat (metanol, eter, heksana), apabila sedang tidak digunakan kolom direndam dalam pelarut inert yang tidak mudah menguap (metanol, metanol-air, air suling).

Perlakuan lain pada sampel adalah dengan menggetarkan sampel pada ‘ultrasonic beam’ agar terbebas dari gelembung udara. Selanjutnya setelah melakukan tahap ini, dilakukan pengeluaran gas (‘de-gas’) dengan menarik gelembung udara dari dalam media dengan menggunakan peralatan pompa vakum.

Sebelum sampel diinjeksikan ke dalam perangkat HPLC, terlebih dahulu dilakukan penyaringan dengan menggunakan ‘filter milipore’.

http://www.catatankimia.com

Penggunaan Kolom