skrining rs 855791 (c> t) pada mahasiswa program...

SKRINING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHYSM rs855791 (C>T)

PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UNTUK MENGETAHUI KEMUNGKINAN MENDERITA

IRON REFRACTORY DEFICIENCY ANEMIA DENGAN MENGGUNAKAN

TEKNIK REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION-

HIGH RESOLUTION MELT

Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN

OLEH :

Amatillah Raifah

NIM: 1112103000024

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1436 H/2015 M

ii

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Dengan ini saya menyatakan bahwa:

1. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan

untuk memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar Strata 1 di

Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya

cantumkan sesuai dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3. Jika dikemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau

merupakan hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia

menerima sanksi yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Ciputat, 16 Oktober 2015

Amatillah Raifah

iii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING

SKRINING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHYSM rs855791 (C>T) PADA

MAHASISWA PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER UNIVERSITAS

ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UNTUK

MENGETAHUI KEMUNGKINAN MENDERITA IRON REFRACTORY

DEFICIENCY ANEMIA DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK REAL TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION-HIGH RESOLUTION MELT

Laporan Penelitian

Diajukan kepada Program Studi Pendidikan Dokter

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S. Ked)

Oleh

Amatillah Raifah

NIM: 1112103000024

Pembimbing I Pembimbing II

Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, PhD, FACS

NIP: 19721103 200604 1 001 NIP: 19690511 200312 1 001

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

1436 H/2015 M

iv

LEMBAR PENGESAHAN

Laporan Penelitian berjudul SKRINING SINGLE NUCLEOTIDE

POLYMORPHYSM rs855791 (C>T) PADA MAHASISWA PROGRAM

STUDI PENDIDIKAN DOKTER UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UNTUK MENGETAHUI

KEMUNGKINAN MENDERITA IRON REFRACTORY DEFICIENCY

ANEMIA DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK REAL TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION-HIGH RESOLUTION MELT yang

diajukan oleh Amatillah Raifah (NIM 1112103000024), telah diujikan dalam

sidang di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan pada tanggal 16 Oktober 2015.

Laporan penelitian ini telah diperbaiki sesuai dengan masukan dan saran penguji,

serta telah diterima sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana

Kedokteran (S. Ked) pada Program Studi Pendidikan Dokter.


DEWAN PENGUJI

Ketua Sidang

dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, PhD, FACS

NIP: 19721103 200604 1 001

Pembimbing I

Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD

NIP: 19690511 200312 1 001

Pembimbing II

dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, PhD, FACS

NIP: 19721103 200604 1 001

Penguji I

dr. Mukhtar Ikhsan, Sp.P(K), MARS

NIP. 19540406 198111 1 001

Penguji II

Nurlaely Mida R., S.Si, M. Biomed, DMS

NIP. 19671119 200501 2 001

PIMPINAN FAKULTAS

Dekan FKIK UIN

Dr. Arif Sumantri, S.K.M., M.Kes

NIP.19650808 198803 1 002

Kaprodi PSPD

dr. Achmad Zaki, M.Epd, Sp.OT

NIP. 19780507 200501 1 005

v

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum wr. wb.

Puji syukur peneliti panjatkan kepada Allah SWT yang telah

melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penelitian ini dapat diselesaikan

dengan baik. Shalawat serta salam tidak lupa peneliti sampaikan kepada

Nabi Muhammad SAW beserta keluarga dan sahabatnya.

Alhamdulillahi rabbil ‘alamin, penelitian ini telah selesai, dan akan sulit

terselesaikan jika tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena

itu, saya mengucapkan banyak terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. H. Arif Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

2. dr. Achmad Zaki, M.Epd, Sp.OT selaku Kepala Program Studi

Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD dan dr. Nouval Shahab,

SpU, Ph.D, FICS, FACS selaku dosen pembimbing yang telah

membimbing, mengarahkan, dan memberikan dukungan kepada

peneliti mulai dari awal hingga akhir penelitian.

4. dr. Mukhtar Ikhsan, Sp.P(K), MARS dan Nurlaely Mida R., S.Si,

M. Biomed, DMS selaku penguji sidang laporan penelitian ini.

5. dr. Nouval Shahab, SpU, Ph.D, FICS, FACS dan dr. Flori Ratna

Sari, Ph.D. selaku penanggung jawab riset Program Studi

Pendidikan Dokter angkatan 2012 yang telah memberikan motivasi

untuk dapat menyelesaikan penelitian tepat pada waktunya.

6. dr. Fika Ekayanti, M.Med Ed selaku pembimbing akademik yang

telah sabar menasehati dan memberikan dukungan dalam proses

pembelajaran di Program Studi Pendidikan Dokter.

7. Kedua orang tua saya yang tercinta, terhebat, ayahanda alm. H.

Asy’ari, S.Ag dan ibunda DR. Hj. Lailial Muhtifah, M.Pd yang

selalu memberikan dukungan kepada peneliti baik moral maupun

vi

materil.

8. Keempat saudara kandung saya, Hadiatus Sa’adah, S.Pdi, Ummi

Fauziah, S.Pd, Nur Rahmiani, S.KM, Niya Latul Muna, S.Kom serta

seluruh keluarga besar saya yang senantiasa membuat saya

semangat dan kuat dalam mengikuti proses pembelajaran di

Program Studi Pendidikan Dokter FKIK UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.

9. Rafiqy Sa’adiy Faizun yang selalu menasehati, mendukung, dan

memotivasi peneliti.

10. Untuk teman seperjuangan kelompok penelitian saya, Nurul

Hasanah, Hipni Solehudin, Rizky Ananda Prawira, dan Adamilzary

Fikry yang berjuang bersama.

11. Untuk Mba Ai dan Mba Sur selaku Laboran yang ikut membantu

saya dalam melakukan penelitian ini.

12. Untuk Sahabat terdekat saya Ranita, Harlia, Amel, Melia, Binayu,

Silvi, dan Barbie Anis, Muthi, Putri, Fitri yang selalu memberikan

dukungan.

13. Untuk Official CIMSA UIN 2014-2015 Adit, Fiizhda, Octa, Firda,

Reni, Dewi, Shaby, Raka, Linda, Eel, Galang, Ijul, Nadya, Hylman,

dan SCOMEDIAN CIMSA UIN yang senantiasa memberikan

dukungan kepada peneliti.

14. Untuk seluruh mahasiswa PSPD 2012 hingga 2014 yang bersedia

menjadi responden dalam penelitian ini.

15. Untuk semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu.

Peneliti menyadari bahwa laporan penelitian ini masih terdapat

ketidaksempurnaan. Oleh karena itu, peneliti mengharapkan kritik dan

saran yang membangun bagi penelitian ini. Semoga penelitian ini dapat

bermanfaat bagi masyarakat dan para pembaca.


Peneliti

vii

ABSTRAK

Amatillah Raifah. Program Studi Pendidikan Dokter. Skrining Single

Nucleotide Polymorphysm rs855791 (C>T) pada Mahasiswa Program Studi

Pendidikan Dokter Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk Mengetahui Kemungkinan Menderita Iron Refractory Deficiency

Anemia dengan Menggunakan Teknik Real Time Polymerase Chain Reaction-

High Resolution Melt.

SNP rs855791 (TMPRSS6) diketahui menyebabkan produksi berlebihan dari

hepsidin yang dapat menyebabkan penurunan penyerapan zat besi pada Iron

Refractory Deficiency Anemia. Untuk mengetahui frekuensi SNP rs855791 dan

hubungannya dengan tingkat Hb, sebuah studi asosiasi genom dilakukan di UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta. Sampel diperoleh dari mahasiswa Program Studi

Pendidikan Dokter angkatan 2012-2014 (N=102). Metode yang digunakan adalah

High Resolution Melt (HRM) dengan menggunakan Light Cycler 480® Roche

untuk skrining Iron Refractory Deficiency Anemia dan pemeriksaan kadar

hemoglobin menggunakan Easy Touch® GCHb meter. Hasilnya, frekuensi

genotip SNP rs855791 (C> T) adalah wildtype (3,9%), heterozigot (72,5%), dan

mutan (23,5%). Hasilnya tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara

genotip dengan kadar hemoglobin (p=0,818) dan anemia (p =0,466). Fragmen

DNA sampel menunjukkan 1 delesi dan double-hetero di urutan basa lainnya yang

menyebabkan perbedaan dalam penelitian ini.

Kata Kunci : HRM-PCR, IRIDA, rs855791, TMPRSS6

viii

ABSTRACT

Amatillah Raifah. Medical Education Study Program. Screening Single

Nucleotide Polymorphysm rs855791 (C>T) on Student of Medical Education

Study Program of State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta

Grade 2012-2014 to Know Iron Refractory Deficiency Anemia Possibility

Using Real Time Polymerase Chain Reaction-High Resolution Melt

Technique.

SNPs rs855791 (TMPRSS6) is known to cause excessive production

of hepcidin that may lead to decreased iron absorption in Iron Refractory

Deficiency Anemia. To know the frequency of SNP rs855791 and its relationship

with the levels of Hb, a genome-wide association studies was conducted

in UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Samples was obtained from student of

Medical Education Study Program grade 2012-2014 (N=102). The method was

used High Resolution Melt (HRM) by using Light Cycler 480® Roche for

screening Iron Refratory Deficiency Anemia and hemoglobin level examination

using Easy Touch® GCHb meters. The result, frequency of genotyping SNPs

rs855791 (C>T) is wildtype (3,9%), heterozygote (72,5%), and mutant (23,5%).

The result did not show any significant difference between genotyping with

hemoglobin levels (p=0,818) and anemia (p = 0,466). The sequence of DNA

sample shows 1 deletion and double-hetero in other base sequence causes the

difference in this study.

Key Words : HRM-PCR, IRIDA, rs855791, TMPRSS6

ix

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ..................................................................................................... i

LEMBAR PERNYATAAN ..................................................................................... ii

LEMBAR PERSETUJUAN ................................................................................... iii

LEMBAR PENGESAHAN .................................................................................... iv

KATA PENGANTAR .............................................................................................. v

ABSTRAK ............................................................................................................. vii

ABSTRACT ............................................................................................................ viii

DAFTAR ISI ............................................................................................................ ix

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................... xi

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xii

DAFTAR SINGKATAN ....................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiv

BAB 1 PENDAHULUAN ....................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................... 2

1.3 Hipotesis ............................................................................................................. 3

1.4 Tujuan ................................................................................................................. 3

1.5 Manfaat Penelitian .............................................................................................. 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 4

2.1 Landasan Teori ................................................................................................... 4

2.1.1 Genomik ..................................................................................................... 4

2.1.1.1 Kajian Islam Tentang Larangan Menikah Sedarah ..................... 5

2.1.2 Anemia ....................................................................................................... 6

2.1.2.1 Kajian Islam Tentang Makanan yang Halal Lagi Baik ............... 7

2.1.3 Siklus Hidup Eritrosit ................................................................................ 8

2.1.4 Metabolisme Zat Besi ................................................................................ 9

2.1.5 Iron Refractory Deficiency Anemia (IRIDA) .......................................... 11

2.1.6 Regulasi Ekspresi Hepsidin ..................................................................... 14

2.1.7 Isolasi Genom .......................................................................................... 16

2.1.7.1 Persiapan untuk Human Genomic DNA .................................... 16

2.1.8 Polymerase Chain Reaction (PCR) ......................................................... 20

2.1.9 Metode High Resolution Melt (HRM) ..................................................... 21

2.1.9.1 Analisis HRM .............................................................................. 22

2.2 Kerangka Teori ................................................................................................. 27

2.3 Kerangka Konsep .............................................................................................. 28

2.4 Definisi Operasional ......................................................................................... 28

BAB 3 METODE PENELITIAN ........................................................................ 30

3.1 Desain Penelitian .............................................................................................. 30

3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................................................ 30

3.3 Populasi dan Sampel ......................................................................................... 30

3.3.1 Populasi Terjangkau ................................................................................ 30

x

3.3.2 Kriteria Pemilihan .................................................................................... 30

3.3.3 Perkiraan Besar Sampel ........................................................................... 31

3.3.4 Teknik Pemilihan Sampel ........................................................................ 31

3.4 Alat dan Bahan Uji ........................................................................................... 31

3.5 Cara Kerja Penelitian ........................................................................................ 33

3.5.1 Pengumpulan Data ................................................................................... 33

3.5.2 Desain GBlock dan Primer ...................................................................... 33

3.5.3 Isolasi DNA ............................................................................................. 36

3.5.4 Real Time PCR-HRM ............................................................................. 38

3.5.5 Analisis Data ............................................................................................ 40

3.5.6 Etika Penelitian ........................................................................................ 41

3.5.7 Alur Penelitian ......................................................................................... 42

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 43

4.1 Hasil .................................................................................................................. 43

4.1.1 Hasil Isolasi Genom DNA dari Whole Blood .......................................... 43

4.1.2 Data Karakteristik Responden ................................................................. 43

4.1.3 Hasil Pengukuran Kadar Hemoglobin ..................................................... 45

4.1.4 Hasil Analisis Kurva HRM ...................................................................... 45

4.1.4.1 Analisis Kurva Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan

Mutant) ....................................................................................... 45

4.1.5 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kadar Hemoglobin .................. 46

4.1.6 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kategori Kadar Hemoglobin ... 47

4.1.7 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotyping (Wildtype,

Heterozygote, dan Mutant) ....................................................................... 47

4.1.8 Hasil Hubungan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant)

dengan Kadar Hemoglobin ...................................................................... 48

4.1.9 Hasil Hubungan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant)

dengan Kategori Kadar Hemoglobin ....................................................... 49

4.2 Pembahasan ...................................................................................................... 50

4.3 Kelebihan Penelitian ......................................................................................... 52

4.4 Keterbatasan Penelitian .................................................................................... 52

BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN ...................................................................... 54

5.1 Simpulan ........................................................................................................... 54

5.2 Saran ................................................................................................................. 54

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 55

LAMPIRAN ........................................................................................................... 58

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Eritropoesis ........................................................................................... 9

Gambar 2.2 Sintesis Hemoglobin pada Pembentukan Sel Darah Merah ................ 12

Gambar 2.3 Letak Gen TMPRSS6 .......................................................................... 13

Gambar 2.4 Siklus Zat Besi – Mekanisme Adaptasi Tubuh pada Defisiensi Besi . 15

Gambar 2.5 Ekspresi gen HAMP ............................................................................ 15

Gambar 2.6 Analisis data HRM dari SNP tipe 4 (A/T) .......................................... 25

Gambar 2.7 Kerangka Teori .................................................................................... 27

Gambar 2.8 Kerangka Konsep ................................................................................ 28

Gambar 3.1 Alur Penelitian ..................................................................................... 42

Gambar 4.1 Rerata Kadar Hemoglobin Menurut Jenis Kelamin ............................. 46

Gambar 4.2 Rerata Kadar Hemoglobin Menurut Genotyping (Wildtype,

Heterozygote, dan Mutant) ...................................................................................... 49

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Kadar hemoglobin berdasarkan usia menurut WHO, Hb dalam (g/L) ..... 8

Tabel 2.2 Klasifikasi anemia berdasarkan morfologi dan etiologi ........................... 8

Tabel 2.3 Proporsi relatif besi didalam tubuh pada dewasa muda sehat ................. 10

Tabel 2.4 Konsentrasi DNA yang Dianjurkan untuk Berbagai Template ............... 26

Tabel 2.5 Definisi Operasional ............................................................................... 28

Tabel 3.1 Alat dan Bahan Penelitian ....................................................................... 31

Tabel 3.2 Tahapan Isolasi Genom DNA ................................................................. 37

Tabel 3.3 Parameter PCR yang direkomendasikan untuk Light Cycler 480®

System PCR Run ...................................................................................................... 39

Tabel 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden ................................................. 44

Tabel 4.2 Karakteristik Usia Responden ................................................................. 44

Tabel 4.3 Indeks Massa Tubuh Responden ............................................................ 44

Tabel 4.4 Kategori Kadar Hemoglobin Responden ................................................ 45

Tabel 4.5 Genotyping SNP rs855791 dari genom DNA responden ....................... 46

Tabel 4.6 Distribusi Frekuensi Kategori Kadar Hemoglobin Berdasarkan Jenis

Kelamin .................................................................................................................... 47

Tabel 4.7 Distribusi Frekuensi Kategori Genotyping menurut Jenis Kelamin ........ 48

Tabel 4.8 Distribusi Frekuensi Genotyping Menurut Kategori Kadar Hemoglobin 49

xiii

DAFTAR SINGKATAN

BFU-E Burst Forming Unit-Erythroid

BMP Bone Morphogenetic Protein

CFU-E Colony Forming Unit-Erythroid

EPO Erythropoetin

Hb Hemoglobin

HJV Hemojuvelin

HRM High Resolution Melt

IRIDA Iron Refractory Deficiency Anemia

MT2 Matriptase-2

PCR Polymerase Chain Reaction

SNP Single Nucleotide Polymorphysm

TfR1 Transferin Receptor 1

TfR2 Transferin Receptor 2

TMPRSS6 Transmembran Protease, Serin 6

WHO World Health Organization

ᵹ-ALAD Delta Aminolevulenat Dehidratase

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Lembar Persetujuan Responden ............................................................. 58

Lampiran 2. Lembar Tanda Terima Komisi Etik Penelitian ...................................... 59

Lampiran 3. Fragmen gBlock dan Primer ................................................................... 60

Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian ...................................................................... 61

Lampiran 5. Gel Documentation hasil Elektroforesis Agarose dari Isolasi

Genom DNA Sampel .................................................................................................. 63

Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel .................................. 64

Lampiran 7. Hasil Kurva HRM dan Sekuensing ........................................................ 67

Lampiran 8. Hasil Analisis Statistik ........................................................................... 73

Lampiran 9. Curriculum Vitae Peneliti ....................................................................... 87

1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Anemia sangat banyak terjadi di berbagai negara belahan dunia. Menurut

WHO dari tahun 1993 hingga 2005, secara global anemia mengenai 1,62 juta

orang.1 Prevalensi tertinggi terjadi pada anak usia pra sekolah sebesar 47,4 % dan

paling rendah pada laki-laki 12,7 %. Namun untuk jumlah populasi yang paling

banyak terkena adalah perempuan tidak hamil yakni sekitar 468 juta di dunia. Di

Indonesia, anemia gizi besi masih merupakan masalah kesehatan masyarakat

dengan prevalensi pada anak balita sebesar 28,1 %, anak 5-12 tahun 29 %, ibu

hamil 37,1 %, remaja perempuan 13-18 tahun dan perempuan usia subur 15-49

tahun masing-masing sebesar 22,7%.2

Masalah anemia defisiensi besi sebagian besar di saluran gastrointestinal.

