plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · dari awal penelitian hingga laporan akhir...

VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM

KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM

SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE

LSKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Laurentius Dian Ardiyanto

NIM : 048114013

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:


NIM : 048114013

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008


iii

Skripsi




Yang diajukan oleh:


NIM : 048114013

telah disetujui oleh

Pembimbing Jeffry Julianus, M.Si Tanggal : ........................................


iv

Pengesahan Skripsi Berjudul




Oleh :

Laurentius Dian Ardiyanto NIM : 048114013

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 22 Mei 2008

Mengetahui Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

(Rita Suhadi, M.Si., Apt) Pembimbing : (Jeffry Julianus, M.Si) Panitia Penguji : Tanda Tangan

1. Jeffry Julianus, M.Si .......................

2. Christine Patramurti, M.Si, Apt. .......................

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. .......................


Untukk para e

Wit

v

emanue

th hope.

elku terc

.....

cinta


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Laurentius Dian Ardiyanto

Nomor Mahasiswa : 048114013

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :



SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada

Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam

bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara

terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan

akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya

selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 27 Mei 2008

Yang menyatakan

( Laurentius Dian Ardiyanto )


vii

PRAKATA

Alleluia…Alleluia…Alleluia...

Puji syukur kepada Allah Bapa, Putra dan Roh kudus atas penyertaannya

dari awal penelitian hingga laporan akhir ini selesai. Laporan akhir penelitian ini

disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana

Strata Satu Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).

Berbagai kesulitan telah berhasil dilewati dan akhirnya ucapan

terimakasih yang setulus-tulusnya dihaturkan kepada pihak-pihak yang telah

memberikan bantuan hingga akhir penelitian.

Penulis mengucapkan terimakasih kepada :

1. Papa, Mama, dan Ayu atas kasih sayang dan doanya yang menguatkan

2. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma

3. Jeffry Julianus, M.Si selaku pembimbing skripsi atas segala bimbingan dan

arahannya selama penelitian berlangsung

4. Christine Patramurti, M.Si., Apt. dan Yohanes Dwiatmaka, M.Si.selaku dosen

penguji atas kritik, saran, dan bantuannya hingga laporan ini selesai

5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. atas diskusinya yang banyak

membantu penulis selama penelitian

6. Rini Dwiastuti, S. Farm., Apt. selaku ketua Tea Project atas kesempatan yang

diberikan kepada penulis untuk berpartisipasi dalam penelitian


viii

7. Romo Drs. P. Sunu Hardijanto, S.J., S.Si, M.Sc. atas diskusi-diskusinya

tentang statistik dan etika penelitian

8. Enade Perdana Istyastono, S.F., Apt. dan A. Nora Iska Harnita M.Si, Apt. atas

bantuannya untuk memperoleh literatur untuk penelitian ini

9. Teman-teman Tea Project Agung ‘Simbah’, Resty ‘Simak’, Yoyo, Dona

‘Donce’, Ika ‘Monyi’, Tere, Rinta, Selvi, dan Fhery atas kerjasamanya.

Terutama untuk Resty atas bantuannya menyediakan sampel untuk penelitian

dan Selvi partner penelitian hingga akhir.

10. Mas Kunto, Pak Parlan, Pak Prapto, dan Mas Sarwanto atas segala bantuan

selama penulis bekerja di laboratorium.

11. Pipit, Ayu, Rudy, Desy, Silvia ‘Cipi’ atas kebersamaan selama studi di

Fakultas Farmasi USD

12. Rohkaters 04, gereja kecilku atas suka duka dan pengalaman iman yang

mendewasakan

13. Teman-teman di Fakultas Farmasi terutama FST 04 dan kelas A 04

14. Semua pihak yang membantu selama penulis menyelesaikan penelitian ini

yang tidak dapat disebutkan satu-persatu.

Tak ada gading yang tak retak, untuk itu segala kritik dan saran terhadap

penelitian ini amat diharapkan. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi para

pembaca.

Penulis


ix

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 27 Mei 2008

Penulis



x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...................................................... vi

PRAKATA .......................................................................................................... vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. ix

DAFTAR ISI ....................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvi

INTISARI ........................................................................................................... xvii

ABSTRACT ......................................................................................................... xviii

BAB I. PENDAHULUAN .................................................................................. 1

A. Latar Belakang ...................................................................................... 1

B. Permasalahan ......................................................................................... 3

C. Tujuan Penelitian ................................................................................... 3

D. Manfaat Penelitian ................................................................................ 3

E. Keaslian Karya ...................................................................................... 3

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 5

A. Flavonoid .............................................................................................. 5


xi

1. Sifat-sifat fisika-kimia flavonoid ....................................................... 5

2. Reaksi kimia flavonoid ...................................................................... 6

3. Flavonoid teh hijau ............................................................................ 7

B. Kuersetin ............................................................................................... 7

C. Analisis Sediaan Gel ............................................................................. 8

D. Deskripsi Senyawa Eksipien Penyusun Formula Gel ........................... 9

1. Natrium carboxymethylcellulose ....................................................... 9

2. Asam sitrat ......................................................................................... 10

3. Propilen glikol ................................................................................... 10

4. Metil paraben ..................................................................................... 11

5. Etanol ................................................................................................. 11

E. Spektrofotometer UV-Vis ..................................................................... 11

F. Kolorimetri ............................................................................................ 14

1. Penetapan kadar flavonoid secara kolorimetri .................................. 15

2. Absorpsi radiasi elektromagnetik oleh senyawa kompleks ............... 16

G. Parameter Validitas Metode Analisis .................................................... 16

1. Akurasi .............................................................................................. 17

2. Presisi ................................................................................................ 17

3. Spesifisitas ......................................................................................... 17

4. Batas deteksi ...................................................................................... 18

5. Batas kuantitasi .................................................................................. 18

6. Linearitas ........................................................................................... 18

7. Range ................................................................................................. 18


xii

H. Keterangan Empiris ............................................................................... 19

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .......................................................... 21

A. Jenis dan rancangan penelitian .............................................................. 21

B. Variabel penelitian ................................................................................ 21

C. Definisi Operasional .............................................................................. 21

D. Bahan Penelitian ................................................................................... 22

E. Alat Penelitian ....................................................................................... 22

F. Tatacara Penelitian ................................................................................. 22

1. Pembuatan pelarut dan pereaksi ........................................................ 22

2. Pembuatan sampel ............................................................................. 23

3. Pembuatan blangko ........................................................................... 23

4. Pembuatan larutan baku .................................................................... 23

5. Penentuan operating time (OT) ......................................................... 24

6. Penetapan panjang gelombang maksimum ....................................... 24

7. Pembuatan kurva baku ...................................................................... 24

8. Preparasi sampel ................................................................................ 25

9. Penetapan kadar flavonoid dalam sampel ......................................... 26

G. Analisis Hasil ........................................................................................ 26

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 27

A. Optimasi Kondisi Pengukuran .............................................................. 27

1. Penentuan operating time (OT) ......................................................... 27

2. Penentuan panjang gelombang maksimum ....................................... 28

B. Pembuatan Kurva baku ......................................................................... 30


xiii

C. Preparasi Sampel ................................................................................... 31

1. Isolasi analit dari sampel ................................................................... 32

2. Tahap hidrólisis ................................................................................. 34

3. Ekstraksi cair-cair .............................................................................. 35

D. Penetapan Kadar Flavonoid dalam Sampel........................................... 36

E. Analisis Validitas Metode ..................................................................... 38

1. Spesifisitas ......................................................................................... 38

2. Akurasi .............................................................................................. 38

3. Presisi ................................................................................................ 39

4. Linearitas ........................................................................................... 39

BAB V. KESIMPULAN, SARAN DAN KETERBATASAN ........................... 41

A. Kesimpulan ........................................................................................... 41

B. Saran ...................................................................................................... 41

C. Keterbatasan .......................................................................................... 41

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 42

LAMPIRAN ........................................................................................................ 45

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 52


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Daftar beberapa reagen untuk flavonoid ........................................... 6