Penurunan absorbsi besi dapat terjadi pada penyakit inflammatory bowel disease,

gastritis atrofi, infeksi Helicobacter pylori, dan setelah dilakukan tindakan

pembedahan seperti gastrectomi, duodenal bypass, bariatric surgery. Kehilangan

darah kronik seperti pada esofagitis, gastritis erosif, ulkus peptikum, divertikulitis,

tumor jinak, kanker intestinal, hemorrhoids, infestasi cacing, menstruasi yang

banyak, menorrhagia, hemolisis intravaskular, schistomiasis kronik, dan sindrom

munchausen juga dapat menjadi penyebab. Konsumsi obat-obatan seperti

glukokortikoid, salisilat, NSAIDs, dan PPI sama dapat menyebabkan anemia.

Pada keadaan bayi baru lahir, remaja, perempuan yang sedang menstruasi,

kehamilan, konsumsi besi yang kurang, malnutrisi, dan diet pada vegetarian dapat

menyebabkan anemia. Asupan zat besi yang kurang dan perdarahan akibat infeksi

cacing merupakan salah satu penyebab yang banyak di negara berkembang.3

Pada anemia hemolitik herediter, anemia dapat terjadi pada difisiensi

enzim glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). Anemia dapat terjadi pada

gangguan sintesis pembentukan rantai globin, yakni pada penyakit talasemia.

Timbal dapat mengganggu fungsi enzim delta aminolevulenat dehidratase (ᵹ-

ALAD) yang dapat menyebabkan anemia. Salah satu penyebab genetik lainnya

yang baru-baru ini ditemukan adalah Iron Refractory Iron Deficiency Anemia

2

(IRIDA) merupakan anemia herediter resesif yang disebabkan oleh defek pada

gen TMPRSS6 yang mengkode matriptase-2 (MT2). MT2 merupakan regulator

negatif transkripsi hepsidin. Kadar hepsidin yang tinggi dapat mencegah

penyerapan zat besi di usus halus. Pada tahun 1981, tiga orang bersaudara

diketahui tidak menunjukkan respon terhadap pemberian zat besi secara

parenteral. Kemudian ditemukan pula dua saudara perempuan mengalami hal

yang sama dengan orang tua tidak mengalami hal serupa. Pada kasus lainnya, hal

yang sama juga ditemukan dengan hasil pemeriksaan tambahan yang telah

menyingkirkan anemia akibat gangguan gastrointestinal maupun perdarahan. Saat

itu diduga bahwa pasien menderita anemia akibat gangguan dalam metabolism zat

besi yang diturunkan secara genetik. Pada tahun 1997, seorang anak dari ras

Afrika berusia 18 bulan dengan iron resistant iron deficiency anemia dan

mikrositosis berat dilaporkan.4 Prevalensi dari IRIDA sendiri masih belum banyak

diketahui, terlebih di Indonesia.

1.2. Rumusan Masalah

Uraian dalam latar belakang masalah di atas memberikan dasar bagi

peneliti untuk merumuskan pertanyaan penelitian sebagai berikut :

a. Berapa frekuensi genotyping Single Nucleotide Polymorphysm (SNP)

rs855791 (TMPRSS6) (C>T) asam amino prolin menjadi serin pada

mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter (PSPD) Universitas

Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014

menggunakan teknik Real Time Polymerase Chain Reaction-High

Resolution Melt (PCR-HRM)?

b. Apakah terdapat hubungan antara genotyping SNP rs855791

(TMPRSS6) (C>T) dengan kadar hemoglobin pada mahasiswa PSPD

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014 menggunakan

teknik Real Time PCR-HRM?

3

1.3. Hipotesis

Terdapat hubungan antara genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6)

(C>T) dengan kadar hemoglobin mahasiswa PSPD UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta menggunakan teknik Real Time PCR-HRM.

1.4. Tujuan

a. Mengetahui frekuensi genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6) (C>T)

pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan

2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time PCR-HRM.

b. Mengetahui hubungan antara genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6)

(C>T) dengan nilai Hb pada mahasiswa PSPD UIN Syarif

Hidayatullah angkatan 2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time

PCR-HRM.

1.5. Manfaat Penelitian

a. Bagi peneliti, menambah khazanah ilmu pengetahun dan ketrampilan

khususnya bidang biologi molekuler serta meningkatkan kemampuan

penulis dalam penelitian.

b. Bagi penelitian selanjutnya, sebagai sumber informasi dan bahan

referensi.

c. Bagi masyarakat, sebagai sumber informasi dalam mengatur pola

makan yang sehat dan bergizi cukup.

d. Bagi mahasiswa, mengetahui faktor resiko mengenai penyakit anemia

sehingga secara dini dapat dilakukan tindakan pencegahan.

4

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Landasan Teori

2.1.1. Genomik

Menurut National Human Genome Research Institute, genomik

merupakan istilah yang banyak digunakan untuk menggambarkan studi tentang

seluruh gen manusia (genom), termasuk interaksi antar gen dan dengan

lingkungannya. Genomik mempelajari studi ilmiah mengenai berbagai macam

penyakit yang kompleks, seperti penyakit jantung, asma, diabetes, dan kanker.5

Menurut WHO, genomik didefinisikan sebagai studi tentang gen dan fungsi

mereka, dan teknik terkait.6

Satu gen dapat divisualisasikan sebagai satu segmen molekul DNA yang

mengandung kode dari urutan asam amino dari rantai polipeptida dan mengatur

ekspresinya secara sederhana. Pada genom manusia terdapat banyak gen yang

mengkode berbagai macam protein dan juga area non-koding. Area non-koding

tersebut disebut dengan intron. Intron awalnya ditranskripsi menjadi RNA di

dalam inti tetapi tidak hadir dalam mRNA matang di sitoplasma. Dengan

demikian, informasi dari urutan intron tidak terwakili dalam produk protein akhir.

Intron terletak bergantian dengan ekson. Ekson merupakan area koding yang

mengkode produk akhir protein.7 Mutasi pada area ekson maupun intron dapat

mempengaruhi hasil akhir dari mutasi tersebut.

Polimorfisme nukleotida tunggal atau Single Nucleotide Polymorphysm,

sering disebut SNP (diucapkan "snips") adalah jenis yang paling umum dari

variasi genetik pada seorang individu. Setiap SNP merupakan perbedaan dalam

sebuah blok bangunan DNA tunggal, yang disebut nukleotida. Misalnya, SNP

dapat menggantikan sitosin nukleotida (C) dengan timin nukleotida (T) di

hamparan tertentu DNA. SNP terjadi secara normal di seluruh DNA seseorang.

SNP terjadi sekali dalam setiap 300 nukleotida rata-rata, yang berarti ada sekitar

10 juta SNP dalam genom manusia. Paling umum, variasi ini ditemukan dalam

DNA antara gen. Mereka dapat bertindak sebagai penanda biologis, membantu

5

para ilmuwan menemukan gen yang berhubungan dengan penyakit. Ketika SNP

terjadi dalam gen atau di intra gen, mereka dapat memainkan peran lebih langsung

dalam penyakit dengan mempengaruhi fungsi gen. Kebanyakan SNP tidak

berpengaruh pada kesehatan atau perkembangan. Beberapa perbedaan genetik ini,

bagaimanapun, telah terbukti sangat penting dalam studi kesehatan manusia. Para

peneliti telah menemukan SNP yang dapat membantu memprediksi respon

seseorang terhadap obat tertentu, kerentanan terhadap faktor lingkungan seperti

racun, dan risiko perkembangan penyakit tertentu. SNP juga dapat digunakan

untuk melacak warisan gen penyakit dalam keluarga. Penelitian selanjutnya yang

ada dapat mengidentifikasi SNP yang berkaitan dengan penyakit kompleks seperti

penyakit jantung, diabetes, dan kanker, termasuk IRIDA.8

2.1.1.1 Kajian Islam Tentang Larangan Pernikahan Sedarah

Agama Islam merupakan agama yang mengatur kehidupan manusia

secara baik dan terbukti secara ilmiah. Termasuk mengenai larangan untuk

melakukan pernikahan sedarah. Sebagaimana kita ketahui bahwa setiap individu

manusia memiliki kode genetik yang berbeda dengan individu lainnya. Hal ini

akan diturunkan kepada anak yang mendapatkan kode genetik dari kedua orang

tuanya. Allah SWT berfirman dalam QS. An-Nisa ayat 23 sebagai berikut.

6

Artinya : “Diharamkan atas kamu (mengawini) ibu-ibumu; anak-anakmu yang

perempuan; saudara-saudaramu yang perempuan, saudara-saudara bapakmu

yang perempuan; saudara-saudara ibumu yang perempuan; anak-anak

perempuan dari saudara-saudaramu yang laki-laki; anak-anak perempuan dari

saudara-saudaramu yang perempuan; ibu-ibumu yang menyusui kamu; saudara

perempuan sepersusuan; ibu-ibu isterimu (mertua); anak-anak isterimu yang

dalam pemeliharaanmu dari isteri yang telah kamu campuri, tetapi jika kamu

belum campur dengan isterimu itu (dan sudah kamu ceraikan), maka tidak

berdosa kamu mengawininya; (dan diharamkan bagimu) isteri-isteri anak

kandungmu (menantu); dan menghimpunkan (dalam perkawinan) dua perempuan

yang bersaudara, kecuali yang telah terjadi pada masa lampau; sesungguhnya

Allah Maha Pengampun lagi Maha Penyayang”. (QS. An Nisa: 23)

Dari ayat tersebut sudah jelas, bahwa Allah SWT mengharamkan

adanya pernikahan sedarah. Secara genetik, pernikahan sedarah lebih beresiko

mendatangkan suatu penyakit dibandingkan tidak.9 Sebagai contoh, seorang

perempuan yang memiliki sifat pembawa gen talasemia. Kemungkinan yang sama

dapat terjadi pada saudaranya, karena adanya hubungan sedarah. Maka, apabila

adanya pernikahan sedarah kemungkinan untuk melahirkan anak dengan

talasemia dapat terjadi.

2.1.2 Anemia

Anemia didefinisikan sebagai penurunan konsentrasi hemoglobin,

hematokrit atau hitung eritrosit. Hemoglobin merupakan “major oxygen-carryng

pigment” dalam darah, gram hemoglobin per 100 mL darah (g/dL). Hemoglobin

adalah metaloprotein (protein yang mengandung zat besi) di dalam sel darah

merah yang berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru ke seluruh tubuh.

Menurut WHO, level hemoglobin untuk menentukan diagnosis anemia adalah

seperti dalam tabel 2.1. Nilai rujukan pemeriksaan laboratorium dari alat yang

7

digunakan dalam penelitian ini untuk hemoglobin pada laki-laki 13,5-16,5 g/dL

dan perempuan 12,1-15,1 g/dL. Anemia dapat terjadi oleh berbagai macam

penyebab. Tabel 2.2 menjelaskan beberapa penyebab anemia.

Secara genetik, anemia dapat terjadi pada penyakit talasemia. Pada

talasemia terjadi mutasi pada gen yang membentuk rantai globin.10

Gangguan

pada pembentukan enzim delta aminolevulenat dehidratase (ᵹ-ALAD) oleh timbal

juga dapat menyebabkan anemia.

2.1.2.1 Kajian Islam Tentang Makanan yang Halal Lagi Baik

Penyakit anemia merupakan kondisi yang dapat disebabkan oleh

berbagai hal. Salah satu penyebab yang paling banyak terjadi di Indonesia adalah

karena defisiensi zat besi. Hal ini dapat terjadi karena kurangnya kesadaran

masyarakat akan kebutuhan zat besi setiap hari. Bila kita lihat, masyarakat

Indonesia sering mengonsumsi teh setelah makan. Hal ini dapat mengganggu

penyerapan zat besi dari makanan yang telah dimakan. Allah SWT berfirman

dalam QS. Al-Baqarah ayat 168 sebagai berikut.

Artinya : “Wahai manusia! Makanlah dari (makanan) yang halal dan baik yang

terdapat di bumi.” (QS. Al-Baqarah: 168)

Agama Islam mengajarkan untuk tidak hanya mengonsumsi makanan yang halal,

namun juga mengonsumsi makanan yang baik.11

Walaupun teh halal, namun bila

dikonsumsi secara berlebihan juga tidak baik. Bangun, dkk (2012) melakukan

penelitian mengenai perilaku minum teh dan kadar Hb pada siswa sekolah. Hasil

penelitian tersebut, dari 59 siswa yang mengonsumsi teh tingkat sedang 83,05%

nya memiliki kategori kadar hemoglobin yang tidak normal.12

8

Tabel 2.1. Kadar hemoglobin berdasarkan usia menurut WHO, Hb dalam (g/L)

Populasi Non-Anemia Anemia

Ringan Sedang Berat

Bayi dan balita umur 6-59

Bulan

Anak 5-11 tahun

Anak 12-14 tahun

Perempuan yang sedang

tidak hamil (usia 15 tahun

keatas)

Perempuan yang sedang

hamil

Laki-laki usia 15 tahun

keatas

110 atau lebih

115 atau lebih

120 atau lebih

120 atau lebih

110 atau lebih

130 atau lebih

100-109

110-114

110-119

110-119

100-109

110-129

70-99

80-109

80-109

80-109

70-99

80-109

<70

<80

<80

<80

<70

<80

Sumber : WHO

Tabel 2.2. Klasifikasi anemia berdasarkan morfologi dan etiologi

I. Anemia hipokromik mikrositer

a. Anemia defisiensi besi

b. Talasemia major

c. Anemia akibat penyakit kronik

d. Anemia sideroblastik

II. Anemia normokromik normositer

a. Anemia pasca berdarahan akut

b. Anemia aplastik

c. Anemia hemolitik didapat

d. Anemia akibat penyakit kronik

e. Anemia pada gagal ginjal kronik

f. Anemia pada sindrom

mielodisplastik

g. Anemia pada keganasan

hematologi

III. Anemia makrositer

Bentuk megaloblastik

a. Anemia defisiensi asam folat

b. Anemia defisiensi B12

Bentuk non megaloblastik

a. Anemia pada penyakit hati

kronik

b. Anemia pada hipotiroidisme

Anemia pada sindrom

mielodiplastik

Sumber : Sudoyo dkk, 2006

2.1.3. Siklus Hidup Eritrosit

Eritrosit dewasa atau matang berada dalam sirkulasi selama 110 – 120

hari. Kemudian ditangkap oleh makrofag. Eritropoesis dipengaruhi oleh sitokin,

erythroid specific growth factor, dan erythropoietin (EPO). EPO dihasilkan oleh

ginjal sebagai respon apabila terjadi hipoksia untuk mempertahankan jumlah

eritrosit yang relatif stabil setiap hari. Peningkatan EPO menyebabkan maturasi

9

dari sel burst forming unit-erythroid (BFU-E) menjadi sel colony forming unit-

erythroid (CFU-E). Kemudian menjadi pro-eritrosit, eritroblas, lalu menjadi

retikulosit. Retikulosit bertahan di dalam sirkulasi selama satu hari, kemudian

menjadi eritrosit matur, sekitar 1% dari jumlah eritrosit. Retikulosit dapat

meningkat apabila terjadi perdarahan akut, sebagai kompensasi sum-sum tulang

yang adekuat. Sehingga retikulosit dapat menilai respon sum-sum tulang adekuat

atau tidak. Retikulosit normal sekitar 0,5-1,5 %.10

Evaluasi morfologi dari eritrosit

bergantung pada kriteria ukuran, bentuk, distribusi dan konsentrasi Hb,

kemampuan menyerap zat warna, hapusan darah tepi, dan inklusi.

Gambar 2.1. Eritropoesis Sumber : Hoffbrand & Moss, 2013

2.1.4. Metabolisme Zat Besi

Besi merupakan mikronutrien esensial bagi tubuh. Tubuh manusia dewasa

mempunyai dua penyimpanan besar untuk besi, pertama besi yang terdapat pada

hemoglobin, mioglobin, enzim dan kedua penyimpanan besi pada ferritin,

hemosiderin, dan transferrin (protein transport di dalam darah). Laki-laki dewasa

sehat mempunyai kurang lebih 3,6 gram besi dari seluruh total tubuh, pada

perempuan sekitar 2,4 gram. Tabel berikut menunjukkan proporsi besi di dalam

tubuh manusia dewasa sehat.16

Besi sangat dibutuhkan oleh tubuh. Sekitar 90% dikembalikan dan

digunakan oleh tubuh setiap hari. Zat besi yang masuk melalui makanan harus

seimbang dengan kebutuhan besi di dalam tubuh. Bila asupan nutrisi dari sumber

makanan tidak memenuhi kebutuhan di dalam tubuh, maka defisiensi besi dapat

terjadi. Menurut Food and Nutrition Board, Institute of Medicine, National

Academies (2000), laki-laki pada kelompok umur 9-13 tahun dan 19 hingga >70

10

tahun membutuhkan zat besi sebanyak 8 mg/hari. Perempuan pada kelompok

umur 9-13 tahun membutuhkan zat besi sebanyak 8 mg/hari, kemudian kebutuhan

meningkat seiring berjalannya umur yakni pada kelompok umur 14-18 tahun

membutuhkan sekitar 15 mg zat besi/hari dan 18 mg/hari untuk usia 19-50 tahun.