Tabel II. Formula gel untuk penelitian ............................................................ 9

Tabel III. Kategori metode analisis dan persyaratan validasi ........................... 19

Tabel IV. Hubungan kadar kuersetin dengan absorbansi .................................. 30

Tabel V. Data % recovery dan koefisien variansi metode ............................... 38


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Rangka dasar flavonoid ................................................................... 5

Gambar 2. Sistem penomoran pada cincin flavonoid ........................................ 5

Gambar 3. Sruktur kimia kuersetin ................................................................... 8

Gambar 4. Struktur kimia natrium carboxymethylcellulose .............................. 10

Gambar 5. Struktur kimia asam sitrat ................................................................ 10

Gambar 6. Struktur kimia propilen glikol ......................................................... 10

Gambar 7. Struktur kimia metil paraben ........................................................... 11

Gambar 8. Diagram transisi elektron ................................................................ 14

Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks antara kuersetin dengan

aluminium klorida dalam suasana asam .......................................... 15

Gambar 10. Spektrum operating time kompleks kuersetin-AlCl3 ................................... 28

Gambar 11. Spektrum panjang gelombang maksimum kompleks

kuersetin-AlCl3 ................................................................................ 29

Gambar 12. Kurva baku kuersetin ....................................................................... 31

Gambar 13. Ikatan hidrogen natrium carboxymethylcellulose

membentuk cross link ...................................................................... 32

Gambar 14. Endapan CMC-Na yang terbentuk pada akhir proses isolasi .......... 34

Gambar 15. Reaksi hidrolisis flavonoid .............................................................. 35

Gambar 16. Alur pengerjaan sampel gel ............................................................. 37


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar larutan baku ........... 45

Lampiran 2. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar teoritis sampel ......... 47

Lampiran 3. Data dan contoh perhitungan % recovery ..................................... 48

Lampiran 4. Perhitungan koefisien variansi (CV) .............................................. 50

Lampiran 5. Gambar endapan CMC-Na yang terbentuk .................................... 51


xvii

INTISARI

Untuk melengkapi penelitian optimasi formula sediaan gel sunscreen teh hijau dengan gelling agent natrium carboxymethylcellulose (CMC-Na) dikembangkan suatu metode analisis kuantitatif yang dapat digunakan dalam kontrol kualitas. Metode kolorimetri dengan pereaksi Aluminium klorida yang digunakan untuk menetapkan kadar flavonoid total diadaptasi untuk maksud ini. Adaptasi suatu metode analisis dengan sampel yang berbeda membutuhkan proses validasi kembali untuk menjaga validitas metode. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui akurasi dan presisi metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida untuk penetapan kadar flavonoid dalam bentuk sediaan gel.

Penelitian ini difokuskan pada proses preparasi sampel yang terdiri dari tiga tahap, isolasi analit dari basis gel menggunakan aseton, hidrolisis untuk memecah ikatan glikosida dengan HCl 25%, dan ekstraksi cair – cair untuk memisahkan aglikon dengan glikon. Proses ini diharapkan mampu mempertahankan validitas metode.

Hasil penelitian menunjukkan metode ini memiliki akurasi dan presisi yang dapat diterima. Akurasi ditunjukkan dengan nilai % recovery sebesar 91,09%. Presisi ditunjukkan dengan nilai CV sebesar 5,25%. Hasil ini membuktikan bahwa metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida memiliki validitas yang baik ketika digunakan pada sediaan gel. Kata kunci : gel, natrium carboxymethylcellulose, kolorimetri, aluminium klorida,

akurasi, presisi


xviii

ABSTRACT

To complete research of optimization formula of green tea gel dosage forms as sunscreen, a quantitative analysis method which can be used in quality kontrol had been developed. Colorimetry method with aluminium chloride as reagent for total flavonoid assay had been adapted for this purpose. Adaptation some analytical method with different sample require revalidation process to maintain method validity. The aim of this research is to find out accuration and precision of colorimetry method with aluminium chloride reagents for quantitative analysis of flavonoids in gel dosage forms.

This research had focused in sample preparation included three steps, analite isolation from gel base using acetone, hydrolysis to brake glycosidic bonds with HCl 25%, and liquid – liquid extraction to separate aglicon and glicon. This process had expected to maintain method validity.

Result of this research show that this methods has acceptable accuration and precision. Accuration showed by 90,53% for % recovery value. Precision showed by 5,378% for coefficient of variance value. This result proved that colorimetry method with aluminium chloride as reagent has good validity when it used in gel dosage forms.

Keywords : gel, carboxymethylcellulose sodium, colorimetry, aluminium

chloride, accuration, precision


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Svobodova et al. (2003) dalam artikelnya memberikan penjelasan tentang

sejumlah senyawa fenolik alam dengan struktur yang digambarkan sebagai suatu

fenol (cincin aromatik yang berikatan dengan gugus hidroksil) seperti asam

kafeat, asam ferulat, kuersetin, apigenin, genistein, resveratrol, asam

nordihidroguaiaretat, asam karnosat, silimarin, polifenol teh, dan tanin. Senyawa-

senyawa fenolik tersebut terbukti mempunyai efek protektif terhadap kerusakan

kulit yang diinduksi radiasi UV. Untuk mempermudah penggunaan senyawa-

senyawa fenolik alam tersebut, Wijayanti (2008) telah melakukan penelitian

optimasi formula sediaan gel teh hijau sebagai dengan basis natrium

carboxymethylcellulose.

Dengan adanya perkembangan, terutama berkaitan dengan GMP (Good

Manufacturing Practice), formulasi sediaan yang baik hendaknya juga didukung

dengan kontrol kualitas yang baik pula. Bidang analisis kuantitatif terutama,

memainkan peranan yang penting dalam kontrol kualitas. Dalam kaitannya

dengan penelitian Wijayanti (2008), untuk melengkapi hasil penelitian tersebut,

maka perlu disusun suatu metode analisis kuantitatif yang dapat digunakan dalam

kontrol kualitas sediaan gel yang telah dikembangkan.

Polifenol teh hijau yang bertanggungjawab terhadap efek sunscreen

dalam sediaan gel hasil optimasi Wijayanti (2008), merupakan senyawa alam


2

yang digolongkan dalam kelas flavonoid. Syah (2006) menyebutkan empat

polifenol utama dalam teh hijau yaitu katekin, epikatekin, epigallokatekin, dan

epigallokatekingalat. Ditinjau dari struktur kimianya keempat polifenol tersebut

merupakan flavonoid (Robinson, 1991). Oleh karenanya metode analisis

kuantitatif flavonoid dapat menjadi metode analisis yang rasional dalam kontrol

kualitas sediaan gel teh hijau.

Aluminium klorida (AlCl3) diketahui dapat membentuk kompleks

berwarna dengan gugus hidroksi fenolik yang bertetangga dengan gugus karbonil

dan dengan gugus orto dihidroksi fenolik dalam senyawa flavonoid (Markham,

1982). Gugus ini dimiliki oleh senyawa-senyawa flavonoid yang ditemukan dalam

teh (Anonim, 1999).

Penelitian Pertiwi (2006), telah membuktikan validitas analisis kuantitatif

flavonoid secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl3. Selain itu peneliti yang

bersangkutan juga telah menggunakannya pada penetapan kadar flavonoid total

dalam beberapa fraksi teh. Penggunaan metode tersebut untuk analisis kuantitatif

sampel sediaan bentuk gel membutuhkan beberapa penyesuaian untuk menjamin

validitas metode. Akurasi dan presisi yang dipengaruhi oleh proses preparasi

sampel menjadi parameter utama untuk menunjukkan validitas metode ketika

diterapkan dalam analisis dalam sampel gel. Untuk mengetahui validitas metode

kolorimetri dengan pereaksi AlCl3 pada penetapan kadar flavonoid total dalam

sediaan gel teh hijau, maka perlu dilakukan penelitian ini.


3

B. Permasalahan

Apakah penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau

secara kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida mempunyai akurasi dan

presisi yang baik?

C. Tujuan Penelitian

Mengetahui akurasi dan presisi penetapan kadar flavonoid total dalam

sediaan gel teh hijau secara kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida.