Kebutuhan zat besi pada perempuan kembali menurun pada usia 51 hingga lebih

dari 70 tahun.16

Tabel 2.3. Proporsi relatif besi didalam tubuh pada dewasa muda sehat

Tipe Besi Laki-Laki Perempuan

(mg) (%) (mg) (%)

Fungsional

Hemoglobin

Myoglobin

Enzim heme

Enzin non heme

2300

320

80

100

64

9

2

3

1700

180

60

80

73

8

3

3+

Penyimpanan

Ferritin

Hemosiderin

Transferin

540

230

5

15

6

<1

200

100

4

9

4

<1

Total 3575 100 2314 100

Sumber : Mahan & Escott-Stumpt, 2004

Berdasarkan ketersediaannya, terdapat dua jenis zat besi yaitu zat besi non

heme dan zat besi heme. Zat besi heme banyak ditemukan dalam makanan

hewani, yang ditemukan dalam hemoglobin, mioglobin, dan beberapa enzim dan

zat besi non heme banyak ditemukan dalam sayuran dan kacang-kacangan. Zat

besi dari hewani sudah dalam bentuk ferro (Fe2+

), sedangkan zat besi dari tanaman

berbentuk ferri (Fe3+

). Zat besi ferro diabsorbsi di brush border (mukosa) melalui

pembentukan vesikel disekitar zat besi heme di enterosit intestinal. Setelah zat

besi ferro masuk ke sitosol, besi ferro secara enzimatis dipisahkan dari kompleks

ferroporphyrin. Besi non heme masuk melalui proses difusi akibat perbedaan

gradien konsentrasi. Ion besi yang bebas bergabung secara cepat dengan apoferitin

11

untuk membentuk feritin dan pada saat yang bersamaan ion besi non heme yang

bebas berikatan dengan apoferitin. Feritin merupakan penyimpanan besi

intraseluler dan satu feritin membawa zat besi dengan cara berikatan dengannya

dari brush border ke membran basolateral sel. Tahap akhir dari absorpsi ini adalah

ion besi berpindah ke sirkulasi dari membran basolateral dengan mekanisme

transport aktif. Pada tahap ini dilakukan baik pada besi heme maupun non heme.16

Makanan dan sekresi dari gastrointestinal kecil mempengaruhi penyerapan

besi. Pada individu yang mengonsumsi berbagai jenis makanan, sekitar 5-10%

kandungan zat besi heme berasal dari makanan dan absorpsinya mencapai 25%,

sedangkan zat besi non heme hanya diabsorpsi sebesar 5%. Pada seseorang

vegetarian yang hanya mengkonsumsi makanan yang berasal dari tumbuhan,

dibutuhkan konsumsi sumber makanan nabati dalam jumlah yang banyak untuk

memenuhi kebutuhan zat besi di dalam tubuh. Oleh karena itu, pada pasien

dengan anemia lebih disarankan untuk mengonsumsi sumber makanan zat besi

dari hewani dibandingkan dari nabati.16

Besi non heme diabsorpsi di duodenum dan jejunum dalam bentuk

terionisasi. Sekresi asam lambung meningkatkan kelarutan besi dan merubahnya

menjadi bentuk ion baik ferri (Fe+3

) dan ferro (Fe+2

). Asam askorbat atau vitamin

C dapat mengoksidasi zat besi ferri menjadi ferro, sehingga dapat meningkatkan

penyerapannya di usus. Molekul makanan lain seperti gula dan sulfur yang

mengandung asam amino juga dapat meningkatkan absorpsi besi.16

Besi dibutuhkan untuk sintesis protein hemoglobin. Hemoglobin sangat

berperan penting dalam transport O2 di dalam darah. Sintesis hemoglobin terjadi

di dalam mitokondria melalui reaksi biokimia. Reaksi dimulai dengan kondensasi

antara glisin dan suksinil koenzim A membentuk enzim δ-aminolaevulinic acid

(ALA). Vitamin B6 bertindak sebagai koenzim dalam proses ini. Protoforpirin

bertindak sebagai perantara dalam pembentukan heme dengan cara berikatan

dengan ferro. Setiap molekul heme berikatan dengan protein globin hingga

terbentuk satu paket lengkap hemoglobin.17

12

Gambar 2.2. Sintesis hemoglobin pada pembentukan sel darah merah Sumber : Hoffbrand & Moss, 2006

2.1.5. Iron Refractory Deficiency Anemia (IRIDA)

IRIDA merupakan penyakit autosomal resesif yang jarang terjadi. IRIDA

ditandai oleh anemia mikrositik hipokrom yang parah, rendahnya serum besi dan

saturasi transferin, sedangkan level feritin normal hingga tinggi diikuti dengan

tingginya level hormon hepsidin secara berlebihan. Penyakit ini disebabkan oleh

hilangnya fungsi akibat mutasi pada gen TMPRSS6 yang mengkode matriptase-2

(MT2) sebagai suatu regulator negatif transkipsi hepsidin. Pada individu dengan

level hepsidin yang tinggi, hepsidin mencegah absorbsi zat besi pada duodenum

dan besi yang diproses ulang oleh makrofag. Lebih jauh lagi, variasi genetik

TMPRSS6 dapat memodulasi fenotip hematologis dan status besi.4

Secara normal, gen TMPRSS6 memberikan instruksi untuk membuat

protein yang disebut MT2. Protein ini merupakan bagian dari jalur sinyal yang

13

mengontrol kadar protein lain yang disebut hepsidin, yang merupakan tombol

pengatur keseimbangan zat besi dalam tubuh. Ketika kadar besi darah rendah,

jalur sinyal ini akan mengurangi produksi hepsidin, yang memungkinkan lebih

banyak zat besi dari makanan yang akan diserap melalui usus dan diangkut dari

situs penyimpanan (terutama di hati dan limpa) ke dalam aliran darah. Besi

merupakan komponen penting dari hemoglobin, yang merupakan molekul dalam

sel darah merah yang membawa oksigen. Nama resmi dari gen ini

"Transmembran Protease, Serin 6". TMPRSS6 adalah simbol resmi gen. Gen

TMPRSS6 adalah bagian dari PRSS (peptidase serin). Gen TMPRSS6 terletak di

22q12.3 lokasi sitogenetik pada kromosom 22. Gen TMPRSS6 terletak di lengan

panjang (q) kromosom 22 pada posisi 12,3.18

Gambar 2.3. Letak gen TMPRSS6 Sumber : http://ghr.nlm.nih.gov/gene/TMPRSS6

rs855791 merupakan SNP pada gen TMPRSS6. SNP ini memiliki genotip

normal atau wildtype (C;C), dan heterozygot pada (C;T) dengan nilai hemoglobin

rata-rata lebih rendah 0,1 g/dL, serta mutant (T;T) dengan nilai hemoglobin rata-

rata lebih rendah 0,2 g/dL.19

Hasil penelitian yang dilakukan oleh Benyamin, dkk

(2009), memperlihatkan hubungan yang kuat antara SNP rs855791 dengan kadar

Hb dan MCV pada remaja Australia. Alel T pada rs855791 memperlihatkan

penurunan rata-rata kadar Hb dan MCV. Hubungan antara TMPRSS6 dengan

kadar Hb memiliki hasil yang bermakna pada setiap kelompok sampel (remaja,

dewasa, dan campuran).20

Sehingga kadar Hb dapat digunakan sebagai alat ukur.

Penelitian yang dilakukan oleh Chambers, dkk (2009), memperlihatkan

hubungan antara mutasi pada TMPRSS6 dengan level hemoglobin di dalam

http://ghr.nlm.nih.gov/gene/TMPRSS6

14

darah. SNP diidentifikasi dari ras Eropa dan India Asia, hasilnya memperlihatkan

hubungan yang sangat kuat pada rs855791 (G>A). Alel A pada RS855791 lebih

banyak berhubungan dengan level hemoglobin yang rendah pada ras India Asia

dibanding dengan ras Eropa. Sebesar 19% individu dengan ras Eropa dan 27%

individu dengan ras India Asia yang memiliki genotip AA pada rs855791

memiliki konsentrasi hemoglobin rata-rata 0,2% lebih rendah dibandingkan

dengan individu yang memiliki genotip GG. Hasil analisis penelitian tersebut,

menunjukkan bahwa alel A memiliki persamaan dengan alel T. Setiap alel A

mengindikasikan asosiasi 0,11 g/dL konsentrasi Hb yang lebih rendah.21

2.1.6. Regulasi Ekspresi Hepsidin

Jumlah besi dalam plasma menentukan availabilitas besi pada eritropoiesis

dan fungsi selular. Besi berikatan dengan transferin [Fe(III)-Tf] dan dapat segera

diambil oleh seluruh jenis sel melalui ekspresi reseptor transferin 1 (TfR1).

Homeostasis besi dijaga oleh liver-expressed peptide hormone hepcidin yang

menjadi pusat dari regulasi besi dalam plasma. Hepsidin meregulasi absorbsi besi

di usus yang masuk ke dalam plasma, dalam hal ini makrofag mendaur ulang

eritrosit yang sudah rusak, dan mobilisasi besi dari penyimpanan hepar. Hepsidin

yang berikatan dengan iron exporter ferroportin yang berada pada permukaan

iron-releasing cells akan menurunkan regulasinya, hal tersebut menyebabkan

degradasi dan menurunkan level besi dalam plasma. Availabilitas besi secara

sistemik, kebutuhan besi untuk eritropoesis, hipoksia, dan inflamasi meregulasi

level hepsidin dalam plasma. Penelitian mengenai mekanisme yang mendasari

frequent iron related disorders, seperti hemokromatosis herediter, talasemia, atau

anemia akibat penyakit kronik menyediakan pengetahuan terhadap regulasi

hepsidin.3

MT2 mendegradasi Hemojuvelin (HJV), HJV bertindak sebagai co-

reseptor Bone Morphogenetic Protein (BMP). HFE dan TfR2 bersama HJV akan

mengaktivasi BMP sehingga terjadi ekspresi dari gen HAMP. HFE dipindahkan

dari TfR1 oleh Transferrin-iron complex [Tf-Fe(III)] dengan konsentrasi tinggi.

BMP akan berikatan dengan reseptor BMP tipe 1 dan 2 yang akan mengaktivasi

15

fosfolirasi protein reseptor activated SMAD, dan pada akhirnya protein hepsidin

dibentuk. Proses ini terjadi di dalam sel hepar.3

Gambar 2.4. Siklus zat besi–mekanisme adaptasi tubuh pada defisiensi besi Sumber : Camaschella, 2015.

Gambar 2.5. Ekspresi gen HAMP Sumber : Falco dkk, 2013

16

2.1.7. Isolasi Genom

2.1.7.1. Persiapan untuk Human Genomic DNA

Secara umum, sekitar 90% DNA terdapat di dalam nukleus

(kromosom). Pada studi genetika, isolasi DNA lebih banyak berasal dari sel darah

tepi. Namun karena prosedurnya yang invasif, sulit untuk memperoleh sampel

dari teknik tersebut. Sumber DNA lain dapat berasal dari sel mukosa pipi yang

diperoleh dengan pencucian mulut menggunakan salin (teknik yang non invasif

dan tidak menyebabkan perdarahan). Isolasi DNA dari sel bucal lebih murah dan

membutuhkan jumlah yang sedikit, dan dapat disimpan dalam waktu yang lama.

Teknik lain menggunakan folikel rambut dan biasa digunakan sebagai teknik

investigasi pada kasus kriminal. Sampel yang berasal dari urin bermanfaat dalam

mendeteksi kasus doping dan drug screening test. Tujuan dari isolasi DNA adalah

mengisolasi dan mempurifikasi berat DNA dalam jumlah yang banyak.22

Berikut

beberapa tahapan dalam purifikasi DNA.

a. Cell breakage (pemecahana sel)

Pemecahan sel merupakan langkah awal dalam purifikasi DNA. Teknik

ini dapat membuka sel dan memperoleh DNA yang intak menggunakan bahan

kimia berupa detergent dan/atau prosedur enzimatis. Detergen dapat melarutkan

asam lemak membran sel dan mengakibatkan sel lisis. Detergen juga memiliki

efek inhibitor terhadap seluruh DNAse enzim selular dan dapat mendenaturasi

protein, dengan demikian membantu dalam pembersihan protein dari larutan

tersebut.23

b. Removal of protein (Membuang protein)

Langkah kedua dalam purifikasi adalah membuang kontaminan berupa

protein dari sel lisis. Prosedur ini disebut dengan deproteinisasi. Prinsip kerja

prosedur ini bergantung pada perbedaan antara bentuk fisik antara asam nukleat

dan protein. Perbedaan ini terletak pada kelarutan, volume spesifik parsial,

sensitifitas terhadap enzim pencernaan.23

Deproteinisasi menggunakan pelarut organik merupakan cara yang

umum digunakan. Asam nukleat merupakan molekul hidrofilik dan sangat mudah

17

larut di dalam air. Sedangkan protein, mengandung banyak residu hidrofobik yang

menyebabkan protein secara parsial larut di dalam pelarut organik. Pelarut organik

biasanya mengandung fenol dan kloroform. Metode yang menggunakan fenol

sebagai agen deproteinisasi dikenalkan oleh Kirby (1957), sehingga dikenal

sebagai Metode Kirby. Penggunaan campuran kloroform isoamil alkohol

dikenalkan oleh Marmur, sehingga dikenal Metode Marmur. Metode ini

mendasari banyak modifikasi dan pengembangan dari waktu ke waktu.23

Penggunaan fenol pada metode Kirby memiliki beberapa prinsip. Fenol

pada suhu ruang akan membentuk kristal, dengan adanya kandungan air 20% akan

membentuk suspensi yang mengandung butiran-butiran fenol tersebar di dalam

molekul air. Molekul protein secara umum mengandung banyak residu

hidrofobik, yang mana terkonsentrasi dibagian tengah molekul. Ketika protein

bercampur dengan fenol dalam volume yang sama, beberapa molekul fenol akan

terlarut dalam fase cair (kurang lebih 20% air dan 80% fenol). Sehingga fenol

dapat menembus masuk ke dalam protein, menyebabkan protein membengkak dan

rusak. Protein yang telah terdenaturasi akan larut di dalam fenol. Sehingga tersisa

asam nukleat. Asam nukleat tidak memiliki molekul yang bersifat hidrofobik

sehingga tidak larut di dalam fenol.23

Kekurangan metode Kirby adalah produk oksidasi dari fenol dapat

bereaksi secara kimia dengan molekul DNA (dan RNA). Fenol juga sangat toksik

dan membutuhkan prosedur pembuangan. Untuk mengurangi efek tersebut,

beberapa modifikasi yang dapat dilakukan sebagai berikut.23

Menggunakan detergen ionik.

Menggunakan reaksi enzimatis untuk membuang protein sebelum

ekstraksi fenol. Hal tersebut menurunkan kebutuhan fenol yang akan

digunakan. Sehingga kemungkinan hilangnya molekul DNA dapat

diturunkan.

Menambahkan 8-hydroxyquinoline (8HQ) kedalam fenol. 8HQ

meningkatkan kelarutan fenol di dalam air. Dengan adanya senyawa

ini, fenol dapat diencerkan pada suhu ruang dengan 5% air. 8HQ

juga mudah teroksidasi sehingga memegang peranan penting dalam

anti-oksidan, menjaga fenol mengalami oksidasi. Bentuk dari 8HQ

18

berwarna kuning dan saat teroksidasi menjadi tidak berwarna, hal ini

merupakan indikator yang baik yang dapat terlihat.

Penggunaan dari metode Marmur berdasarkan pada karakteristik dari

pelarut organik. Kloroform tidak larut dalam air dan meskipun banyak ektraksi

tidak mengakibatkan hilangnya DNA ke dalam fase organik.23

c. Removal of RNA (Membuang RNA)

Prinsip pembersihan RNA dari DNA menggunakan reaksi enzimatik.

Konsekuensi dari prosedur ini tidak dapat membuang semua RNA secara bersih.

Prosedur ini menggunakan dua ribonuklease, yaitu ribonuklease A dan

ribonuklease T1.

Ribonuklease A (RNase A) merupakan endoribonuklease yang dapat

memotong RNA setelah residu C dan U. Reaksi tersebut menghasilkan

oligonukleotida yang diakhiri dengan 3’–phosphorylated pyrimidine nucleotide.

Ribonuklease T1 (RNase T1) memotong dsRNA dan ssRNA setelah residu G,

menghasilkan oligonukleotida yang diakhiri dengan 3’–phosphorilated guanosine

nucleotide. Karena kedua enzim tersebut spesifik terhadap RNA, penggunaan

kedua enzim tersebut dalam RNA removal pada sampel DNA sangat

direkomendasikan. Penggunaan hanya salah satu enzim akan menghasilkan DNA

yang terkontaminasi dengan oligonukleotida dalam jumlah yang banyak.

Sehingga dapat mengganggu pembacaan spektofotometri.23

d. Concentrating the DNA (pemekatan DNA)

DNA didapatkan dengan cara pengendapan menggunakan alkohol.

Dalam prosedur ini digunakan dua macam alkohol yakni ethanol dan isopropanol.