D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah:

a. Manfaat teoritis

Memberikan pengetahuan akan metode penetapan kadar flavonoid dalam

sediaan gel

b. Manfaat praktis

Menyediakan metode untuk kontrol kualitas sediaan gel dengan basis natrium

carboxymethylcellulose terutama dengan kandungan flavonoid

E. Keaslian Karya

Pertiwi (2006) telah melakukan penelitian penetapan kadar flavonoid

total terhitung sebagai kuersetin dengan menggunakan metode kolorimetri dalam

teh hijau dan teh hitam [merkX].


4

Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah pada

sampel yang digunakan. Penelitian Pertiwi (2006) menggunakan produk teh hijau

dan teh hitam sebagai sampel. Penelitian ini menggunakan sampel berupa sediaan

gel. Sejauh pengetahuan penulis penelitian validasi metode kolorimetri dengan

pereaksi aluminium klorida untuk penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan

gel basis natrium carboxymethylcellulose belum pernah dilakukan.


5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Flavonoid

Flavonoid ditemukan pada berbagai macam tumbuhan dengan berbagai

struktur yang semuanya memiliki rangka dasar 15 atom karbon dan tersusun

dalam konfigurasi C6–C3–C6. Konfigurasi tersebut menggambarkan dua gugus

benzena yang dihubungkan tiga atom karbon, dapat berupa rantai alifatik atau

rantai siklik yang membentuk cincin piran sebagai cincin ketiga. Sistem

penomoran cincin A dan C menggunakan angka biasa, sedangkan cincin B

menggunakan angka aksen. Flavonoid banyak ditemukan terikat sebagai glikosida

dengan struktur flavonoid-O-glikosida atau flavonoid-C-glikosida (Riyanto,

1990).

Gambar 1. Rangka dasar flavonoid

Gambar 2. Sistem penomoran pada

cincin flavonoid

1. Sifat-sifat fisika-kimia flavonoid

Glikosida mudah larut dalam air dan alkohol, Sebaliknya sebagian besar

aglikon flavonoid larut dalam pelarut organik nonpolar (Bruneton, 1993). Ikatan


6

dengan gula (glikon) dapat meningkatkan kelarutan dari aglikon flavonoid dalam

pelarut polar namun menjadikannya kurang reaktif (Markham, 1982).

Flavonoid, seperti senyawa fenol lainnya, mudah mengalami reaksi

oksidasi pada suasana netral dan basa. Stabilitas flavonoid diperoleh pada suasana

asam, tetapi dalam suasana asam baik panas atau dingin dalam waktu yang lama,

glikosida dapat terhidrolisis (Robinson, 1991).

Flavonoid dapat mengalami perubahan kimia karena panas, enzim,

keberadaan air dan pH. Untuk mencegahnya, bahan baku yang masih segar

biasanya dipanaskan hingga suhu 100oC dengan oven untuk menghentikan reaksi

enzimatik dan menghilangkan air (Riyanto, 1990).

2. Reaksi kimia flavonoid

Flavonoid dapat bereaksi dengan beberapa reagen untuk keperluan

analisis kualitatif maupun kuantitatif. Oleh karena flavonoid biasa ditemukan

dalam bentuk glikosida, maka terlebih dahulu perlu dilakukan hidrolisis yang

akan memisahkan glikon dengan aglikon flavonoid. Hidrolisis dapat dilakukan

dengan tiga macam cara, yaitu dengan katalis asam, enzim, atau basa (Riyanto,

1990).

Tabel 1. Daftar beberapa reagen untuk flavonoid Nama Reagen Sasaran

Natrium metoksida gugus yang peka terhadap basa

Natrium asetat anhidrat identifikasi gugus hidroksil paling basa

Aluminium klorida gugus hidroksi dan keton yang

bertetangga, gugus orto dihidroksi

Asam borat anhidrat dua gugus hidroksi pada posisi orto

(Markham, 1982; Riyanto, 1990)


7

Kondisi hidrolisis flavonoid berbeda untuk jenis flavonoid-O-glikosida

dan flavonoid-C-glikosida. Flavonoid-O-glikosida lebih mudah dihidrolisis

dibandingkan flavonoid-C-glikosida. Jenis glikon dan tempat glikon itu terikat

pada inti flavonoid juga menentukan kondisi untuk hidrolisis (Markham, 1982).

3. Flavonoid teh hijau

Teh (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) mengandung sejumlah flavonoid

golongan flavanol terutama katekin dan senyawa turunannya seperti epikatekin,

epigallokatekin, dan epigallokatekingalat (Syah, 2006). Selain itu terdapat pula

flavonoid golongan flavonol seperti kuersetin, kaempferol, mirisetin, dan

kuercitrin serta beberapa golongan flavonoid yang lain (Anonim, 1999). Katekin,

yang merupakan flavonoid utama dalam teh, ditemukan lebih banyak dalam teh

hijau dibandingkan dalam teh hitam. Hal ini disebabkan enzim polifenol oksidase

yang mengoksidasi katekin diinaktivasi pada proses pembuatan teh hijau,

sedangkan pada pembuatan teh hitam, katekin dibiarkan teroksidasi membentuk

senyawa baru yang memiliki warna merah kecoklatan (Syah, 2006).

B. Kuersetin

Kuersetin termasuk dalam flavonoid golongan flavonol (Bruneton, 1993).

Senyawa ini larut dalam aseton, asam asetat dan pirimidin; sangat sukar larut

dalam air panas dan dietil eter; tidak larut dalam air dingin (Anonim, 2005)


8

OH

OOH

HO O

OH

OH

Gambar 3. Struktur kimia kuersetin

C. Analisis Sediaan Gel

Gel tersusun atas sejumlah kecil komponen padatan yang terdispersi

dalam sejumlah besar cairan. Komponen padat dari gel membentuk jaringan tiga

dimensi yang membentuk rigiditas gel. Oleh karena itu, meskipun sebagian besar

komponennya berupa cairan, gel memiliki kemampuan untuk mempertahankan

bentuknya dengan pemberian sedikit tekanan. Padatan yang lazim digunakan

dalam gel adalah polimer meskipun beberapa gel tersusun atas padatan inorganik.

Contoh polimer yang biasa digunakan sebagai gelling agent antara lain carbomer,

poloxamer, CMC-Na, Hidroxy Propyl Methyl Cellulose (HPMC), dan karaginan

(Swarbick and Boylan, 1992)

Untuk memperoleh analit, yang merupakan komponen gel, sistem

dispersi dari gel perlu dipisahkan terlebih dahulu. Penggunaan ekstraksi padat –

cair atau elektrolit, mampu memisahkan zat terdispersi dan medium dispers gel.

Pelarut-pelarut yang digunakan dalam ekstraksi padat - cair menyesuaikan dengan

sifat kelarutan dari zat terdispersi gel. Untuk keperluan memecah sediaan gel ini

digunakan pelarut yang tidak melarutkan zat terdispersi agar diperoleh endapan

(Gillard et.al, 1985; Rohman, 2007).


9

Elektrolit dapat digunakan untuk mengendapkan zat terdispersi yang

memiliki sifat terionkan. Elektrolit yang digunakan adalah elektrolit dengan sifat

yang berlawanan dengan sifat ion zat terdispersi. Polimer kationik dapat

diendapkan dengan penambahan senyawa anionik begitu pula sebaliknya (Gillard

et.al, 1985).

D. Deskripsi Senyawa Eksipien Penyusun Formula Gel

Tabel 2. Formula gel untuk penelitian Natrium Carboxymethylcellulose (CMC-Na) 4 Asam sitrat 0,5 Propilen Glikol 10 Metil paraben 0,3 Etanol 11,7 Fraksi teh hijau 0,03 Aquades 72,5

(Wijayanti, 2008)

1. Natrium carboxymethylcellulose

Natrium carboxymethylcellulose (CMC-Na) yang juga sering disebut

sebagai carboxymethylcellulose (CMC) atau cellulose gum merupakan gelling

agent turunan selulosa (Zatz and Kushla, 1996). CMC-Na terdispersi dalam air

pada berbagai temperatur membentuk larutan koloidal yang jernih. Materi ini

praktis tidak larut dalam aseton, etanol (95%), eter dan toluen (Parsons, 2005).