Pengendapan menggunakan alkohol berdasarkan pada fenomena penurunan

kelarutan asam nukleat di dalam air. Kutub positif air berinteraksi secara kuat

dengan kutub negatif kelompok fosfodiester DNA. Interaksi ini menyebabkan

DNA larut dalam air. Sedangkan ethanol tidak dapat berinteraksi dengan kutub

negatif DNA seperti air. Sehingga asam nukleat tidak larut di dalam ethanol.23

Penggantian 95% molekul air di dalam DNA dapat menyebabkan DNA

mengendap. Untuk mengendapkan DNA dengan konsntrasi ethanol yang rendah,

aktivitas dari molekul air harus diturunkan. Hal ini dapat dilakukan dengan cara

menambahkan garam di dalam larutan DNA.23

19

e. Determination of the purity and quantity of DNA (Pengukuran kemurnian dan

jumlah konsenrasi DNA)

Untuk mengukur kemurnian DNA hasil isolasi, dapat dilakukan

pembacaan dengan alat spektofotometer menggunakan cahaya ultraviolet (UV).

Keberadaan kontaminan berupa protein dapat diketahui dari rasio nilai optical

density (OD) hasil isolasi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Hasil

isolasi dinyatakan murni bila nilai rasio A260 : A280 adalah 2,0. Jika rasio kurang

dari 2,0, maka konsentrasi DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus

berikut.23

N (μg ml-1) = 70 A260 – 40 A280

A260 dan A280 merupakan daya serap DNA pada panjang gelombang 260 nm dan

280 nm. Indikator yang lebih baik dari kemurnian sampel DNA adalah rasio A260 :

A234. DNA memiliki daya serap minimum pada 234 nm dan daya serap protein

tinggi pada 205 nm. Rasio A260 : A234 merupakan indikator yang sangat sensitif

untuk menentukan kontaminasi protein. Rasio antara 1,8-2,0 menunjukkan asam

nukleat yang murni. A260 dan A234 merupakan daya serap sampel DNA pada

panjang gelombang 260 nm dan 234 nm. Dengan menggunakan kedua panjang

gelombang tesebut, konsentrasi DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus

berikut.23

N(μg ml-1

) = 52,6 A260 – 5,24 A234

Identifikasi kontaminasi memiliki makna tertentu. Jika rasio 260/280

rendah, maka terdapat kontaminan yang diserap pada gelombang 280 nm. Hal

tersebut bisa disebabkan oleh fenol atau reagen lain pada protokol dan konsentrasi

asam nukleat yang sangat rendah (>10 ng/uL). Meskipun kualitas DNA

merupakan hal yang penting, namun bergantung kembali pada teknik apa yang

digunakan.24

20

2.1.8 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Prinsip dasar PCR dapat dikatakan sederhana. Seperti namanya yakni

reaksi berantai: satu molekul DNA digunakan untuk menghasilkan dua salinan,

lalu empat, delapan dan seterusnya. Penggandaan terus menerus ini dilakukan

oleh protein tertentu yang dikenal sebagai polimerase, enzim yang mampu

membuat satu untaian DNA individu untuk membentuk untaian molekul yang

panjang. Oleh karena itu diperlukan fragmen DNA yang terdiri dari empat asam

nukleat, yakni adenin (A), timin (T), sitosin (C) dan guanin (G). Mereka juga

membutuhkan fragmen kecil DNA, yang dikenal sebagai primer. Jika bahan telah

tersedia, enzim akan membentuk fragmen baru sama seperti pada template. PCR

adalah metode digunakan untuk memperbanyak salinan dari setiap untai tertentu

asam nukleat. Hal ini berarti PCR selektif memperkuat sebuah segmen tertentu

DNA.25

Secara umum PCR membutuhkan target DNA sepanjang 100-1000 base

pairs (bp). Secara teknik sulit untuk mengamplifikasi DNA dengan panjang >500

bp. Primer yang biasa digunakan memiliki panjang 20-20 nukleotida. Dalam

proses PCR, dibutuhkan beberapa bahan seperti thermal cycler dan PCR

amplification mix, yang terdiri dari sampel dsDNA, thermostable DNA

polymerase, dua primer oligonukleotida, deoxynucleotide triphosphat (dNTPs),

dan penyangga reaksi yang mengandung ion magnesium dan komponen lainnya

(22). Berikut prosedur dalam PCR yang umum digunakan :

a. DNA didenaturasi oleh panas dengan suhu 90-95oC selama 20 detik.

Dua untai terpisah karena rusaknya hidrogen yang mengikat mereka.

b. Campuran reaksi mengandung mengandung 4 deoxynucleotide

triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) dan thermostable DNA

polymerase. DNA polimerase tidak mengalami denaturasi pada suhu

yang tinggi. Campuran tersebut kemudian mengalami pendinginan,

suhu diturunkan menjadi (50-65oC).

21

c. Setiap helai molekul DNA mengalami proses annealing dengan primer

oligonukleotida melengkapi kedua ujung urutan target yang

membutuhkan waktu 20 detik.

d. Suhu dinaikkan ke 60-75oC dan primer diperluas oleh aksi polimerase

DNA selama 30 detik. Polimerase yang mensintesis urutan

komplementer 5 'ke 3' arah dari masing-masing primer. Jika template

mengandung nukleotida A, enzim menambahkan pada nukleotida T

untuk primer. Jika template berisi G, ia menambahkan C untuk rantai

baru. Pada titik ini ada akan persis dua salinan dari urutan DNA target.

e. Campuran dipanaskan lagi di 90-95oC untuk denaturasi molekul dan

memisahkan helai dan siklus diulang. Setiap helai baru kemudian

bertindak sebagai template untuk siklus sintesis berikutnya. Jadi

amplifikasihasil pada eksponensial (logaritmik) tingkat, yaitu jumlah

DNA yang dihasilkan ganda pada setiap siklus. Produk diperkuat pada

akhir PCR yang disebut amplikon.

2.1.9. Metode High Resolution Melt (HRM)

Metode High Resolution Melt (HRM) merupakan metode cepat yang

dikembangkan untuk menganalisis mutasi genetik atau variasi sekuensi dari asam

nukleat setelah dilakukan analisis PCR. HRM memudahkan peneliti secara cepat

mendeteksi dan mengkategorikan mutasi genetik (contoh : Single Nucleotida

22

Polymorphisms (SNPs)), identifikasi varian gen baru tanpa sekuensing (gene

scanning) atau mendeterminasi variasi genetik pada populasi.26

Langkah awal dari protokol HRM adalah amplifikasi area yang akan

dianalisis dengan menggunakan teknik PCR standar sehingga terdapat double

stranded-DNA (dsDNA) yang dapat mengikat zat warna. Pewarna tersebut

memiliki daya floresensi yang tinggi saat berikatan dengan dsDNA dan sangat

lemah pada daerah yang tidak berikatan.Perubahan ini memungkinkan pengguna

untuk memantau amplifikasi DNA selama PCR (sebagai PCR kuantitatif).26

Setelah langkah PCR selesai, target diperkuat secara bertahap dengan cara

didenaturasi secara bertahap dengan meningkatkan suhu sedikit demi sedikit,

untuk menghasilkan profil karakteristik leleh; ini yang disebut sebagai Melting

Analysis. Target yang sudah diamplifikasi didenaturasi secara bertahap,

melepaskan pewarna, yang menghasilkan penurunan fluoresensi.Ketika

pengaturan sudah tepat, HRM cukup sensitif untuk memungkinkan deteksi

perubahan basa tunggal antara urutan nukleotida yang dinyatakan identik. HRM

menggunakan pewarna yang termasuk murah dan sedikit optimasi dibandingkan

dengan sistem yang sama seperti Taqman dan Fluorescence Resonance Energy

Transfer (FRET) probes. Dibandingkan dengan metode tersebut, HRM lebih

sederhana dan lebih cost-effective untuk sampel yang banyak.26

2.1.9.1 Analisis Hasil HRM

Dengan software Light Cycler 480 Roche yang benar, analisis data dapat

dilakukan terhadap beberapa sampel secara simultan. Hal ini penting untuk

mengetahui apa yang harus dicari ketika menganalisis hasil; kesalahan tak terduga

yang dilakukan selama pemasangan dapat diidentifikasi pada saat ini. Perubahan

melt plots yang rendah sering terlihat sebagai derivative plot (-dF / dT terhadap

T); Namun, data melting curve harus dianalisis secara berbeda. Bagian ini

menjelaskan analisis hasil HRM dengan contoh produk 124 bp meliputi jenis IV

SNP(rs641805). Masalah yang paling umumdihadapi dan solusi dari masalah

tersebut akan dibahas.26

23

a. Plot amplifikasi

Reproduksibilitas amplifikasi lebih penting pada analisis HRM daripada

efisiensi amplifikasi (dibandingkan dengan PCR kuantitatif). Misalnya, analisis

HRM masih bisa dilakukan jika produk amplifikasi lebih lambat daripada

perkiraan (yaitu karena keterbatasan dalam desain primer), asalkan semua sampel

konsisten.26

b. Data mentah kurva leleh

Data yang dikumpulkan selama HRM yang dianalisis memiliki rentang

awal (pre-melt) pembacaan fluoresensi. Variasi ini membuat sulit untuk

menganalisis hasil dengan benar, meskipun kelompok genotip yang berbeda dapat

terlihat. Gambar 2.6 A menunjukkan bagaimana pemilihan daerah pre- dan post-

melt digunakan untuk menyelaraskan data. Pre- dan daerah post-melt harus dipilih

untuk setiap set primer, dengan posisi paralel ganda-bar seperti yang ditunjukkan.

Hal ini penting untuk menyesuaikan bar ini sehingga wilayah lelehan tidak dipilih.

Jika pre- atau post- daerah leleh tidak jelas, mungkin untuk mengulang HRM

menjalankan saja (tanpa mengulangi langkah amplifikasi), dan menyesuaikan

kisaran suhu yang diperlukan.26

c. Data Normalisasi

Jika data yang dinormalisasi benar, akan muncul seperti yang

ditunjukkan pada gambar 2.6 B yang disebut 'data normalisasi'. Pada gambar 2.6

B, variasi fluoresensi yang dapat dilihat pada gambar 2.6 A telah dihilangkan, dan

hanya kisaran suhu antara bar luar daerah sebelum dan sesudah mencair

ditampilkan. Genotip sekarang lebih berbeda, tetapi dua sampel homozigot (merah

dan biru) yang masih sulit untuk dibedakan.26

d. Perbedaan grafik

Beberapa aplikasi perangkat lunak HRM memungkinkan perhitungan

perbedaan alur. Hal ini didapatkan dengan mengurangi data fluoresensi

dinormalisasi dari genotip yang ditetapkan pengguna dari yang masing-masing

sampel lainnya dalam analisis HRM. Pada gambar 2.6 C, genotip A / A telah

dipilih sebagai dasar (genotip apapun dapat dipilih, tetapi biasanya homozigot

yang digunakan). Posisi masing-masing sampel relatif terhadap baseline memiliki

24

plot terhadap temperatur. Bentuk analisis HRM ini merupakan bantuan untuk

memvisualisasikan normalisasi data.26

HRM memiliki sifat yang sangat sensitif sehingga desain uji nya sangat

penting untuk dilakukan dengan baik. Perhatian khusus harus diberikan untuk

desain primer, reagen PCR yang digunakan dan kondisi siklus. Perbedaan

pengaturan awal dapat sangat mempengaruhi hasil akhir. Faktor-faktor seperti

kualitas genom DNA, desain primer, dan konsentrasi MgCl2 semua akan

mempengaruhi hasil. Bagian berikut membahas masing-masing faktor-faktor yang

harus diperhatikan.26

T/T A/A

A/T

25

Gambar 2.6. Analisis data HRM dari SNP tipe 4 (A/T).A. Data mentah

memperlihatkan pre-melt, melt dan post-melt. Memperlihatkan variasi fluoresensi

dan posisi pre dan post melting. B. Data normalisasi C. Grafik lain dari data

normalisasi Sumber : https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution_Melt_

Analysis_Guide.pdf

Kualitas dan kuantitas DNA merupakan salah satu faktor utama yang

dapat mengurangi kualitas hasil. Hal tersebut dapat terjadi karena akumulasi dari

penyangga dari template DNA sampel atau pada saat proses persiapan. Pemurnian

DNA yang tidak sesuai teknik dapat mempengaruhi hasil. Garam bisa

mempengaruhi proses melting produk PCR, dan dapat mengakibatkan sensitivitas

rendah, reproduktifitas sedikit dan keluaran hasil genotip yang salah. Bufer yang

terakumulasi dari template DNA tidak hanya akan memodifikasi Tm, proses,

melting selama HRM, namun juga dapat mendorong amplifikasi yang spesifik

selama PCR26

. Untuk hasil yang optimal berikut dianjurkan beberapa hal dibawah

ini:

• Idealnya, semua sampel DNA yang akan dianalisis (termasuk genotype

kontrol) harus diekstrak menggunakan ekstraksi DNA dengan metode

atau kit yang sama.

• Beberapa kit menggunakan konsentrasi tinggi garam untuk elusi DNA

dari kolom. Jadi, semua sampel template harus dielusi dengan

kandungan rendah garam, idealnya 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.

• Sampel DNA harus terkonsentrasi setelah pemurnian. Template

kemudian dapat diencerkan dengan 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 sebelum

A/A

A/T

T/T

https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution_Melt_%20Analysis_Guide.pdf

https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution_Melt_%20Analysis_Guide.pdf

26

digunakan. Hal ini membantu untuk mengurangi variasi larutan

penyangga antara sampel.

• Penambahan volume yang sedikit pada template DNA akan

mengurangi akumulasi garam dalam reaksi; idealnya volume terendah

template yang dapat secara akurat ditambahkan harus digunakan (1-2

ml).

• Semua sampel harus memiliki konsentrasi akhir DNA yang sama

disetiap uji. Tabel 2.4 menjelaskan rincian konsentrasi DNA yang

dianjurkan untuk berbagai template. Pada template dengan konsentrasi

rendah, ada kesempatan yang lebih besar menggabungkan mutasi di

awal PCR yang akan mempengaruhi perilaku melting; konsentrasi

tinggi DNA akan menghasilkan latar belakang fluoresensi yang tinggi

karena meningkatnya interkalasi pewarna ke dalam dsDNA.

• Kontrol positif untuk semua genotip harus dimasukkan dan sebaiknya

pada konsentrasi yang sama seperti sampel uji. DNA kontrol juga

harus dielusi dan/atau diencerkan dalam bufer yang sama sebagai

sampel.

Tabel 2.4. Konsentrasi DNA yang dianjurkan untuk berbagai template

Jenis DNA Rekomendasi Konsentrasi

DNA untuk analisis HRM

Genomic DNA (gDNA) 10 ng – 100 pg

Plasmid DNA (1-10kb) 1 ng – 10 fg

Amplicon DNA 10 pg – 1 fg

Sumber : https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution

_Melt_Analysis_Guide.pdf

https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution%20_Melt_Analysis_Guide.pdf

https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution%20_Melt_Analysis_Guide.pdf

27

2.2. Kerangka Teori

Gambar 2.7. Kerangka teori

28

2.3. Kerangka Konsep

Gambar 2.8. Kerangka konsep

2.4. Definisi Operasional

Dalam penelitian ini peneliti menggunakan istilah-istilah yang

didefinisikan sebagai berikut.

Tabel 2.5. Definisi operasional

No. Variabel Definisi Alat Ukur Skala Skor

1.

SNP

rs855791

(CT)

Variasi

sekuensing

DNA pada gen

TMPRSS6.7

Light

Cycler

480®

Roche

04 909 631

001

Nominal

1. Wildtype

2. Heterozygote

3. Mutant

29

2.

Kadar

Hemoglobin

Kadar

metaloprotein

(protein yang

mengandung

zat besi) di

dalam sel

darah merah

yang berfungsi

sebagai

pengangkut

oksigen dari

paru ke seluruh

tubuh.

Dinyatakan

dalam satuan

g/dL.17

Strip dan

Alat cek

kadar Hb

(Easy

Touch®

GCHb

meter)

Ordinal

Laki-laki

1. Rendah:

<13,5

2. Normal:

13,5-16,5

Perempuan

1. Rendah:

<12,1

2. Normal:

12,1-15,1

30

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah penelitian

eksperimental. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan alat Light Cycler

480®

Roche 04 909 631 001 dengan menggunakan primer spesifik rs855791 (C>T)

untuk melakukan skrining Iron Refractory Deficiency Anemia dan pemeriksaan

kadar hemoglobin dengan menggunakan Easy Touch®

GCHb meter.

3.2. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta dengan mengambil data primer yakni genom

mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter angkatan 2012 hingga 2014.

Penelitian dilakukan dari bulan Mei hingga Oktober 2015.

3.3. Populasi dan Sampel

3.3.1 Populasi Terjangkau

Populasi terjangkau penelitian ini adalah mahasiswa Program Studi

Pendidikan Dokter angkatan 2012 hingga 2014.

3.3.2 Kriteria Pemilihan

Kriteria pemilihan sampel dalam penelitian ini terdiri dari kriteria inklusi

dan ekslusi. Kriteria inklusi mahasiswa Pendidikan Dokter angkatan 2012 hingga

2014 yang telah mengisi lembar informed consent (lampiran 1). Pada penelitian

ini kriteria eksklusi tidak ditentukan karena peneliti ingin melihat hasil skrining

seluruh sampel dan melihat hubungan antara hasil skrining dan nilai kadar Hb.

31

3.3.3 Perkiraan Besar Sampel

Dalam penentuan jumlah sampel, peneliti menggunakan perhitungan

Slovin dengan alasan total jumlah mahasiswa PSPD dari 2012-2014 kurang dari

500 orang. Rumus perhitungan adalah:

n = N/(1+Ne2)

Keterangan:

n = Besarnya sampel

N = Jumlah sampel

e = Batas toleransi kesalahan 10 % (0.1)

Maka ditemukan:

n = 300/(1+300x0.12)

= 300/4 = 75 orang

Jadi besar sampel minimal yang dibutuhkan untuk penelitian ini adalah 75

orang sampel.

3.3.4 Teknik Pemilihan Sampel

Sampel yang dipilih berdasarkan Simple Random Sampling dimana sampel

diambil secara acak berdasarkan tabel.

3.4 Alat dan Bahan Uji

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dijelaskan dalam tabel

sebagai berikut.

Tabel 3.1. Alat dan bahan penelitian

Alat Bahan Keterangan

Pengambilan sampel (darah)

Spuit 3 cc

Torniquet

Tabung berisi EDTA

Handscoon

Alcohol swab

- -

32

(Lanjutan)

Alat Bahan Keterangan

Pengukuran kadar hemoglobin

Easy Touch®

GCHb meter

Alcohol swab

Blood Hemoglobin

Test Strips

Nilairujukan :

Normal Laki-laki

13,5-16,5 g/dL

Normal perempuan

12,1-15,1 g/dL

Isolasi Genom DNA dari darah

Tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml

steril

Water bath AS ONE TRW-42TP,

60oC (untuk rehidrasi DNA

yang cepat)

GD column

2 mL collection tube

Microcentrifuge Eppendorf 5417

R

Vortex DAAD

Pipetmikro Nichipet EX Nichiryo

ukuran 2-20 μL dan 20-200 μL

Pipetmikro BIORAD ukuran 100-

1000 μL

Tipmikro Biologix ukuran 10 μL, 200 μL, dan 1000 μL

Biomedical Freezer SANYO

Aluminium foil

Whole Blood

RBC Lysis Buffer

GB Buffer

Ethanol Absolut

W1 Buffer

Wash Buffer

Elution Buffer

300 μL

900 μLdan 100 μL

200 μL

200 μL

400 μL

600 μL

50 μL

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil isolasi DNA

Maestro Nano Drops

Aquadest

Micropipet

Tip

Genom DNA 1 μL

Elektroforesis genom DNA

Elektroforesis ATTO My Power II

300 AE-8135

Microwave SHARP low wattage

Timbangan analitik AdventureTM

Gel doc system

Printgraph ATTO AE-6905 CF

CCD camera controller

Penggaris sumur

Gelas kimia

Gelas ukur sibata

Agarose

Ethidium bromide

Loading dye

Plastic Wrap

Buffer Tris Asetat

EDTA (TAE) 1x

33

(Lanjutan)

Real Time PCR HRM

Light Cycler 480®

II Roche 04 909

631 001

Multiwall Plate Light

Cycler®

Roche

HRM Kit

MgCl2

Primer Forward dan

Reverse

dH2O

sampel DNA

7,5 μL

1,2 μL

0,75 μL

1,8 μL

3,75 μL

3.5. Cara Kerja Penelitian

3.5.1. Pengumpulan Data

Cara pengambilan data dalam penelitian ini yaitu data primer. Data

responden diperoleh dengan cara tes kadar Hb mahasiswa dengan menggunakan

alat EasyTouch GCHb®

mater, dan punksi vena untuk skrining SNP rs855791

(C>T).

Responden sebanyak 102 orang yang telah mengisi lembar informed

consent (lampiran 1) dilakukan pengambilan darah sebanyak 3 cc satu kali dan

pemeriksaan kadar Hb. Sampel darah diberi nomor dan disimpan dalam cold room

untuk dilakukan isolasi genom DNA, kemudian dilakukan teknik Real Time PCR-

HRM dan selanjutnya dianalisis.

3.5.2. Desain gblock dan Primer

Proses perancangan gblock dan primer membutuhkan TMPRSS6 Gene

Sequence untuk melihat secara keseluruhan urutan basa nukleotida dan melihat

area mutasinya. Langkah kerja desain primer yang spesifik untuk mendeteksi

IRIDA pada penelitian ini adalah sebagai berikut :

a. Website http://simgene.com/Primer3 dibuka.

http://simgene.com/Primer3

34

b. Data sekuensing, primer forward dan reverse TMPRSS6 disalin dan

dipindahkan kedalam kolom data primer3.

Primer yang digunakan dalam penelitian ini adalah5’ TCT GCA GAA

AGT GGA TGT GC 3’ (forward) dan 5’ CTC ACC TGA CAG GCA TCC TT 3’

(reverse).

c. Tombol “Pick Primers” ditekan. Kemudian Primer3 OUTPUT berikut ini

akan muncul.

35

Langkah kerja desain gBlock yang spesifik untuk mendeteksi IRIDA pada

penelitian ini adalah sebagai berikut :

a. Website https://www.idtdna.com/pages/products/genes/gblocks-gene-

fragments dibuka.

b. Tombol “Product & Services” ditekan. Kolom “gBlocks GeneFragments”

ditekan. Tombol “Order” ditekan.

https://www.idtdna.com/pages/products/genes/gblocks-gene-fragments

https://www.idtdna.com/pages/products/genes/gblocks-gene-fragments

36

c. Data sekuensing DNA TMRSS6 dimasukkan kedalam kolom data

sekuensing. Tombol “Test Complexity” ditekan.

3.5.3. Isolasi DNA

Setelah sampel darah diambil, dilakukan isolasi DNA untuk mendapatkan

genom DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)

Geneaid GB100 dengan langkah kerja seperti dalam tabel 3.2.Genom DNA yang

telah diisolasi dinilai apakah sudah terisolasi atau tidak dengan cara elektroforesis

dan dibaca menggunakan Gel documentation.

Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA-nya dengan

menggunakan alat Maestro Nano Drops. Sampel diambil sebanyak 1 μL, lalu

diletakkan di lensa nano, ditutup dan di-analized. Hasil kemurnian dan

konsentrasi akan langsung terbaca dilayar dan tersimpan.

37

Tabel 3.2. Tahapan isolasi genom DNA

Persiapan

Sampel

Fresh Blood

1. Darah sebanyak 300 μl kedalam 1,5 ml tabung mikrosentrifugasi

dimasukkan

2. 900 μl RBC Lysis Buffer kemudian ditambahkan dan dikocok.

3. Tabung diinkubasi 10 menit dalam suhu ruangan

4. Tabung disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 3000 rpm

selama 5 menit, supernatan dibuang.

5. 100 μl RBC Lysis Buffer ditambahkan untuk meresuspensi

endapan leukosit, kocok, kemudian diproses dengan cell lysis

Langkah

1

Cell Lysis

6. 200 μl GB Buffer ditambahkan kedalam tabung tadi

7. Tabung diinkubasi pada suhu 60o C selama 10 menit untuk

memastikan sampel terlisiskan.

8. Pada saat yang sama tabung lain berisi 50 μl Elution Buffer untuk

tiap satu sampel disiapkan, kemudian diinkubasi pada suhu 60o C.

9. Setelah tabung sampel tadi diinkubasi, tabung didinginkan di

suhu ruangan.

Langkah

2

DNA

binding

10. 200 μl ethanol absolute ditambahkan kedalam tabung tadi,

kemudian secara cepat dikocok selama 10 detik.

11. GD Column pada 2 mL Collection Tube disiapkan.

12. Campuran ethanol tadi dipindahkan kedalam GD Column

13. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 5 menit

14. Cairanpada 2 ml Collection Tube dibuang

15. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube

Langkah

3

Wash

16. 400 μl W1 Buffer ditambahkan kedalam GD Column kemudian

disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit

17. Cairan pada 2 ml Collection Tube dibuang


19. 600 μl Wash Buffer ditambahkan kedalam GD Column


21. Cairan pada 2 ml Collection Tube dibuang


38

23. Tabung disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk

mengeringkan matriks kolum

Langkah

4

DNA

Elution

Standar volume elution buffer untuk 1 sampel adalah 100 μl. Jika

sampel yang digunakan dalam volume yang sedikit, volume elusi

sekitar 30 – 50 μl dapat meningkatkan konsentrasi DNA.

24. GD Column yang sudah kering dipindahkan ke dalam tabung

mikrosentrifugasi yang steril

25. 50 μl Elution Buffer yang sudah diinkubasi ditambahkan ke dalam

matriks kolom, dibiarkan selama 3 menit


untuk mendapatkan hasil

3.5.3. Real Time PCR-HRM

Setelah dilakukan isolasi genom DNA, pemeriksaan skrining dilakukan

ketahap selanjutnya yakni Real Time PCR HRM dengan menggunakan alat Light

Cycler 480®

04 909 631 001. Kondisi reaksi untuk amplifikasi dari sistem

protokol untuk program High Resolution Melting adalah sebagai berikut.

Pre-inkubasi untuk aktivasi Fast Start Taq DNA Polimerase dan

denaturasi template

Amplifikasi dari DNA target

Melting dari amplikonuntuk peroleh data dengan resolusi tinggi

Pendinginan (cooling) dari kipas dan thermal chamber

Tabel 3.3 menunjukkan rekomendasi parameter yang digunakan dalam

Real Time PCR HRM sebagai gene scanning assay.

Langkah memulai genotyping analisa:

1. Pengenceran primer

Sebanyak 5 μL primer forward dari tabung induk diambil dan

dipindahkan kedalam tabung mikro 1, kemudian ditambahkan 5 μL

dH2O. Hasil pengenceran didapatkan konsentrasi sebesar 50 μM.

(Lanjutan)

39

Tabel 3.3. Parameter PCR yang direkomendasikan untuk Light Cycler 480®

System PCR Run untuk membuat gene scanning assay dengan menggunakan

Light Cycler 480®

High Resolution Melting Master

Sumber : http://sydney.edu.au/medicine/bosch/facilities/molecular-biology/nucleicacid/Lightcycler

480GeneScanningSoftwareV1.5. pdf

http://sydney.edu.au/medicine/bosch/facilities/molecular-biology/nucleicacid/Lightcycler%20480GeneScanningSoftwareV1.5.%20pdf

http://sydney.edu.au/medicine/bosch/facilities/molecular-biology/nucleicacid/Lightcycler%20480GeneScanningSoftwareV1.5.%20pdf

40

Sebanyak 5 μL primer reverse dari tabung induk diambil dan

dipindahkan kedalam tabung mikro 2, kemudian ditambahkan 5 μL

dH2O. Hasil pengenceran didapatkan konsentrasi sebesar 50 μM.

Sebanyak 1 μL primer forward dan 1 μL primer reverse dari

pengenceran diatas (50 μM) dipindahkan kedalam tabung mikro 3,

kemudian ditambahkan 8 μL dH2O. Hasil pengenceran didapatkan

konsentrasi 5 μM, hasil ini yang digunakan dalam mix untuk

menjalankan RT PCR HRM.

2. Pengenceran template DNA (genom sampel)

DNA sampel induk yang telah diukur konsentrasinya, kemudian

diambil 1 sebanyak 1 μL dan ditambahkan 9 μL dH2O. Hasil ini

yang digunakan sebagai template dalam menjalankan RT PCR

HRM.

Setelah dilakukan langkah diatas, kemudian dipersiapkan mix untuk HRM

di dalam tabung yang berisi HRM kit 7,5 μL, MgCl2 1,2 μL, primer campuran

hasil pengenceran 0,75 μL, dan dH2O 1,8 μL. DNA sampel dari hasil pengenceran

yang digunakan adalah sebanyak 3,75 μL. Kemudian DNA sampel dimasukkan

terlebih dahulu kedalam sumur template PCR baru ditambahkan mix tadi

sebanyak 11,25 μL. Sumur ditutup dengan penutup plastiknya, kemudian

dimasukkan kedalam alat Light Cycler dan dijalankan.

3.5.4. Analisis Data

Pengolahan data primer dilakukan dengan menggunakan program SPSS

versi 22. Agar analisis penelitian menghasilkan informasi yang benar, pengolahan

data dilakukan dengan tahapan editing, coding, processing, dan cleaning. Editing

merupakan kegiatan untuk melakukan pengecekan kelengkapan data rekam medis.

Coding merupakan kegiatan merubah data berbentuk huruf menjadi data

berbentuk angka atau bilangan. Setelah semua data diperiksa dan telah dilakukan

coding, selanjutnya dilakukan Processing yakni memasukkan data kedalam SPSS.

Tahap akhir dilakukan cleaning atau pembersihan data untuk mengecek kembali

apakah terdapat kesalahan data yang sudah dimasukkan.

41

3.5.4. Etika Penelitian

Penelitian ini dimintakan ethical cleareance (lampiran 2) dari panitia Etik

Penelitian PSPD (Program Studi Pendidikan Dokter) UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta. Semua data yang didapat dari hasil penelitian yang dipergunakan akan

dijaga kerahasiaannya.

42

3.5.5. Alur Penelitian

Gambar 3.1. Alur penelitian

43

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

4.1.1. Hasil Isolasi Genom DNA dari Whole Blood

Sampel yang digunakan pada penelitian ini berupa sampel DNA yang

diisolasi dari sel darah (whole blood). Sampel DNA yang digunakan terdiri dari

102 sampel DNA mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta. Isolasi dan purifikasi DNA dari sampel darah (whole blood)

dilakukan berdasarkan protokol Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)

Geneaid GB100. Kemudian untuk memeriksa apakah DNA telah terisolasi dan

terpurifikasi dengan baik dilakukan dengan gel elektroforesis yang dapat dilihat

pada gambar (lampiran 5).

Setelah itu dilakukan pemeriksaan kemurnian dan konsentrasi dari 102

sampel DNA genom yang dapat dilihat pada tabel (lampiran 6). Dari 102 sampel,

44,1 % memiliki kategori kemurnian rasio A260/A280 (1,8-2,0) baik, 8,8% tinggi,

dan 47,1% rendah. Rasio A260/A280 digunakan untuk identifikasi kontaminasi di

dalam DNA sampel. Rasio A260/A280 yang rendah dapat disebabkan oleh

kontaminasi fenol atau reagen pada saat isolasi, namun dapat pula disebabkan

oleh konsentrasi yang sangat rendah (>10 ng/uL) dari asam nukleat.24

Sampel

yang memiliki konsentrasi rendah sebanyak 8,8%. Meskipun rasio kemurnian

menentukan kualitas dari sampel, indikator kualitas DNA bergantung dari aplikasi

yang digunakan.24

4.1.2 Data Karakteristik Responden

Responden dalam penelitian ini adalah 102 mahasiswa Program Studi

Pendidikan Dokter angkatan 2012 hingga 2014 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Responden terdiri dari 37 laki – laki dan 61 perempuan dengan rentang usia 17 -

23 tahun.

44

Tabel 4.1. Karakteristik jenis kelamin responden

Frekuensi Persentase (%)

Jenis Kelamin Laki-laki 37 36,3

Perempuan 65 63,7

Total 102 100,0

Berdasarkan tabel 4.1 diketahui bahwa persentase laki – laki adalah 36,3% dan

perempuan 63,7%.

Tabel 4.2. Karakteristik usia responden

Usia Responden (tahun) Frekuensi Persentase (%)

17 3 2,9

18 18 17,6

19 26 25,5

20 28 27,5

21 24 23,5

23 3 2,9

Total 102 100,0

Berdasarkan tabel 4.2 diketahui bahwa presentase usia terbanyak dari 102

responden adalah 20 tahun. Rerata usia responden adalah 20 (17-23).

Berdasarkan hasil statistik deskriptif diketahui bahwa rerata Indeks Massa

Tubuh dari seluruh responden adalah 20,41 (15,22-33,61). Kemudian data indeks

massa tubuh dikelompokkan berdasarkan kriteria IMT Asia Pasifik untuk

mengetahui status gizi responden.

Tabel 4.3. Karakteristik Indeks Massa Tubuh responden

Kategori IMT Asia Pasifik Frekuensi Persentase (%)

BB kurang 18 17,6

Normal 60 58,8

BB lebih 9 8,8

Obes 1 12 11,8

Obes 2 3 2,9

Total 102 100,0

45

Berdasarkan tabel 4.3 diketahui bahwa kategori IMT terbanyak yakni normal

dengan presentase 58,8%.

4.1.3. Hasil Pengukuran Kadar Hemoglobin

Berdasarkan hasil statistik deskriptif diketahui bahwa rerata kadar

hemoglobin dari seluruh responden adalah 11,35 g/dL (8,00-18,50). Kemudian

data kadar hemoglobin dikelompokkan berdasarkan nilai rujukan untuk

mengatahui status anemia responden. Nilai rujukan yang digunakan yakni pada

laki-laki kadar normal hemoglobin (g/dL) adalah antara 13,5 hingga 16,5 dan pada

perempuan 12,1 hingga 15,1. Bila kadar hemoglobin kurang dari rentang tersebut,

responden dikelompokkan kedalam kategori anemia. Hasil dari pengelompokkan

tersebut didapatkan data sebagai berikut.

Tabel 4.4. Kategori kadar hemoglobin responden

Kategori Kadar Hemoglobin Frekuensi Presentase (%)

Non Anemia 22 21,6

Anemia 80 78,4

Total 102 100,0

Berdasarkan tabel 4.4 diketahui bahwa persentase anemia adalah 78,4%.

4.1.4. Hasil Analisis Kurva HRM

4.1.4.1. Analisis Kurva Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant)

Sampel yang telah dilakukan pemeriksaan mutasi gen dengan Real Time

PCR HRM akan memberikan hasil berupa kurva yang berbeda berdasarkan

temperatur leleh (lampiran 7). Berdasarkan analisis kurva HRM dari genom DNA

sampel, didapatkan data genotyping dari 102 sampel seperti dalam tabel 4.6.