10

Gambar 4. Struktur kimia natrium carboxymethylcellulose

2. Asam sitrat

Asam sitrat digunakan secara luas sebagai pemberi suasana asam,

antioksidan, atau buffer dalam berbagai sediaan farmasi. Senyawa ini larut 1

dalam 1,5 bagian ethanol (95%) dan 1 dalam kurang dari 1 bagian air; agak sukar

larut dalam eter (Amidon, 2005).

Gambar 5. Struktur kimia asam sitrat

3. Propilen glikol

Propilen glikol digunakan sebagai antimikroba, humectant, plasticizer,

atau co-solvent. Senyawa ini dapat bercampur dengan aseton, kloroform, etanol

(95%), gliserin dan air; larut 1 dalam 6 bagian eter ( Owen and Weller, 2005).

Gambar 6. Struktur kimia propilen glikol


11

4. Metil paraben

Metil paraben digunakan sebagai antimikroba dalam produk makanan,

dan sediaan farmasi. Senyawa ini dapat digunakan sendiri atau dikombinasikan

dengan paraben yang lain.

Metil paraben mudah larut dalam etanol (95%), dan eter; agak sukar larut

dalam gliserin. Kelarutan dalam air meningkat dengan kenaikan suhu. Pada suhu

kamar 1 bagian metil paraben larut dalam 400 bagian air (Johnson and Steer,

2005).

O

OH

O Gambar 7. Struktur kimia metil paraben

5. Etanol

Etanol biasa digunakan sebagai pelarut dalam berbagai sediaan farmasi.

Senyawa ini dapat bercampur dengan kloroform, eter, gliserin dan air (Owen,

2005).

F. Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer memiliki kemampuan menentukan jumlah analit dalam

suatu sampel berdasarkan berapa banyak cahaya yang diabsorpsi oleh analit

tersebut. Cahaya, yang merupakan radiasi elektromagnetik, diabsorpsi oleh

molekul analit dalam sampel dan menyebabkan terjadinya eksitasi elektron ke


12

tingkat energi yang lebih tinggi. Peristiwa absorpsi ini terjadi melalui satu atau

lebih dari beberapa cara di bawah ini :

1. Transisi elektronik (electronic transition)

Energi dari radiasi elektromagnetik mempromosikan elektron pada orbital

ikatan (bonding orbital) menuju orbital anti-ikatan (antibonding orbital) yang

memiliki energi lebih tinggi.

2. Transisi vibrasional (vibrational transition)

Energi radiasi elektromagnetik bekerja meningkatkan vibrasi atau osilasi dari

atom yang membentuk ikatan kimia.

3. Transisi rotasional (rotational transition)

Energi radiasi elektromagnetik meningkatkan rotasi dari atom yang

membentuk ikatan kimia.

Dari ketiga cara tersebut, transisi elektronik adalah yang paling berperan dalam

analisis pada daerah UV-Vis (Cairns, 2003).

Oleh karena elektron pada kondisi tereksitasi kurang stabil, maka elektron

akan kembali pada kondisi dasar (ground state) yang memiliki tingkat energi

lebih rendah. Pada saat itu elektron melepaskan energi dalam bentuk panas.

Peristiwa inilah yang bertanggungjawab pada proses pembentukan warna

(Christian, 2004).


13

Elektron dalam molekul diklasifikasikan menjadi empat tipe :

1. Elektron pada kulit yang tertutup (closed-shell electrons)

Elektron tipe ini tidak berperan dalam pembentukan ikatan dan memiliki

energi eksitasi yang sangat tinggi sehingga tidak berperan dalam absorpsi pada

area UV-Vis.

2. Elektron ikatan kovalen tunggal (covalent single-bond electrons)

Elektron tipe ini disebut juga elektron sigma (σ). Elektron σ ini memiliki

energi eksitasi yang tinggi sehingga tidak berperan dalam absorpsi pada area

UV-Vis.

3. Pasangan elektron bebas (n)

Elektron tipe ini memiliki energi eksitasi yang lebih rendah dari elektron σ dan

dapat berperan dalam absorpsi pada area UV-Vis. Contohnya adalah pasangan

elektron bebas pada atom N, O, S dan halogen.

4. Elektron pada orbital phi (π)

Elektron tipe ini adalah yang paling mudah tereksitasi dan berperan penting

dalam pembentukan spektrum pada daerah UV-Vis.

(Christian, 2004)

Peristiwa transisi elektron dalam molekul menuju tingkat energi yang

lebih tinggi digolongkan menjadi 4 macam yaitu transisi σ- σ*, transisi n- σ*,

transisi n- π*, dan transisi π- π*. Dari keempat transisi tersebut transisi n- π* dan

π- π* merupakan jenis transisi yang berperan dalam analisis pada daerah UV-Vis

(Rohman, 2007)


14

Gambar 8. Diagram transisi elektron

Aspek kuantitatif spektrofotometer dinyatakan dalam hukum Lambert-

Beer yang secara matematis ditulis menurut persamaan berikut :

A ‐log T log 1T abc

Dimana :

A : absorbansi T : transmitan a : konstanta absorptivitas b : jarak (tebal kuvet) c : konsentrasi (Christian, 2004)

G. Kolorimetri

Suatu senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV yang ingin

ditetapkan kadarnya pada panjang gelombang visibel, perlu diubah terlebih dahulu

menjadi senyawa berwarna (Rohman, 2007). Pengubahan senyawa ini mampu

meningkatkan selektivitas dan sensitivitas metode (Fell, 1986). Penggunaan

reagen tertentu mampu merubah analit menjadi senyawa baru yang mengabsorpsi

pada panjang gelombang visibel. Syarat dari reagen ini adalah :

a. Reaksinya selektif dan sensitif

b. Reaksi berlangsung cepat, bersifat kuantitatif, dan reprodusibel

π

σ*

π*

σ

n


15

c. Produk berwarna yang dihasilkan stabil selama proses analisis berlangsung

(Rohman, 2007)

1. Penetapan kadar flavonoid secara kolorimetri

Senyawa flavonoid memberikan absorpsi pada panjang gelombang UV.

Ketika flavonoid akan ditetapkan kadarnya pada panjang gelombang visibel, maka

reagen tertentu perlu ditambahkan untuk mengubahnya menjadi senyawa

berwarna. Salah satu reagen yang lazim digunakan adalah aluminium klorida

(AlCl3). Senyawa flavonoid yang memiliki gugus hidroksi fenolik yang

bertetangga dengan gugus karbonil dan gugus dihidroksi fenolik mampu bereaksi

membentuk kompleks dengan AlCl3. Gugus hidroksi fenolik yang bertetangga

dengan gugus karbonil membentuk kompleks tahan asam sedangkan gugus

dihidroksi fenolik membentuk kompleks tidak tahan asam (Markham, 1982).

OH

OOH

HO O

OH

OH

quercetin

O

OOH

HO O

O

O

Al2+

Al+

O

OOH

HO O

OH

OH

Al2+

AlCl3 HCl

Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks antara kuersetin dengan Aluminium klorida dalam suasana asam (Markham, 1982)

Kompleks yang terbentuk antara AlCl3 dengan flavonoid merupakan

senyawa koordinasi. Senyawa ini terbentuk oleh ikatan antara ion logam sebagai

atom pusat dengan suatu ion atau molekul netral sebagai ligan (Brady, 1998).

Reaksi pembentukan kompleks ini sering diklasifikasikan sebagai reaksi asam-

basa Lewis. Dalam hal ini, ligan berfungsi sebagai basa Lewis yang mendonorkan


16

pasangan elektron kepada ion logam sebagai asam Lewis dan membentuk

kompleks (Amiji, 2003).