Berdasarkan tabel 4.6 diketahui bahwa dari 102 sampel persentase wildtype 3,9%,

heterozygote 72,5%, dan mutant 23,5%.

46

Tabel 4.5.Genotyping SNP rs855791 dari genom DNA responden

Genotyping Frekuensi Persentase (%)

Wildtype 4 3,9

Heterozygote 74 72,5

Mutant 24 23,5

Total 102 100,0

4.1.5. Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kadar Hemoglobin

Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan nilai rerata kadar

hemoglobin untuk jenis kelamin laki-laki sebesar 12,96 g/dL (SD 1,98) dan untuk

jenis kelamin perempuan 10,71 g/dL (SD 1,54).

Gambar 4.1. Rerata kadar hemoglobin menurut jenis kelamin

Hasil data yang diperoleh dari 102 responden pada penelitian ini diuji

normalitasnya dengan menggunakan Kolmogorov Smirnov test. Hasilnya adalah

data dari 102 responden terdistribusi normal dengan p value ≥ 0,05 (lampiran 8).

Sehingga dapat dilanjutkan dengan uji statistik menggunakan independent t-test.

Dari hasil uji independent t-test, didapatkan nilai p value ≤ 0,05 (lampiran 8) yang

47

berarti menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara jenis kelamin dengan

kadar hemoglobin (g/dL).

4.1.6. Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kategori Kadar Hemoglobin

Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan presentase

penderita anemia pada perempuan sebesar 86,15 % yang lebih tinggi daripada

laki-laki yakni 64,86 %. Sedangkan kategori non anemia sebanyak 13,85 % pada

perempuan dan 35,14 % pada laki-laki.

Tabel 4.6. Distribusi frekuensi kategori kadar hemoglobin berdasarkan jenis

kelamin

Jenis

Kelamin

Kategori Kadar Hb

Anemia Non Anemia Total

N % N % N %

Laki-laki 24 64,86 13 35,14 37 100

Perempuan 56 86,15 9 13,85 65 100

Kemudian dicari hubungan antara kategori jenis kelamin dan kategori

kadar hemoglobin (anemia dan non anemia). Dari hasil crosstabulation

didapatkan nilai observed 13, 24, 9, dan 56. Nilai expected yang didapatkan 8, 29,

14 dan 51. Sehingga tabel tersebut (lampiran 8) layak untuk diuji Chi-Square

karena tidak ada nilai expected yang kurang dari 5. Setelah dilakukan uji Chi-

Square, didapatkan nilai signifikansi dari Pearson Chi-Square sebesar 0,012.

Sehingga dapat disimpulkan terdapat perbedaan yang signifikan antara jenis

kelamin dan kategori kadar hemoglobin (anemia dan non anemia).

4.1.7. Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotyping (Wildtype,

Heterozygote, dan Mutant)

Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan presentase laki-

laki yang memiliki genotyping wildtype sebesar 5,41 %, heterozygote 67,57 %,

48

dan mutant 27,02 %. Presentase perempuan yang memiliki genotyping wildtype

sebesar 3,10 %, heterozygote 75,38 %, dan mutant 21,52 %.

Hasil data yang diperoleh dari 102 responden kemudian dicari hubungan

antara kategori jenis kelamin dan genotyping (wildtype, heterozygote, dan

mutant). Dari hasil crosstabulation didapatkan nilai observed 2, 25, 10, 2, 49, dan

14. Nilai expected yang didapatkan 1,5, 26,8, 8,7, 2,5, 47,2, dan 15,3. Tabel 2x3

(lampiran 8) tidak layak untuk diuji dengan Chi Square karena sel yang nilai

expexted-nya kurang dari 5 sebesar 33%. Oleh karena itu, digunakan uji

alternatifnya yakni uji Mann-Whitney dengan p value=0,707. Sehingga dapat

disimpulkan tidak terdapat hubungan yang signifikan antara jenis kelamin dengan

genotyping (wildtype, heterozygote, dan mutant).

Tabel 4.7. Distribusi frekuensi kategori genotyping menurut jenis kelamin

Jenis

Kelamin

Kategori Genotyping

Wildtype Heterozygote Mutant Total

N % N % N % N %

Laki-laki 2 5,41 25 67,57 10 27,02 37 100

Perempuan 2 3,10 49 75,38 14 21,52 65 100

4.1.8. Hasil Hubungan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant)

dengan Kadar Hemoglobin (g/dL)

Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan nilai rerata kadar

hemoglobin untuk wildtype sebesar 12,1 g/dL (SD 2,16), heterozygote 11,56 g/dL

(SD 2,13) dan mutant 11,33 g/dL (SD 1,70).


antara kadar hemoglobin (g/dL) dengan genotyping (wildtype, heterozygote, dan

mutant). Dari hasil uji variasi dan uji normalitas syarat one way ANOVA tidak

terpenuhi (lampiran 8). Sehingga digunakan alternatif uji nya yakni uji Kruskal-

Willis. Setelah dilakukan uji Kruskal-Willis, didapatkan nilai signifikansi sebesar

49

0,818. Sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan

antara kadar hemoglobin dengan genotyping (wildtype, heterozygote,dan mutant).

Gambar 4.2. Rerata kadar hemoglobin menurut genotyping (wildtype,

heterozygote, dan mutant)

4.1.9. Hasil Hubungan Genotyping (Wildtype, Heterozygote, dan Mutant)

dengan Kategori Kadar Hemoglobin (Anemia dan Non Anemia)

Tabel 4.8. Distribusi frekuensi genotyping menurut kategori kadar hemoglobin

Kategori

Kadar

Hemoglobin

Genotyping Total

Wildtype Heterozygote Mutant

N % N % N % N %

Anemia 3 3,75 56 70 21 26,25 80 100

Non

Anemia 1 4,54 18 81,81 3 13,65 22 100

Hasil data yang diperoleh dari 102 responden didapatkan presentase

penderita anemia yang memiliki genotyping wildtype 3,75 %, heterozygote 70 %,

50

dan mutant 26,25 %. Presentase responden non anemia yang memiliki genotyping

wildtype 4,54 %, heterozygote 81,81 %, dan mutant 13,65 %.


antara kategori kadar hemoglobin dengan genotyping (wildtype, heterozygote, dan

mutant). Dari hasil crosstabulation didapatkan nilai observed 1, 18, 3, 3, 56, dan

21. Nilai expected yang didapatkan 0,9, 16, 5,2, 3,1, 58, dan 18,8. Tabel 2x3

(lampiran 8) layak untuk diuji dengan Chi Square karena sel yang nilai

expextednya kurang dari 5 sebesar 33,3% (masih dibawah 50%). Setelah

dilakukan uji Chi Square, didapatkan nilai signifikansi dari Pearson Chi-Square

sebesar 0,466. Sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat perbedaan yang

signifikan antara kategori kadar hemoglobin (anemia dan non anemia) dengan

genotyping (wildtype, heterozygote, dan mutant).

4.2. Pembahasan

Hasil uji bivariat antara jenis kelamin dengan kadar hemoglobin

menggunakan uji independent t-test, didapatkan nilai p value ≤ 0,05 yang berarti

menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara jenis kelamin dengan kadar

hemoglobin (g/dL). Hasil analisis ini diperkuat oleh penelitian Permaesih dan

Herman bahwa ada hubungan yang bermakna antara jenis kelamin dan kadar

hemoglobin dengan p value=0,000* dengan OR 0,6 dan 1.27

Secara teori, kadar

hemoglobin pada perempuan memang lebih rendah dibandingkan laki-laki.

Menurut parameter dari komponen sel darah merah juga menunjukkan perbedaan

yang bermakna.28

Kemudian setelah dilakukan uji Chi-Square, untuk melihat

hubungan antara kategori kadar hemoglobin (anemia dan non anemia) didapatkan

nilai signifikansi dari Pearson Chi-Square sebesar 0,012. Sehingga dapat

disimpulkan terdapat perbedaan yang signifikan antara jenis kelamin dan kategori

kadar hemoglobin (anemia dan non anemia). Secara teori, perempuan memiliki

faktor resiko lebih dalam kejadian anemia dibandingkan laki-laki, terutama pada

perempuanusia reproduktif yang mengalami menstruasi. Hal ini telah diteliti oleh

Sung-Nan Pei dkk (2014) dari sampel 67 perempuan dengan Iron Deficiency

Anemia (IDA) dan 107 kelompok perempuan tanpa IDA dilakukan pemeriksaan

Pictorial Blood Loss Assessment Chart (PBAC).29

Hasil dari penelitian tersebut

51

didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok perempuan dengan IDA

dan kelompok perempuan sehat dengan p value <0,001 (p<0,05). Hal ini sejalan

dengan angka kebutuhan zat besi perhari antara laki-laki dan perempuan yang

berbeda. Menurut Food and Nutrition Board, Institute of Medicine, National

Academies (2000), laki-laki pada kelompok umur 19 hingga >70 tahun

membutuhkan zat besi sebanyak 8 mg/hari. Berbeda pada perempuan yang

membutuhkan 18 mg/hari zat besi untuk usia 19-50 tahun.16

Pada hasil penelitian ini secara statistik tidak ditemukan adanya perbedaan

yang signifikan antara jenis kelamin dengan genotyping (wildtype, heterozygote,

dan mutant) (p=0,662), antara genotyping dengan kadar hemoglobin (p=0,818)

dan antara genotyping dengan kategori kadar hemoglobin (p=0,466). Secara teori,

IRIDA terjadi karena hilangnya fungsi matriptase-2 sebagai regulator negatif

transkripsi hepsidin akibat mutasi pada gen TMPRSS6. Akibat proses tersebut

terjadi overproduksi dari hepsidin yang menyebabkan terhambatnya absorpsi zat

besi di usus. Hal ini akan berpengaruh terhadap kadar hemoglobin di dalam darah.

Berdasarkan gambar 4.2 didapatkan rerata kadar hemoglobin wildtype 12,10 g/dL

(SD 2,16) lebih tinggi dibandingkan rerata kadar hemoglobin heterozygote 11,56

g/dL (SD 2,13) dan mutant 11,33 g/dL (SD 1,70). Berdasarkan tabel 4.8 diketahui

presentase kelompok anemia dengan heterozygote 70% dan pada kelompok

mutant didapatkan kejadian anemia 26,25 % dan non anemia 13,65 %. Perbedaan

dari hasil penelitian ini bisa dikarenakan adanya IRIDA merupakan penyakit

autosomal resesif sehingga fenotip baru akan muncul untuk dalam dua alel baik

dalam bentuk heterozigot maupun homozigot. Hal ini sejalan dengan penelitian

yang dilakukan oleh Goncalves dkk (2013) tidak terdapat perbedaan bermakna

antara frekuensi alel C dan T dengan kelompok normal dan kelompok IDA

(p=0,08) dibandingkan dengan frekuensi genotip CT dan TT pada kedua

kelompok (p=0,037).31

Namun demikian, kejadian dari kadar hemoglobin yang

rendah berdasarkan genotip (C>T) telah diobservasi dalam penelitian ini.

Pada hasil analisis kurva HRM, didapatkan beberapa sampel memiliki

bentuk kurva yang berbeda (lampiran 7). Kurva analisis HRM-PCR adalah kurva

alel hetero maupun mutan yang hanya berdasarkan pada posisi perubahan basa

dalam untai produk PCR. Perubahan ini dapat saja terjadi diposisi basa nukleotida

52

yang kita amati atau diluar area posisi basa nukleotida. Akibatnya adalah pola

yang terbaca dan dianalisa oleh program HRM tetap menunjukan grafik posisi alel

hetero atau mutan. Oleh karena itu, perlu dilakukan sekuensing untai DNA sampel

untuk memvalidasi kejadian tersebut. Dari hasil sekuensing didapatkan sampel

benar memiliki mutasi lain pada fragmennya, sehingga dapat menjadi salah satu

faktor dalam perbedaan ini. Hal ini dibuktikan dari hasil pengamatan, contoh pada

sampel nomor 2 yang menunjukkan kurva HRM-PCR di area alel hetero, namun

setelah diamati dengan lebih seksama, ternyata bukan hanya terdapat bentuk

hetero namun ada delesi dengan ganda hetero di posisi basa nukleotida lain

(lampiran 7). Kemudian pada sampel nomor 70-72, 85, dan 86 menunjukkan

bentuk ganda heterozygote (lampiran 7). Sehingga dapat disimpulkan,

penggunaan teknik HRM-PCR ini kurang spesifik namun sensitif untuk

membedakan individu yang memiliki bentuk wildtype, heterozygote, dan mutant.

Pada individu yang memiliki bentuk heterozygote dan mutant dianjurkan untuk

melakukan sekuensing DNA dan pengamatan lain terkait penyakit tersebut.

4.3. Kelebihan Penelitian

Penelitian skrining SNP rs855791 (C>T) untuk mengetahui kemungkinan

responden menderita IRIDA ini dapat dikatakan penelitian yang baru di Indonesia

karena IRIDA sendiri merupakan penyebab anemia yang baru diketahui. Dalam

pelaksanaan penelitian ini, cara kerja penelitian yang dilakukan memiliki tingkat

kesulitan yang tinggi karena membutuhkan waktu dan tenaga yang banyak. Dalam

mendeteksi mutasi dari SNP tersebut, teknik Real Time PCR-HRM yang

digunakan merupakan salah satu teknik yang murah dan sensitif. Dalam penelitian

ini pula responden mengetahui hasil dari pemeriksaan kadar Hb sehingga dapat

menjadi informasi bagi responden untuk memperbaiki gaya hidup terutama dari

segi asupan nutrisi yang berkaitan dengan zat besi.

4.4. Keterbatasan Penelitian

Selama penelitian berlangsung terdapat beberapa hambatan yang dialami

oleh peneliti, diantaranya:

53

1. Tidak diukurnya kriteria diagnosis lain untuk menentukan anemia dan

non anemia seperti pemeriksaan hapusan darah tepi.

2. Tidak mencari data mengenai asupan zat besi responden per hari untuk

mengetahui kemungkinan pasien yang mengalami Iron Deficiecy

Anemia.

3. Tidak mencari data mengenai status menstruasi pada responden

perempuan untuk mengetahui kemungkinan penyebab lain terjadinya

anemia.

4. Besar sampel diduga mempengaruhi hasil statistik analitik.

54

BAB 5

SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

1. Frekuensi genotyping SNP rs855791 (C>T) asam amino prolin menjadi

serin pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan

2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time PCR-HRM sebagian besar

merupakan genotyping heterozygote sebesar 72,5% .

2. Tidak terdapat hubungan antara genotyping SNP rs855791 (TMPRSS6)

(C>T) dengan nilai Hb pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah

angkatan 2012 – 2014 menggunakan teknik Real Time PCR-HRM.

5.2. Saran

1. Diperlukan besar sampel yang lebih banyak untuk melihat hubungan

antara SNP rs855791 dengan kadar hemoglobin.

2. Diperlukan sekuensing DNA untuk mengetahui jumlah basa yang

mengalami mutasi dan untuk memvalidasi hasil pemeriksaan.

3. Diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk diagnosis anemia seperti

hapusan darah tepi, dan pemeriksaan lainnya.

4. Diperlukan kuesioner untuk mengetahui faktor lain yang mempengaruhi

kondisi anemia defisiensi besi seperti asupan zat besi dan kejadian

menorhargia pada perempuan.

5. Bagi mahasiswa, diharapkan dapat memperbaiki pola makan untuk

mengatasi kondisi anemia.

55

DAFTAR PUSTAKA

1. Benoist B, McLean E, Egli I, Cogswell M, editor. Worldwide prevalence of

anaemia 1993 – 2005 [Internet]. Switzerland: WHO Press: 2008 [diakses pada

7 Jul 2015]. Tersedia pada WHO:

http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/43894/1/9789241596657_eng.pdf?ua

=1

2. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan RI.