2. Absorpsi radiasi elektromagnetik oleh senyawa kompleks

Absorpsi radiasi elektromagnetik senyawa kompleks pada daerah UV-Vis

terjadi melalui salah satu atau lebih peristiwa transisi, yaitu eksitasi ion logam,

eksitasi molekul ligan, dan transfer muatan. Dua proses yang pertama tidak

memberikan peran yang signifikan dalam analisis kuantitatif senyawa kompleks.

Untuk kepentingan analisis kuantitatif, transfer muatan memegang peranan

penting dalam absorpsi radiasi sinar UV-Vis. Ketika senyawa kompleks menyerap

radiasi, elektron dari ligan berpindah ke ion logam atau sebaliknya. Transisi ini

meliputi promosi elektron dari level π dalam ligan atau dari orbital ikatan σ

menuju orbital kosong (unoccupied orbital) dari ion logam, atau promosi elektron

ikatan σ menuju orbital π yang kosong dari ligan (Christian, 2004).

H. Parameter Validitas Metode Analisis

Validasi metode analisis diperlukan untuk menjamin bahwa prosedur

yang dilakukan dengan cara yang benar memberikan hasil yang sesuai dengan

tujuan analisis (Anonim, 2004a). Parameter yang harus dipenuhi suatu metode

agar dinyatakan valid adalah akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas

kuantitasi, linearitas dan range (Anonim, 2004b).


17

1. Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan nilai terukur dengan nilai sebenarnya.

Akurasi metode analisis ditetapkan dalam range metode tersebut (Anonim,

2004b). Akurasi dihitung sebagai persen perolehan kembali (% recovery) .

Ada tiga metode penentuan akurasi :

a. Menganalisa sampel yang telah diketahui konsentrasinya dan membandingkan

nilai terukur dengan nilai sebenarnya.

b. Spiked – placebo recovery method. Sejumlah zat aktif murni ditambahkan

pada blanko formulasi (formula tanpa zat aktif) dan hasil analisis

dibandingkan dengan nilai teoritis.

c. Metode standar adisi. Pada metode ini, suatu sampel dianalisis, sejumlah zat

aktif murni ditambahkan lalu dianalisis kembali. Perbedaan dua hasil analisis

tersebut dibandingkan dengan hasil teoritis.

(Anonim, 2004a)

2. Presisi

Presisi menyatakan kedekatan hasil analisis satu dengan yang lain ketika

dilakukan pada sampel yang sama dan homogen. Standar deviasi atau standar

deviasi relatif (RSD), disebut juga koefisien variansi (CV), digunakan untuk

menyatakan presisi (Anonim, 2004b).

3. Spesifisitas

Spesifisitas didefinisikan sebagai kemampuan untuk membedakan dan

mengukur suatu analit dari komponen-komponen lain yang ada dalam sampel

(Anonim, 2004b). Spesifisitas harus dibuktikan dengan data yang menyatakan


18

ketiadaan senyawa pengganggu yang mengacaukan hasil analisis seperti senyawa

pengotor (impurities), degradasi produk atau komponen lain dalam sampel

(Anonim, 2004a).

4. Batas deteksi

Batas deteksi merupakan jumlah analit terendah yang masih dapat

dideteksi namun tidak dapat dikuantifikasi dengan nilai yang tepat. (Anonim,

2004b).

5. Batas kuantitasi

Batas kuantitasi merupakan kadar terendah suatu analit yang masih dapat

dihitung dan memberikan akurasi dan presisi yang dapat diterima (Anonim,

2004b).

6. Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk

mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan jumlah analit

dalam sampel (Mulya dan Hanwar, 2003). Linearitas ditentukan dengan membuat

plot hubungan antara kadar dengan respon analisis lalu ditentukan koefisien

korelasi antar keduanya (Anonim, 2004a).

7. Range

Range merupakan rentang kadar terendah dan tertinggi suatu analit yang

masih dapat dihitung dan memberikan akurasi dan presisi yang baik. Range

memiliki satuan yang sama dengan satuan yang digunakan pada hasil analisis

(Anonim, 2004b).


19

Tabel III. Kategori metode analisis dan persyaratan validasi Kategori I II III IV Kuantitatif Limit test Akurasi Ya Ya * * Tidak Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak

Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya Batas deteksi Tidak Tidak Ya * Tidak

Batas kuantitasi Tidak Ya Tidak * Tidak Linearitas Ya Ya Ya * Tidak

Range Ya Ya * * Tidak * Mungkin dibutuhkan tergantung sifat dari metode analisis

United States Pharmacopeia (USP) 28 membedakan metode analisis

menjadi 4 kategori dan masing-masing kategori memiliki persyaratan parameter

validasi yang berbeda.

a. Kategori I merupakan metode analisis kuantitatif untuk senyawa murni obat

dan zat aktif termasuk pengawet dalam sediaan farmasi

b. Kategori II mencakup metode analisis kualitatif dan kuantitatif untuk

menganalisis senyawa pengotor dan produk hasil degradasi dalam sediaan

farmasi

c. Kategori III meliputi metode analisis untuk menentukan karakteristik suatu

sediaan farmasi, seperti kecepatan disolusi dan kecepatan pelepasan obat.

d. Kategori IV mencakup uji identifikasi

Tabel III menunjukkan keempat kategori tersebut beserta kebutuhan

parameter validitasnya.

I. Keterangan Empiris

Senyawa flavonoid dapat membentuk kompleks berwarna dengan

aluminium klorida dalam suasana asam yang intensitas warnanya sebanding


20

dengan kadar flavonoid. Teh hijau mengandung polifenol yang merupakan

senyawa golongan flavonoid. Maka analisis kuantitatif dengan pereaksi

aluminium klorida dapat digunakan pada sampel sediaan gel teh hijau.

Gel tersusun atas padatan berupa polimer yang terdispersi dalam medium

pendispers. Penggunaan pelarut yang tidak melarutkan padatan terdispersi namun

melarutkan medium terdispersi mampu memisahkan kedua komponen gel

tersebut.

Keterangan empiris yang ingin diperoleh dari penelitian ini adalah akurasi

dan presisi metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida untuk

penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau.


21

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk penelitian non-eksperimental rancangan deskriptif

karena tidak ada manipulasi yang dilakukan terhadap subyek uji.

B. Variabel Penelitian

Variabel dalam penelitian ini adalah kadar kuersetin yang diukur dengan

metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida.

C. Definisi Operasional

1. Flavonoid total yang dimaksud dalam penelitian ini adalah semua flavonoid

dalam sediaan gel teh hijau yang dapat membentuk kompleks dengan

aluminium klorida

2. Sediaan gel teh hijau yang digunakan dalam penelitian ini adalah formula hasil

penelitian Wijayanti (2008) dengan komponen CMC-Na, propilen glikol,

metil paraben, asam sitrat, fraksi teh hijau dan aquades

3. Kadar flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau dinyatakan sebagai kadar

flavonoid ekuivalen dengan kuersetin.

4. Akurasi dinyatakan sebagai % recovery

5. Presisi dinyatakan sebagai koefisien variansi (CV)


22

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan meliputi baku kuersetin p.a (Sigma), etil asetat p.a

(J.T. Bakker), aseton p.a (Merck), HCl p.a (J.T. Bakker), AlCl3.6H2O p.a (Merck),

etanol farmasetis (Brataco), heksamin farmasetis (MKR), natrium sitrat farmasetis

(MKR), aquadest. Sampel yang digunakan adalah gel teh hijau hasil penelitian

Wijayanti (2008).

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas (Pyrex-

Germany), spektrofotometer Uv-Vis (Perkin-Elmer Lambda 20), waterbath (Abo-

Tech), alat ultrasonik (Retsch tipe T 460 No. V935922013 EY), micropipet 0,5 –

5,0ml (Socorec), neraca analitik BP 160P, neraca analitik Scaltec SBC 22

readibility 0,01 mg.

F. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan pelarut dan pereaksi

a. Larutan asam klorida 25% dalam aquadest. Akuades sebanyak 10 ml

ditambahkan asam klorida sebanyak 66,7 ml dalam labu takar 100,0 ml. Larutan

tersebut ditambahkan akuades hingga tanda.

b. Larutan heksamin 0,5% dalam aquadest. Heksamin sebanyak 0,5

gram dilarutkan dengan akuades dalam labu takar 100,0 ml sampai tanda.

c. Larutan natrium sitrat 0,5% dalam aquadest. Natrium sitrat sebanyak

0,5 gram dilarutkan dengan akuades dalam labu takar 100,0 ml sampai tanda.


23

d. Larutan asam asetat 5% dalam metanol. Asam asetat glasial sebanyak

25,0 ml ditambahkan metanol p.a dalam labu takar 500,0 ml sampai tanda.

e. Larutan aluminium klorida dalam asam asetat 5% dalam metanol.

Serbuk aluminium klorida sebanyak 2 gram ditambahkan 25 ml asam asetat 5%

dalam metanol dalam labu takar 100,0 ml, lalu dilakukan degassing selama 5

menit untuk membantu melarutkan aluminium klorida. Larutan tersebut

ditambahkan asam asetat 5% dalam metanol sampai tanda. Larutan ini dibuat

sehari sebelumnya dan disimpan dalam botol coklat dan ditutup rapat (Mabry,

1970).

2. Pembuatan sampel

Sampel berupa basis gel teh hijau (tanpa fraksi teh hijau) dibuat sesuai

dengan formula hasil penelitian Wijayanti (2008).

3. Pembuatan blangko

Etil asetat sebanyak 5,0 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 ml lalu

ditambahkan 1,0 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol) dan 0,5

ml natrium sitrat 0,5%. Larutan tersebut ditambahkan asam asetat 5% dalam

metanol sampai tanda.

4. Pembuatan larutan baku

a. Larutan stok kuersetin 500 ppm. Baku kuersetin sebanyak 25,0 mg

yang ditimbang seksama ditambahkan 15 ml etil asetat dalam labu takar 50,0 ml,

lalu dilakukan degassing selama 5 menit untuk membantu melarutkan kuersetin.

Larutan tersebut ditambahkan etil asetat sampai tanda.


24

b. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm. Larutan stok kuersetin 500

ppm sebanyak 2,50 ml diencerkan dengan etil asetat dalam labu takar 25,0 ml

sampai tanda.

5. Penentuan Operating Time (OT)

Larutan intermediet kuersetin 50 ppm sebanyak 2,0 ml ditambahkan 1,0

ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol) dan 0,5 ml natrium sitrat

0,5% dalam labu takar 25,0 ml,. Larutan tersebut ditambahkan asam asetat 5%

dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur tiap 2 menit pada panjang

gelombang maksimum teoritis (428nm) selama 60 menit

6. Penetapan panjang gelombang maksimum

Larutan intermediet kuersetin 50 ppm masing-masing sebanyak 1,5; 3,0;

dan 4,0 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 ml. Masing-masing labu

ditambahkan 1,0 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol) dan 0,5

ml natrium sitrat 0,5%. Larutan tersebut ditambahkan asam asetat 5% dalam

metanol sampai tanda. Serapan diukur pada operating time pada rentang panjang

gelombang 400 – 500nm. Panjang gelombang maksimum ditentukan dari

spektrum yang dihasilkan.

7. Pembuatan kurva baku

Larutan intermediet kuersetin 50 ppm masing-masing sebanyak 1,5; 2,0;

2,5; 3,0; 3,5; dan 4,0 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25,0 ml. Masing-masing

labu ditambahkan 1,0 ml larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol)

dan 0,5 ml natrium sitrat 0,5%. Larutan tersebut diencerkan dengan asam asetat

5% dalam metanol sampai tanda. Serapan diukur setelah operating time pada


25

panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Data yang

diperoleh dihitung menggunakan program regresi linear sehingga diperoleh

persamaan yang dapat digunakan untuk menghitung kadar kuersetin dalam

sampel.

8. Preparasi sampel

a. Pembuatan kuersetin 30 ppm dalam aseton. Baku kuersetin sebanyak

25,0 mg yang ditimbang seksama dilarutkan dengan 15 ml aseton dalam labu

takar 50,0 ml, lalu dilakukan degassing selama 5 menit untuk membantu

melarutkan kuersetin. Larutan tersebut sebanyak 1,5 ml ditambahkan aseton

dalam labu takar 25,0 ml sampai tanda.

b. Isolasi kuersetin. Basis gel teh hijau sebanyak 20 gram dimasukkan ke

dalam beker glass. Basis gel tersebut ditambah dengan 20,0 ml kuersetin 30 ppm

dalam aseton lalu dipindahkan ke dalam mortir. Basis gel digerus dengan stamper

hingga terbentuk endapan berwarna putih, kemudian fase cair dimasukkan

kedalam labu didih 250 ml. Aseton sebanyak 20 ml ditambahkan lagi ke dalam

ampas dan dilakukan penggerusan. Proses ini diulangi 2 kali lagi sehingga

digunakan 80 ml aseton. Proses isolasi telah selesai ketika terbentuk endapan

CMC yang berwarna putih dan tidak nampak lagi ada air yang terjebak dalam

matriks gel. Cairan yang ada di dalam labu didih 250 ml ditambahkan 2,0 ml HCl

25% dan 1,0 ml heksamin 0,5%. Dilakukan refluks pada suhu 60oC selama 30

menit dilanjutkan dengan penguapan seluruh aseton pada suhu 80oC. Waktu yang

dibutuhkan hingga semua aseton menguap kurang lebih 45 menit. Akuades

sebanyak 10 ml dan etil asetat sebanyak 15 ml ditambahkan ke dalam sisa


26

penguapan lalu dimasukkan ke dalam corong pisah. Setelah dilakukan

penggojogan kuat selama 15 detik, fase etil asetat ditampung dalam labu takar

25,0 ml. Fase air diekstraksi sekali lagi menggunakan 10 ml etil asetat. Fase etil

asetat dikumpulkan sebagai larutan sampel. Replikasi dilakukan sebanyak tujuh

kali.

9. Penetapan kadar flavonoid dalam sampel

Larutan sampel dalam etil asetat sebanyak 5,0 ml ditambahkan 1,0 ml

larutan AlCl3 2% (dalam asam asetat dalam metanol) dan 0,5 ml natrium sitrat

0,5% dalam labu takar 25,0 ml lalu. Larutan tersebut ditambahkan asam asetat 5%

dalam metanol hingga tanda.

Larutan didiamkan sampai masuk rentang operating time, lalu diukur

serapannya pada panjang gelombang maksimum. Prosedur yang sama dilakukan

pada replikasi yang lain.

G. Analisis Hasil

Validitas metode dianalisis menggunakan parameter-parameter berikut :

a. Akurasi

Akurasi dinyatakan dengan parameter % recovery dengan rumus :

% recovery kadar terukurkadar teoritis

×100%

b. Presisi

Presisi dinyatakan dengan parameter koefisien variansi (CV) dengan rumus :

CV = SDx

100%


27

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Optimasi Kondisi Pengukuran

Optimasi kondisi pengukuran dilakukan untuk memperoleh kondisi

pengukuran yang optimal. Kondisi yang optimal merupakan bagian tak

terpisahkan dari suatu metode analisis yang mampu memperkecil kesalahan

pengukuran. Dalam konteks penelitian ini, dilakukan optimasi pada dua kondisi

yaitu operating time dan panjang gelombang maksimum.

1. Penentuan operating time (OT)

Pembentukan warna hasil reaksi antara kuersetin dengan aluminium

klorida membutuhkan waktu tertentu agar diperoleh absorbansi optimum. Untuk

itu dilakukan penentuan operating time, yaitu suatu rentang waktu tertentu dimana

spektrum menunjukkan kurva absorbansi yang stabil (datar) sebagai tanda reaksi

pembentukan kompleks telah optimum.

Penentuan operating time ini penting untuk meminimalkan kesalahan.

Sebelum operating time reaksi pembentukan kompleks belum sempurna,

sedangkan setelah operating time dimungkinkan kompleks yang terbentuk sudah

rusak sehingga pengukuran di luar operating time dapat memberikan kesalahan

akibat absorbansi yang terbaca tidak menunjukkan nilai optimum.