Riset kesehatan dasar 2013 [Internet] [diakses pada 7 Jul 2015]. Tersedia pada

Depkes:

http://www.depkes.go.id/resources/download/general/Hasil%20Riskesdas%20

2013.pdf

3. Camaschella C. Iron deficiency anaemia. N Engl J Med 2015; 372(19): 1835-

1843

4. Falco LD, Sanchez M, Silvestri L, Kannenglesser C, Muckenthaler MU,

Lolascon A, et all. Iron refractory iron deficiency anaemia. Haematol 2013;

98(6): 848-853

5. What are genetics and genomics [Internet]. 14 Feb 2014 [diakses pada 10 Jul

2015]. Tersedia pada National Human Genome Research Institute:

http://www.genome.gov/19016904

6. WHO. Who definitions of genetics and genomics [Internet]. [diakses pada 10

Jul 2015]. Tersedia pada WHO :

http://www.who.int/genomics/geneticsVSgenomics/en/

7. The human genome: structure and function of genes and chromosomes.

Thompson and Thompson genetics in medicine [Internet]. [diakses pada 12

Sep 2015]. Tersedia pada :

http://www.fi.muni.cz/~lexa/lsb2014/chapter03sample.pdf

8. What are single nucleotide polymorphisms [Internet]. Sep 2015 [diakses pada

5 Sep 2015]. Tersedia pada genetic home reference:

http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/genomicresearch/snp

9. Mukhlisin BK. Hikmah Larangan Menikah Sedarah [Internet]. Jan 2015

[diakses pada 5 Sep 2015]. Tersedia pada: http://bersamadakwah.net/hikmah-

larangan-kawin-sedarah-5-000-orang-ini-menderita-alzheimer/

10. Hoffbrand AV, Moss PAH; alih bahasa, Brahm UP, Liana S, Anggraini I.

Kapita selekta hematologi, edisi 6. Jakarta: EGC; 2013. h.84-86

11. Suryana. Makanan yang halal dan haram. Jakarta: Mitra Aksara Panaitan;

2009. h. 2-6

http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/43894/1/9789241596657_eng.pdf?ua=1

http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/43894/1/9789241596657_eng.pdf?ua=1

http://www.depkes.go.id/resources/download/general/Hasil%20Riskesdas%202013.pdf

http://www.depkes.go.id/resources/download/general/Hasil%20Riskesdas%202013.pdf

http://www.genome.gov/19016904

http://www.who.int/genomics/geneticsVSgenomics/en/

http://www.fi.muni.cz/~lexa/lsb2014/chapter03sample.pdf

http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/genomicresearch/snp

http://bersamadakwah.net/hikmah-larangan-kawin-sedarah-5-000-orang-ini-menderita-alzheimer/

http://bersamadakwah.net/hikmah-larangan-kawin-sedarah-5-000-orang-ini-menderita-alzheimer/

56

12. Bangun EB, Lubis Z, Siagian A. Perilaku minum teh dan kadar hemoglobin

(hb) pada siswa-siswi sekolah menengah kejuruan negeri 1 jorlang hataran

desa dolok marlawan kecamatan jorlang kabupaten simalungun tahun 2012

[Internet]. [diakses pada 20 Jul 2015]. Tersedia pada:

http://download.portalgaruda.org/article.php?article=51409&val=4108

13. WHO. Haemoglobin concentrations for the diagnosis of anaemia and

assessment of severity [Internet]. [diakses pada 20 Jul 2015]. Tersedia pada

WHO: http://www.who.int/vmnis/indicators/haemoglobin.pdf

14. Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, Simadibrata M, Setiati S. Buku ajar ilmu

penyakit dalam. Jilid II edisi IV. Jakarta: Interna Publishing; 2006. h.633-636

15. Loffler H, Rastetter J, Haferlach T. Atlas of clinical hematology, 6th

ed. New

York: Springer Berlin; 2005, h.31-34

16. Mahan K, Escott-Stumpt S. Krause’s food, nutrition, and diet therapy, 11th ed.

USA: Elsevier; 2004, h.135-137

17. Hoffbrand AV, Moss PAH, Pettit JE, editors. Essential haematology, 5th

ed.

Australia: Blackwell Publishing; 2006, h.16-19

18. TMPRSS6 [Internet]. Jul 2014 [diakses pada 5 Sep 2015]. Tersedia pada

genetic home reference: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/TMPRSS6

19. RS855791 [Internet]. Jun 2015 [diakses pada 10 Jul 2015]. Tersedia pada

snpedia : http://www.snpedia.com/index.php/Rs855791

20. Benyamin B, Ferreira MA, Willemsem G, Gordon S, Middleberg RPS,

McEvoy BP, et al. Common variants in TMPRSS6 are associated with iron

status and erythrocyte volume. Nat Genet 2009; 41(11): 1173-1175

21. Chambers JC, Zhang W, Li Y, Sehmi J, Wass MN, Zabaneh D, dkk. Genome

wide association study identifies variants in TMPRSS6 associated with

hemoglobin levels. Nat Genet 2009; 41(11): 1170-1172

22. Ghatak S, Muthukumaran RB, Nachimutu SK. A simple method of genomic

DNA extraction from human samples for PCR-RFLP Analysis. J Biomol Tech

2013; 24: 224-231

23. Surzycki S. Laboratory manual: human molecular biology. Berlin: Blackwell

Publishing; 2003. h.3-10

24. Assessment of nucleic acid purity [Internet]. [diakses pada 14 Sep 2015].

Tersedia pada Thermo-Scientific : http://www.nanodrop.com/Library/T042-

NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf

http://download.portalgaruda.org/article.php?article=51409&val=4108

http://www.who.int/vmnis/indicators/haemoglobin.pdf

http://ghr.nlm.nih.gov/gene/TMPRSS6

http://www.snpedia.com/index.php/Rs855791

http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf

http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf

57

25. Joshi M, Desphande JD. Polymerase chain reaction: method, principles, and

application.Int J Biomed Res 2010; 1(5): 81-97.

26. Introduction to high resolution melt analysis. Kapa Biosystem [Internet].

[diakses pada 14 Sep 2015]. Tersedia pada:

https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution_M

elt_Analysis_Guide.pdf

27. Permaesih D, Herman D. Faktor-faktor yang mempengaruhi anemia pada

remaja. Bal Penel Kesehatan 2005; 33(4):162-171

28. Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, editor. William’s haematology, 6th ed.

New York: Mc Graw Hill; 2001

29. Pei SN, Ma MC, You HL, Fu HC, Kuo CY, Rau KM, dkk. TMPRSS6

rs855791 polymorphism influences the susceptibility to iron deficiency

anemia in women at reproductive age. Int J Med Sci 2014; 11(6): 614-619.

30. Light cycler gene scanning software. Roche [Internet]. Okt 2008 [diakses pada

14 Sep 2015] Tersedia pada : http://sydney.edu.au/medicine/bosch/facilities/

molecular-biology/nucleicacid/LightCycler480_GeneScanningSoftware_V1.5.

pdf

31. Goncalves L, Nobre Jesus G, Afonso C, Vieira A, Maia R, Miranda A, dkk.

The role of TMPRSS6 gene variants in different types of iron deficiency

anemia – from the rare severe hereditary IRIDA to the common mild acquired

IDA [Internet]. [diakses pada 14 Sep 2015]. Tersedia pada:

http://repositorio.insa.pt/bitstream/10400.18/2511/1/poster%20SPGH%20201

4%20IRIDA.pdf

https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution_Melt_Analysis_Guide.pdf

https://www.kapabiosystems.com/assets/Introduction_to_High_Resolution_Melt_Analysis_Guide.pdf

http://sydney.edu.au/medicine/bosch/facilities/%20molecular-biology/nucleicacid/LightCycler480_GeneScanningSoftware_V1.5.%20pdf



http://repositorio.insa.pt/bitstream/10400.18/2511/1/poster%20SPGH%202014%20IRIDA.pdf

http://repositorio.insa.pt/bitstream/10400.18/2511/1/poster%20SPGH%202014%20IRIDA.pdf

58

Lampiran 1. Lembar persetujuan responden

SURAT PERSETUJUAN PENELITIAN

SKRINING GEN RS855791 YANG BERHUBUNGAN DENGAN IRIDA

PADA MAHASISWA PSPD UIN JAKARTA ANGKATAN 2012-2014

Saat ini saya Amatillah Raifah mahasiswa PSPD UIN Jakarta angkatan 2012

sedang melakukan penelitian dengan judul Skrining Single Nucleotide

Polymorphysm rs855791 (C>T) pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan

Dokter Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Untuk

Mengetahui Kemungkinan Menderita Iron Refractory Deficiency Anemia

dengan Menggunakan Teknik Real Time Polymerase Chain Reaction-High

Resolution Melt. Pada penelitian ini saya akan melakukan dua kali pemeriksaan.

Pemeriksaan pertama akan dilakukan pemeriksaan Hb darah dengan

menggunakan alat EasyTouch GCHb. Pemeriksaan kedua akan dilakukan

pengambilan darah partisipan sebanyak satu kali yaitu 3 cc. Darah tersebut akan

dibawa ke laboratorium untuk dilakukan skrining. Pengambilan darah dilakukan

oleh analis yang sudah berpengalaman. Untuk itu, dengan hormat saya memohon

kesediaan Anda untuk ikut serta dalam penelitian ini.

Setelah membaca penjelasan diatas, bahwa yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama:

Umur: tahun

Alamat:

Dengan sukarela diikutsertakan dalam penelitian ini. Segala hal yang menyangkut

kerahasiaan tentang partisipan akan terjaga dengan baik oleh peneliti.

Jakarta, Mei 2015

Mengetahui,

(________________) (Amatillah Raifah)

Mahasiswa Peneliti

59

Lampiran 2. Lembar tanda terima

60

Lampiran 3. Fragmen gblock dan primer

Fragmen gBlock wildtype asam amino prolin

GGA GAA TAG AGA ACA GGG GCT CCA GGC TCC TGA GAT CTC ACT

TCT GCC CTT GAC CAC GGA CAG GCC CCA TCA GCA ACG CTC TGC

AGA AAG TGG ATG TGC AGT TGA TCC CAC AGG ACC TGT GCA GCG

AGG CCT ATC GCT ACC AGG TGA CGC CAC GCA TGC TGT GTG CCG

GCT ACC GCA AGG GCA AGA AGG ATG CCT GTC AGG TGA GTC CCC

(produk PCR) 126 bp

Fragmen gBlock mutan asam amino serin

GGA GAA TAG AGA ACA GGG GCT CCA GGC TCC TGA GAT CTC ACT

TCT GCC CTT GAC CAC GGA CAG GCC CCA TCA GCA ACG CTC TGC

AGA AAG TGG ATG TGC AGT TGA TCC CAC AGG ACC TGT GCA GCG

AGG TCT ATC GCT ACC AGG TGA CGC CAC GCA TGC TGT GTG CCG

GCT ACC GCA AGG GCA AGA AGG ATG CCT GTC AGG TGA GTC CCC

Fragmen primer forward

5’- GGA TCT CAG GGT GGG TGG CAA TGC T – 3’

Fragmen primer reverse

5’- GAA AAG CAA GCT ACC AGA AGC CCC AA – 3’

61

Lampiran 4. Alat dan bahan penelitian

Gambar 7.3.1. Elektroforesis Gambar 7.3.2. Centrifuge Eppendorf

Gambar 7.3.3. Alat Inkubator Gambar 7.3.4. Micropipet & Tip

Gambar 7.3.5. Cold Room dan Freezer

Gambar 7.3.6. gBlock wildtype dan mutant (tutup putih) serta primer (tutup biru)

62

Gambar 7.3.7. Reagen LC 480 HRM Master (H2O, MgCl, dan Master mix)

Gambar 7.3.8. Multiwall Plate dan alat Real Time PCR Light Cycler®

Roche

Gambar 7.3.9. DNA sampel

63

Lampiran 5

Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA sampel

Gambar 7.4.1. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom

DNA sampel

Gambar 7.4.1. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari produk PCR

genom DNA sampel

120 bp

Marker Marker

120 bp

Marker

120 bp

Marker Marker

120 bp

64

Lampiran 6. Hasil kemurnian dan konsentrasi DNA sampel

Tabel 7.5.1. Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel

No, A230 A260 A280 A260/A230 A260/A280 Konsentrasi

1 0,262 0,515 0,251 1,963 2,053 25,77

2 1,209 2,18 1,108 1,802 1,968 108,99

3 0,177 0,348 0,166 1,97 2,094 17,4

4 0,899 2,267 1,129 2,523 2,007 113,35

5 0,242 0,337 0,234 1,395 1,438 16,86

6 0,588 1,105 0,587 1,881 1,881 55,25

7 -0,062 0,57 0,307 -9,226 1,858 28,51

8 -0,042 0,426 0,232 -10,04 1,835 21,32

9 0,129 0,413 0,213 3,208 1,935 20,64

10 -0,076 0,125 0,063 -1,66 1,986 6,27

11 -0,196 0,18 0,086 -0,921 2,089 9,02

12 0,457 0,923 0,499 2,019 1,849 46,13

13 -0,017 0,279 0,128 -16,772 2,175 13,95

14 -0,007 0,107 0,061 -14,587 1,775 5,37

15 -0,203 0,288 0,141 -1,423 2,042 14,42

16 -0,151 0,306 0,178 -2,028 1,72 15,32

17 -0,301 0,12 0,063 -0,4 1,912 6,01

18 0,054 0,496 0,352 9,182 1,409 24,79

19 -0,225 0,235 0,119 -1,043 1,973 11,75

20 -0,219 0,2 0,105 -0,914 1,898 10

21 -0,001 0,723 0,392 -847,665 1,845 36,13

22 -0,012 0,828 0,421 -71,179 1,964 41,38

23 0,22 0,951 0,504 4,325 1,887 47,55

24 0,247 1,097 0,621 4,438 1,768 54,87

25 -0,22 0,237 0,141 -1,081 1,684 11,87

26 -0,163 0,441 0,197 -2,704 2,235 22,06

27 -0,25 0,195 0,107 -0,782 1,827 9,75

28 0,425 0,982 0,739 2,31 1,329 49,08

29 0,097 1,009 0,485 10,382 2,081 50,46

30 0,143 0,801 0,532 5,609 1,505 40,05

31 2,57 2,265 1,623 0,881 1,395 113,23

32 0,867 1,46 1,039 1,684 1,406 73,01

33 0,092 0,836 0,463 9,122 1,805 41,78

34 1,256 3,73 2,151 2,971 1,734 186,52

35 0,111 1,081 0,53 9,734 2,04 54,05

36 1,202 2,128 1,364 1,771 1,56 106,42

37 0,842 1,627 1,113 1,933 1,462 81,35

65

(Lanjutan)


38 0,211 0,715 0,558 3,387 1,281 35,73

39 0,097 1,013 0,511 10,468 1,98 50,63

40 0,186 1,19 0,601 6,385 1,98 59,49

41 0,868 1,481 1,056 1,707 1,403 74,07

42 -0,17 0,347 0,195 -2,042 1,78 17,36

43 0,143 1,101 0,544 7,681 2,022 55,04

44 1,015 2,162 1,376 2,129 1,571 108,1

45 -0,147 0,356 0,212 -2,418 1,679 17,81

46 -0,118 0,414 0,252 -3,51 1,641 20,7

47 -0,099 0,648 0,309 -6,562 2,1 32,42

48 0,722 1,304 0,867 1,804 1,503 65,18

49 0,969 1,121 0,838 1,157 1,339 56,06

50 0,277 1,253 0,648 4,532 1,934 62,66

51 -0,144 0,302 0,153 -2,105 1,972 15,1

52 0,461 1,444 0,796 3,131 1,815 72,22

53 0,272 0,965 0,559 3,554 1,725 48,24

54 0,636 1,285 0,878 2,019 1,464 64,24

55 0,575 1,94 0,944 3,371 2,054 96,98

56 -0,29 0,047 0,022 -0,162 2,11 2,35

57 -0,283 0,016 0,009 -0,055 1,654 0,78

58 -0,333 0,011 0,009 -0,034 1,247 0,57

59 -0,309 0,118 0,05 -0,381 2,331 5,88

60 1,302 1,541 1,398 1,183 1,102 77,03

61 -0,288 0,22 0,105 -0,765 2,102 11

62 0,468 1,783 1,01 3,81 1,766 89,14

63 0,149 0,945 0,548 6,324 1,724 47,27

64 0,32 1,008 0,614 3,145 1,642 50,4

65 0,306 1,261 0,686 4,118 1,838 63,03

66 0,194 1,021 0,593 5,251 1,72 51,05

67 0,271 1,214 0,662 4,474 1,835 60,72

68 0,603 1,356 0,942 2,248 1,439 67,78

69 0,217 1,095 0,586 5,05 1,869 54,73

70 -0,132 0,407 0,229 -3,076 1,775 20,35

71 0,082 0,852 0,51 10,417 1,671 42,62

72 -0,004 0,757 0,42 -186,279 1,804 37,87

73 0,236 0,992 0,581 4,2 1,709 49,61

74 -0,02 0,683 0,378 -33,861 1,806 34,16

75 -0,122 0,473 0,246 -3,872 1,92 23,64

66

(Lanjutan)


76 0,08 0,816 0,487 10,173 1,676 40,8

77 0,114 0,86 0,548 7,513 1,571 43,01

78 0,017 0,685 0,47 39,492 1,459 34,27

79 0,178 0,988 0,715 5,564 1,382 49,4

80 0,211 0,937 0,541 4,446 1,732 46,86

81 0,416 1,207 0,697 2,899 1,733 60,37

82 0,587 2,023 0,96 3,448 2,108 101,16

83 2,678 5,249 3,034 1,96 1,73 262,43

84 1,137 1,644 0,909 1,446 1,808 82,2

85 0,625 1,182 0,821 1,892 1,44 59,1

86 0,038 0,911 0,427 23,765 2,136 45,56

87 0,072 0,874 0,418 12,113 2,092 43,72

88 0,279 0,992 0,507 3,557 1,958 49,6

89 2,394 3,807 3,01 1,591 1,265 190,37

90 1,004 1,619 1,134 1,613 1,428 80,95

91 0,199 1,149 0,608 5,783 1,891 57,47

92 0,669 1,39 0,842 2,078 1,652 69,51

93 0,547 1,19 0,626 2,177 1,901 59,5

94 1,508 1,979 1,113 1,313 1,778 98,96

95 0,195 0,943 0,459 4,829 2,055 47,14

96 0,764 2,306 1,11 3,02 2,077 115,31

97 0,437 1,697 0,788 3,885 2,152 84,84

98 0,501 0,842 0,519 1,681 1,622 42,08

99 0,019 0,707 0,347 37,568 2,038 35,36

100 1,247 2,727 1,524 2,186 1,79 136,37

101 0,247 1,117 0,59 4,521 1,893 55,83

102 -0,191 0,251 0,129 -1,311 1,944 12,53

67

Lampiran 7. Hasil kurva HRM dan sekuensing

Gambar 7.6.1. Melting Curve gBlock Wildtype, Heterozygote, dan Mutant

Gambar 7.6.2. Melting Curve DNA Sampel

Gambar 7.6.3. Hasil Secuencing Sampel Nomor 2, terdapat dua mutasi, yakni 1

delesi dan 1 ganda basa

Delesi 1 basa C Ganda basa C/T

68

(Lanjutan)