Operating time ditentukan menggunakan larutan baku dengan kadar 4

ppm dan dilakukan pada panjang gelombang teoritis yaitu 428 nm (Mabry, 1970).

Pengukuran operating time dilakukan selama 60 menit sejak pereaksi Aluminium


28

klorida ditambahkan. Berdasarkan hasil pengukuran diperoleh operating time

pada rentang 30 – 45 menit. Spektrum operating time dapat dilihat pada gambar 7.

Gambar 10. Spektrum operating time kompleks kuersetin-AlCl3

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Hasil analisis dengan spektrofotometer dipengaruhi salah satunya oleh

panjang gelombang pengukuran. Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang

maksimum dapat meningkatkan sensitivitas dan mengurangi kesalahan analisis.

Hal ini disebabkan pada panjang gelombang maksimum perbedaan konsentrasi

sedikit saja akan menimbulkan absorbansi yang berbeda (Rohman, 2007).

Pada penelitian ini, panjang gelombang maksimum ditentukan sebagai

verifikasi terhadap panjang gelombang maksimum teoritis (428 nm). Verifikasi ini


29

dibutuhkan karena ada kemungkinan hasil yang diperoleh akan berbeda karena

perbedaan waktu, alat, lingkungan, dan personalia penelitian. Farmakope

Indonesia IV (1995) memberikan batasan bahwa panjang gelombang maksimum

terukur tidak boleh berbeda lebih dari 2 nm terhadap panjang gelombang

maksimum teoritis.

Gambar 11. Spektrum panjang gelombang maksimum kompleks kuersetin-

AlCl3

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan pada tiga

konsentrasi larutan baku yaitu 3, 6, dan 8 ppm. Pengulangan pengukuran dengan

tiga konsentrasi berbeda ini bertujuan agar penarikan kesimpulan lebih

meyakinkan. Pengukuran dilaksanakan pada rentang 400 – 500 nm. Spektrum


30

pengukuran panjang gelombang maksimum (gambar 8) menunjukkan bahwa

panjang gelombang maksimum berada pada 427,4 nm. Perbedaan hasil dengan

panjang gelombang maksimum teoritis masih diterima sebab tidak melebihi 2 nm.

B. Pembuatan Kurva Baku

Kurva baku dibuat agar diperoleh persamaan yang dapat digunakan untuk

menghitung kadar kuersetin di dalam sampel. Kurva baku dibuat pada rentang

kadar 3 – 8 ppm. Menurut Anonim (2004a), untuk keperluan validasi metode

dibutuhkan sedikitnya kurva baku yang dibuat pada 6 konsentrasi.

Tabel IV menunjukkan tiga replikasi kurva baku yang diperoleh.

Koefisien korelasi ketiga kurva baku (r) menunjukkan nilai yang lebih besar

dibandingkan dengan harga r tabel dengan taraf kepercayaan 99%, yaitu 0,875

(De Muth, 1999). Untuk keperluan analisis kuantitatif dipilih kurva baku dengan

linearitas terbaik yaitu replikasi 2.

Tabel IV. Hubungan kadar kuersetin dengan absorbansi Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Kadar (ppm) Absorbansi Kadar

(ppm) Absorbansi Kadar (ppm) Absorbansi

3,13 0,162 3,06 0,172 3,15 0,183 4,18 0,236 4,09 0,243 4,21 0,241 5,22 0,279 5,11 0,290 5,26 0,315 6,27 0,324 6,13 0,349 6,31 0,346 7,31 0,402 7,15 0,404 7,36 0,405 8,36 0,486 8,17 0,486 8,41 0,476

A -0,0248 A -0,0079 A 0,0152B 0,05912 B 0,05908 B 0,05402R 0,9926 R 0,9971 R 0,9960

Harga koefisien korelasi, atau sering disebut sebagai linearitas, yang

mendekati ±1 menunjukkan adanya hubungan yang proporsional antara


31

peningkatan kadar dengan absorbansi. Ini merupakan persyaratan berlakunya

hukum Lambert-Beer (Christian, 2004). Dengan demikian persamaan kurva baku

yang diperoleh dapat digunakan untuk menghitung kadar kuersetin dalam sampel.

Gambar 9 menunjukkan titik-titik pada kurva baku yang hampir membentuk garis

lurus, ini menunjukkan koefisien korelasi yang mendekati ±1.

Gambar 12. Kurva baku kuersetin

C. Preparasi Sampel

Preparasi sampel, dalam penelitian ini, merupakan aspek terpenting yang

akan mempengaruhi akurasi dan presisi hasil pengukuran kadar analit. Preparasi

sampel gel meliputi tiga bagian yaitu isolasi analit kuersetin dari dalam sampel

gel, dilanjutkan dengan hidrolisis dan isolasi aglikon yang telah terpisah dengan

gula dengan ekstraksi cair – cair.

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00

Absorba

nsi

Kadar kuersetin (ppm)


32

1. Isolasi analit dari sampel

Kekhasan dari bentuk sediaan gel adalah kemampuan zat terdispersinya

untuk memerangkap medium dispersinya. Kemampuan ini terutama disebabkan

kemampuan zat terdispersi yang berupa polimer untuk membentuk cross link yang

menghasilkan suatu matriks (Zatz and Kushla, 1996).

Ikatan hidrogen dalam natrium carboxymethylcellulose bertanggung

jawab dalam pembentukan cross link. Cross link yang disebabkan oleh ikatan

hidrogen dikenal sebagai physical cross link atau non-kovalen cross link. Natrium

carboxymethylcellulose membentuk tipe cross link yang sering disebut random

coil. Cross link dalam natrium carboxymethylcellulose dapat dilihat pada gambar

13.

Gambar 13. Ikatan hidrogen natrium carboxymethylcellulose membentuk

cross link

Zat aktif merupakan komponen gel yang larut atau bercampur dalam

medium dispersi. Untuk menarik zat aktif keluar dari sistem gel maka medium

dispersi perlu dibebaskan dari matriks zat terdispersi.

Natrium carboxymethylcellulose (CMC-Na) adalah zat terdispersi dalam

formula gel teh hijau yang digunakan sebagai sampel. Untuk menarik medium

dispersi (air) dari matriks CMC-Na, digunakan aseton. Alasan digunakan aseton


33

adalah air dapat bercampur dengan aseton dan flavonoid sendiri mempunyai

kelarutan yang baik di dalam aseton (Drużyńska et al., 2007; Chebil et al., 2007),

sedangkan CMC-Na sendiri praktis tidak larut dalam aseton. Mekanisme isolasi

ini berbeda dengan peristiwa syneresis, yaitu keluarnya medium dispersi dari

matriks gel, yang secara alami terjadi pada gel yang tidak stabil. Keluarnya

medium dispersi pada peristiwa syneresis disebabkan gaya tarik matriks gel

mendorong medium dispersi keluar dari sistem gel, pada proses isolasi ini

keluarnya medium dispersi karena ditarik oleh aseton.

Untuk menarik medium dispersi dari sampel seberat 20 gram dibutuhkan

80 ml aseton yang dilakukan dalam empat tahap masing-masing 20 ml. Perubahan

bobot sampel akan mengubah volume aseton yang diperlukan. Ini berkaitan

dengan kejenuhan campuran air dan aseton, makin banyak air yang harus ditarik

makin banyak aseton yang diperlukan untuk menarik.

Penggunaan kekuatan mekanik juga dibutuhkan pada proses ini. Kontak

antara aseton dengan permukaan gel menyebabkan matriks CMC-Na di

permukaan menyusut dan menghalangi penetrasi aseton ke bagian dalam gel.

Untuk mempermudah penetrasi aseton, digunakan tenaga mekanik yang dalam

penelitian ini berupa penggerusan dengan mortir dan stamper.

Akhir dari proses isolasi ini ditunjukkan secara subyektif dengan tidak

adanya air yang terjebak dalam matriks gel dan terbentuknya endapan CMC-Na.

Hal ini dapat dilihat pada gambar 14.