Gambar 7.6.4. Hasil Secuencing Sampel Nomor 86, terjadi substitusi C menjadi T

dan tidak ada ganda basa

Gambar 7.6.5. Melting Curve. (A) Grafik wildtype, (B) Grafik mutant, sampel

nomor 86, C berubah menjadi T,dan (C) Grafik heterozygote C/T dan delesi C

Gambar 7.6.6. Melting Curve. Sampel nomor 70, 71, 72, 85 dan 86

A

B

C

Ada basa T Tidak ada ganda basa

Heterozygote

Mutant

Ganda Heterozygote

Tidak ada ganda basa Tidak ada ganda basa Ada basa T Tidak ada ganda basa

69

(Lanjutan)

Gambar 7.6.7. Hasil sekuensing ganda heterozygote

70

(Lanjutan)

Tabel 7.6.1. Hasil Analisis Penggolongan SNP rs855791 berdasarkan Melting

Curve

No Sampel Hb Jenis Kelamin Wildtype Heterozygot Mutant

1 14 P - + -

2 11,7 P - + -

3 9,3 P - + -

4 10,1 P - + -

5 8,1 P - - +

6 11,7 L - + -

8 15,2 L - + -

9 10,5 P - + -

10 13,1 P - + -

11 11,2 P - + -

12 14,9 L - + -

13 11 L - + -

15 15,3 L - + -

16 13,1 L - - +

17 13,2 L - - +

18 13,1 P - + -

19 8,6 P - + -

20 11,6 P - + -

21 8,4 P - + -

22 9,7 P - + -

23 8,8 P - + -

24 18,5 L - + -

25 10 L - - +

26 11,1 P - - +

27 8,3 P - + -

28 10,9 P - + -

29 14,1 L - + -

30 13,3 L - - +

31 12,3 L - + -

32 9,5 P - - +

33 10,4 P - + -

34 9,5 P - + -

35 12,9 P - - +

36 12 L - - +

37 11,4 P - + -

38 11,8 P - - +

39 15 L + - -

40 14,6 L - + -

71

(Lanjutan)


41 8,4 L - + -

42 12,7 L - + -

43 13,1 P - + -

44 12 L - - +

45 12,9 L - + -

46 10,7 P - + -

47 9 P - + -

48 14,8 L - + -

49 9,8 P + - -

50 10,2 P - + -

51 9,7 P - + -

52 11,6 P + - -

53 9,8 P - + -

58 8,7 P - - +

59 11,2 L - + -

60 11,9 L - + -

61 11 L - + -

62 10,1 P - + -

63 10,2 P - + -

64 12,1 P - + -

65 11,2 P - + -

66 8,2 P - + -

67 13,8 L - + -

68 9,3 P - - +

69 11,6 P - + -

70 11 P - + -

71 11,9 P - + -

72 10 P - + -

73 8,8 P - + -

74 11,1 P - + -

75 8,7 P - + -

76 11,7 P - + -

77 13,8 L - - +

78 11,4 L - + -

79 12,3 L - + -

80 16,4 L - + -

81 11,3 P - + -

82 10,9 P - + -

83 12 P - + -

84 11,4 P - + -

72

(Lanjutan)


85 9,8 P - + -

86 11,8 P - - +

114 11,8 L - - +

115 11,6 P - - +

116 13,1 P - + -

117 12,6 P - - +

118 11,2 P - + -

119 11,1 P - + -

120 15,1 L - + -

121 11,1 P - - +

122 9,9 P - + -

123 10,5 P - - +

124 8 P - - +

125 12 L + - -

126 12,1 L - - +

127 10 P - + -

128 11,1 P - + -

129 13,1 L - + -

130 10,4 L - + -

131 10,4 P - - +

132 13,2 L - - +

133 14,7 L - + -

134 10,5 L - + -

135 15,7 P - + -

73

Lampiran 8. Hasil analisis statistik

Jenis Kelamin

Jenis Kelamin

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid Laki-laki 37 36,3 36,3 36,3

Perempuan 65 63,7 63,7 100,0

Total 102 100,0 100,0

Usia Responden

Case Processing Summary

Cases

Valid Missing Total

N Percent N Percent N Percent

Usia Responden 102 100,0% 0 0,0% 102 100,0%

Descriptives

Statistic Std.

Error

Umur

Responden

Mean 19,63 ,125

90% Confidence

Interval for Mean

Lower

Bound

19,42

Upper

Bound

19,84

5% Trimmed Mean 19,61

Median 20,00

Variance 1,602

Std. Deviation 1,266

Minimum 17

Maximum 23

Range 6

Interquartile Range 2

Skewness ,200 ,239

Kurtosis -,034 ,474

74

(Lanjutan)

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic Df Sig. Statistic df Sig.

Usia Responden ,155 102 ,000 ,924 102 ,000

a. Lilliefors Significance Correction

Usia Responden


Cumulative

Percent

Valid 17 3 2,9 2,9 2,9

18 18 17,6 17,6 20,6

19 26 25,5 25,5 46,1

20 28 27,5 27,5 73,5

21 24 23,5 23,5 97,1

23 3 2,9 2,9 100,0

Total 102 100,0 100,0

Indeks Massa Tubuh


Cases

Valid Missing Total


Index Massa

Tubuh

102 100,0% 0 0,0% 102 100,0%

Descriptives

Statistic Std. Error

Index Massa

Tubuh

Mean 21,4235 ,34903

90% Confidence

Interval for Mean

Lower

Bound

20,8441

Upper

Bound

22,0029


Median 20,4147

Variance 12,426


Minimum 15,22

Maximum 33,61

75

Range

18,39

(Lanjutan)

Interquartile Range 3,57

Skewness 1,268 ,239

Kurtosis 1,720 ,474

Tests of Normality


Statistic Df Sig. Statistic Df Sig.

Index Massa

Tubuh

,139 102 ,000 ,903 102 ,000


Kategori Index Massa Tubuh


Cumulative

Percent

Valid BB kurang 18 17,6 17,6 17,6

Normal 60 58,8 58,8 76,5

BB lebih 9 8,8 8,8 85,3

Obes 1 12 11,8 11,8 97,1

Obes 2 3 2,9 2,9 100,0

Total 102 100,0 100,0

Kadar Hemoglobin (g/dL)

Statistics


N Valid 102

Missing 0

Mean 11,5265

Std. Error of Mean ,20022

Median 11,3500

Mode 13,10


Variance 4,089

Skewness ,627

Std. Error of Skewness ,239

Kurtosis ,563

76

(Lanjutan)

Std. Error of Kurtosis ,474

Range 10,50

Minimum 8,00

Maximum 18,50

Tests of Normality


Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

,094 102 ,026 ,970 102 ,019


Statistics

Kategori Kadar Hemoglobin

N Valid 102

Missing 0

Kategori Kadar Hemoglobin


Cumulative

Percent

Valid Non Anemia 22 21,6 21,6 21,6

Anemia 80 78,4 78,4 100,0

Total 102 100,0 100,0

Genotyping (C>T)

Statistics

Genotip C>T

N Valid 102

Missing 0

Genotip C>T


Cumulative

Percent

Valid C 4 3,9 3,9 3,9

CT 74 72,5 72,5 76,5

T 24 23,5 23,5 100,0

Total 102 100,0 100,0

77

(Lanjutan)


Jenis Kelamin

Cases

Valid Missing Total


Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

Laki-laki 37 100,0% 0 0,0% 37 100,0%

Perempuan 65 100,0% 0 0,0% 65 100,0%

Descriptives

Jenis Kelamin Statistic Std. Error

Kadar

Hemoglo-

bin (g/dL)

Laki-laki Mean 12,9649 ,32591

90%

Confidence

Interval for

Mean

Lower

Bound 12,4146

Upper

Bound 13,5151


Median 12,9000

Variance 3,930


Minimum 8,40

Maximum 18,50

Range 10,10


Skewness ,345 ,388

Kurtosis ,688 ,759

Perempuan Mean 10,7077 ,19076

90%

Confidence

Interval for

Mean

Lower

Bound 10,3893

Upper

Bound 11,0261


Median 10,9000

Variance 2,365


Minimum 8,00

Maximum 15,70

Range 7,70


78

(Lanjutan)

Skewness ,480 ,297

Kurtosis ,623 ,586

Tests of Normality

Jenis

Kelamin



Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

Laki-laki ,091 37 ,200* ,981 37 ,754

Perempuan ,070 65 ,200

* ,972 65 ,144

*. This is a lower bound of the true significance.



T-Test

Group Statistics

Jenis

Kelamin N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

Laki-laki 37 12,9649 1,98245 ,32591

Perempuan 65 10,7077 1,53799 ,19076

(Lanjutan)

Independent Samples Test

Levene's Test for

Equality of

Variances t-test for Equality of Means

F Sig. T df

Sig. (2-

tailed)

Mean

Difference

Std. Error

Difference

90% Confidence Interval

of the Difference

Lower Upper

Kadar

Hemo-

globin

(g/dL)

Equal

variances

assumed

2,449 ,121 6,404 100 ,000 2,25717 ,35244 1,67205 2,84230

Equal

variances not

assumed

5,977 60,874 ,000 2,25717 ,37764 1,62641 2,88793

80

(Lanjutan)


Cases

Valid Missing Total


Jenis Kelamin *

Kategori Kadar

Hemoglobin

102 100,0% 0 0,0% 102 100,0%

Jenis Kelamin * Kategori Kadar Hemoglobin Crosstabulation

Kategori Kadar

Hemoglobin

Total

Non

Anemia Anemia

Jenis

Kelamin

Laki-laki Count 13 24 37

Expected

Count 8,0 29,0 37,0

Perempuan Count 9 56 65

Expected

Count 14,0 51,0 65,0

Total Count 22 80 102

Expected

Count 22,0 80,0 102,0

Chi-Square Tests

Value df

Asymp.

Sig. (2-

sided)

Exact

Sig. (2-

sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Pearson Chi-Square 6,317a 1 ,012

Continuity Correctionb 5,121 1 ,024

Likelihood Ratio 6,111 1 ,013

Fisher's Exact Test ,023 ,013

Linear-by-Linear

Association 6,255 1 ,012

N of Valid Cases 102

a. 0 cells (,0%) have expected count less than 5. The minimum expected

count is 7,98.

b. Computed only for a 2x2 table

81

(Lanjutan)

Crosstabs


Cases

Valid Missing Total


Jenis

Kelamin *

Genotip

C>T

102 100,0% 0 0,0% 10

2 100,0%

Jenis Kelamin * Genotip C>T Crosstabulation

Genotip C>T

Total C CT T

Jenis

Kelamin

Laki-laki Count 2 25 10 37

Expected

Count 1,5 26,8 8,7 37,0

Perempuan Count 2 49 14 65

Expected

Count 2,5 47,2 15,3 65,0

Total Count 4 74 24 102

Expected

Count 4,0 74,0 24,0 102,0

Chi-Square Tests

Value df

Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square ,826a 2 ,662

Likelihood Ratio ,810 2 ,667

Linear-by-Linear

Association ,099 1 ,753


a. 2 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum

expected count is 1,45.

82

(Lanjutan)

Genotip C>T


Genotip

C>T

Cases

Valid Missing Total

N Percent N

Percen

t N Percent

Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

C 4 100,0% 0 0,0% 4 100,0%

CT 74 100,0% 0 0,0% 74 100,0%

T 24 100,0% 0 0,0% 24 100,0%

Tests of Normality

Genotip

C>T

Kolmogorov-

Smirnova Shapiro-Wilk


Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

C ,268 4 , ,949 4 ,712

CT ,122 74 ,008 ,952 74 ,007

T ,151 24 ,163 ,938 24 ,145


Genotip C>T


Genotip

C>T

Cases

Valid Missing Total


Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

C 4 100,0% 0 0,0% 4 100,0%

CT 74 100,0% 0 0,0% 74 100,0%

T 24 100,0% 0 0,0% 24 100,0%

Tests of Normality

Genotip

C>T

Kolmogorov-

Smirnova Shapiro-Wilk


Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

C ,268 4 , ,949 4 ,712

CT ,122 74 ,008 ,952 74 ,007

T ,151 24 ,163 ,938 24 ,145


83

(Lanjutan)

Genotip C>T Statistic Std. Error

Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

C Mean 12,1000 1,07858

90% Confidence

Interval for Mean

Lower Bound 9,5617

Upper Bound 14,6383


Median 11,8000

Variance 4,653


Minimum 9,80

Maximum 15,00

Range 5,20


Skewness ,803 1,014

Kurtosis 1,705 2,619

CT Mean 11,5595 ,24752

90% Confidence

Interval for Mean

Lower Bound 11,1471

Upper Bound 11,9718


Median 11,2000

Variance 4,534


Minimum 8,20

Maximum 18,50

Range 10,30


Skewness ,789 ,279

Kurtosis ,576 ,552

T Mean 11,3292 ,34513

90% Confidence

Interval for Mean

Lower Bound 10,7377

Upper Bound 11,9207


Median 11,8000

Variance 2,859


Minimum 8,00

Maximum 13,80

Range 5,80


Skewness -,572 ,472

Kurtosis -,615 ,918

84

(Lanjutan)

Genotip C>T Statistic Std. Error

Kadar

Hemoglobin

(g/dL)

C Mean 12,1000 1,07858

90%

Confidence

Interval for

Mean

Lower Bound 9,5617

Upper Bound 14,6383


Median 11,8000

Variance 4,653


Minimum 9,80

Maximum 15,00

Range 5,20


Skewness ,803 1,014

Kurtosis 1,705 2,619

CT Mean 11,5595 ,24752

90%

Confidence

Interval for

Mean

Lower Bound 11,1471

Upper Bound 11,9718


Median 11,2000

Variance 4,534


Minimum 8,20

Maximum 18,50

Range 10,30


Skewness ,789 ,279

Kurtosis ,576 ,552

T Mean 11,3292 ,34513

90%

Confidence

Interval for

Mean

Lower Bound 10,7377

Upper Bound 11,9207


Median 11,8000

Variance 2,859


Minimum 8,00

Maximum 13,80

Range 5,80


Skewness -,572 ,472

Kurtosis -,615 ,918

85

(Lanjutan)


Kruskal-Wallis Test

Ranks

Genotip C>T N Mean Rank

Kadar Hemoglobin (g/dL) C 4 60,25

CT 74 50,81

T 24 52,17

Total 102


Chi-Square ,402

df 2

Asymp. Sig. ,818

a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable: Genotip C>T

Crosstabs


Cases

Valid Missing Total


Kategori Kadar

Hemoglobin *

Genotip C>T

102 100,0% 0 0,0% 102 100,0%

Kategori Kadar Hemoglobin * Genotip C>T Crosstabulation

Genotip C>T

Total C CT T

Kategori

Kadar

Hemoglobin

Non

Anemia

Count 1 18 3 22

Expected Count ,9 16,0 5,2 22,0

Anemia Count 3 56 21 80

Expected Count 3,1 58,0 18,8 80,0

Total Count 4 74 24 102

Expected Count 4,0 74,0 24,0 102,0

86

(Lanjutan)

Chi-Square Tests

Value df Asymp. Sig. (2-sided)

Pearson Chi-Square 1,527a 2 ,466

Likelihood Ratio 1,672 2 ,433

Linear-by-Linear

Association 1,301 1 ,254


a. 2 cells (33,3%) have expected count less than 5. The minimum expected count

is ,86.

Statistics

kategori A260/A280

N Valid 102

Missing 0

kategori A260/A280

Frequency Percent

Valid

Percent

Cumulative

Percent

Valid baik 45 44,1 44,1 44,1

tinggi 9 8,8 8,8 52,9

rendah 48 47,1 47,1 100,0

Total 102 100,0 100,0

Statistics

kategori konsentrasi

N Valid 102

Missing 0

kategori konsentrasi

Frequency Percent

Valid

Percent

Cumulative

Percent

Valid baik 93 91,2 91,2 91,2

<10ng/uL 9 8,8 8,8 100,0

Total 102 100,0 100,0

87

Lampiran 9. Curriculum vitae peneliti

CURICULUM VITAE

Nama : Amatillah Raifah

Panggilan : Ifah

Jenis Kelamin : Perempuan

Tempat, Tanggal Lahir : Pontianak, 4 April 1994

Usia : 21 Tahun

Golongan Darah : O

Mobile : 082213243645

Agama : Islam

E-mail : [email protected]

Alamat : Jl. Danau Sentarum Gg. H. Nawawi No. 66,

Pontianak, Kalimantan Barat

Pendidikan

a. Kindergarten : TK Al-Mukaddimah

b. Elementary School : SD Muhammadiyah I Pontianak

c. Yunior High School : MTs Negeri 2 Pontianak

d. Senior High School : SMA Negeri 1 Pontianak

e. University : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pengalaman Organisasi :

Local Officer on Medical Education CIMSA UIN 2014-2015

Supervising Council CIMSA UIN 2015-2016

Penghargaan:

Best Commander LKBB tingkat Sekolah Menengah Pertama se Kota Pontianak

2008

5 Terbaik LKTI Fakultas Biologi UNTAN Pontianak 2011

Mahasiswa Putri terbaik OPAK PSPD 2012 UIN Jakarta

Best Member CIMSA Local UIN 2013-2014

Best Local Officer CIMSA Local UIN 2014-2015

Most Innovative Project of SCOME CIMSA UIN on Project Day CIMSA 2014

Best Local SCOME CIMSA on May Meeting CIMSA 2015

10 Finalis LKTI Muhammadiyah Jakarta Scientifc Competition (Majesty) Tingkat

Nasional 2014

Karya Tulis :

Potensi Z-din dalam Arachis hypogaea L sebagai Inhibitor Reseptor P2X7 untuk

Alternatif Penatalaksanaan Hepatitis C

skrining rs 855791 (c> t) pada mahasiswa program...

Documents