34

Keterbatasan dari proses isolasi ini terletak pada subyektivitasnya yang

tinggi. Subyektivitas ditemui dalam proses penggerusan dengan mortir, hasil yang

berbeda mungkin dapat ditemui pada peneliti yang berbeda.

Gambar 14. Endapan CMC-Na yang terbentuk pada akhir proses isolasi

2. Tahap hidrolisis

Hidrolisis dibutuhkan untuk memecah glikosida sehingga dihasilkan

aglikon flavonoid. Penggunaan baku berbentuk aglikon kuersetin sebenarnya tidak

membutuhkan tahap hidrolisis. Tahap ini dikerjakan pada baku untuk

menyamakan perlakuan dengan sampel gel yang mengandung fraksi teh hijau. Hal

ini dikarenakan sebagian besar flavonoid yang ditemukan dalam teh hijau terikat

sebagai glikosida terutama pada atom C3 dan C4’ yang merupakan gugus

potensial untuk reaksi dengan aluminium klorida (Anonim, 1999).

Kandungan flavonoid dalam teh merupakan golongan flavonoid-O-

glikosida yang dapat terhidrolisis dengan waktu yang relatif singkat. Menurut

Anonim (1999), glikon yang terikat pada flavonoid dalam teh adalah jenis


35

glukosida, galaktosida dan rhamnosida. Ketiga jenis glikon tersebut terhidrolisis

dalam waktu kurang dari 30 menit pada suasana asam (Markham, 1982).

O OH

OH

OH

O

O

OH

OHHO

O

O

OOH

HO

OH

OH

HO OH

OH

OH

O

O

OH

OHHO

O

O

OOH

HO

OH

OH

OH

HCl+ H2O +

rutin

kuersetin

rutinosida

C3

Gambar 15. Reaksi hidrolisis flavonoid

Prosedur hidrolisis yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada

penelitian Pertiwi (2006). Prosedur hidrolisis tersebut menggunakan asam klorida

untuk menghidrolisis flavonoid dalam medium aseton. Heksamin yang juga

ditambahkan dalam sistem hidrolisis digunakan untuk menangkap kelebihan ion

H+. Reaksi hidrolisis ditunjukkan pada gambar 15.

3. Ekstraksi cair – cair

Sampel yang telah dihidrolisis merupakan campuran senyawa flavonoid

yang larut dalam aseton dan glikon yang larut air. Campuran dua macam senyawa

yang berbeda sifat kelarutannya ini dikhawatirkan menimbulkan masalah ketika

dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer, yaitu adanya endapan glikon di

dalam larutan sampel sehingga mengganggu pembacaan absorbansi.


36

Ekstraksi cair – cair dengan corong pisah dipilih sebagai metode untuk

memisahkan kedua senyawa yang berbeda sifat kelarutan tersebut. Sistem Etil

asetat - air digunakan karena keduanya tidak bercampur, dan flavonoid sendiri

larut dalam etil asetat.

Aseton yang terdapat dalam sistem hidrolisis, mampu bercampur baik

dengan air maupun dengan etil asetat. Pada tahap orientasi diketahui bahwa

keberadaan aseton menyebabkan pemisahan kedua fase tidak optimal dan tidak

reprodusibel. Fenomena ini dapat disebabkan karena indeks polaritas aseton dan

etil asetat yang tidak terlalu berbeda, sehingga dapat bercampur pada saat

dilakukan ekstraksi cair – cair. Aseton memiliki indeks polaritas 5,1 sedangkan

etil asetat 4,4. Karena itu sebelum dilakukan ekstraksi cair – cair seluruh aseton

diuapkan.

D. Penetapan Kadar Flavonoid dalam Sampel

Hingga akhir proses preparasi sampel, belum diperoleh senyawa

flavonoid yang murni. Metil paraben yang lebih larut dalam pelarut organik masih

ditemukan dalam fase etil asetat yang digunakan sebagai larutan sampel (gambar

16). Kedua senyawa ini, aglikon flavonoid dan metil paraben, memberikan

serapan pada daerah UV, sehingga penetapan kadar pada daerah UV tidak

dimungkinkan.

Reaksi aluminium klorida dengan aglikon flavonoid menyebabkan

pergeseran panjang gelombang serapan dari aglikon flavonoid, sehingga senyawa

kompleks yang terbentuk memberikan serapan pada daerah visibel. Pada panjang


37

gelombang visibel, metil paraben sudah tidak memberikan serapan lagi, sehingga

penetapan kadar dapat dilakukan tanpa adanya senyawa pengganggu.

Gambar 16. Alur pengerjaan sampel gel

Pada penelitian ini, reaksi pembentukan kompleks berlangsung dalam

suasana asam yang berasal dari pelarut asam asetat dalam metanol. Untuk

mempertahankan pH asam dalam sistem, maka digunakan natrium sitrat yang

ditambahkan sesaat setelah penambahan aluminium klorida sebagai buffer.

Senyawa berwarna yang terukur dalam penelitian ini merupakan

kompleks aluminium dengan gugus hidroksi fenolik yang bertetangga dengan

gugus karbonil dan gugus orto dihidroksi fenolik. Kompleks aluminium dengan

gugus orto dihidroksi fenolik masih terbentuk pada kondisi ini, meskipun gugus

tersebut tidak tahan asam. Hal ini dikarenakan asam yang digunakan adalah asam

Hidrolisis, dan ekstraksi cair - cair

Fase padat : endapan CMC-Na

Gel

Isolasi dengan aseton

Fase cair : - air - etanol - propilenglikol - asam Sitrat - metilparaben - flavonoid

Fase etil asetat : - metilparaben - flavonoid

Fase air : - asam Sitrat - glikon


38

lemah dengan konsentrasi yang rendah. Markham (1982) menerangkan

penggunaan asam klorida pekat untuk memutus kompleks aluminium dengan

gugus orto dihidroksi fenolik.

E. Analisis Validitas Metode

Penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel termasuk dalam

metode analisis kategori I (Anonim, 2004b). Kategori I mensyaratkan parameter

validasi metode spesifisitas, akurasi, presisi, linearitas, dan range. Parameter-

parameter yang dapat diperoleh melalui penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Spesifisitas

Informasi mengenai spesifisitas metode diperoleh melalui studi pustaka

mengenai kemungkinan reaksi aluminium klorida dengan komponen-komponen

gel yang lain. Komponen-komponen gel yang lain tidak memiliki gugus-gugus

yang dapat bereaksi dengan aluminium klorida sehingga dapat dikatakan bahwa

metode ini spesifik hanya akan menetapkan kadar flavonoid dalam sediaan gel.

Tabel V. Data % recovery dan koefisien variansi metode

Replikasi Kadar Terukur (%)

Kadar Teoritis (%) % recovery

1 0.002753 0.002925 94,13 2 0.002568 0.002893 88,77 3 0.002789 0.003024 92,22 4 0.002553 0.002956 86,36 5 0.002872 0.003044 94,35 6 0.002982 0.003057 97,54 7 0.002382 0.002828 84,25

rata-rata 91,09 SD 4,78 CV 5,25


39

2. Akurasi

Akurasi metode ditentukan berdasarkan nilai % recovery. Metode

penentuan recovery yang digunakan pada penelitian ini adalah spiked – placebo

recovery method. Anonim (2004a) memberikan batasan % recovery yang diterima

untuk sampel di bawah 0,1% adalah 75 – 125%. Tabel V menunjukkan %

recovery dari metode sebesar 91,09 ± 4,78%. Hasil ini menunjukkan bahwa

metode penetapan kadar masih memenuhi rentang % recovery yang

dipersyaratkan.

3. Presisi

Level presisi yang berlaku dalam penelitian ini adalah repeatability.

Level presisi ini meliputi kesalahan yang mungkin terjadi pada tahap preparasi

sampel seperti penimbangan, pengenceran, dan ekstraksi pada kondisi penelitian

yang sama (personalia, alat, waktu, dan laboratorium yang sama). Untuk

penentuan repeatability setidaknya dibutuhkan enam sampel (Ermer, 2005).

Repeatability dinyatakan sebagai koefisien variansi (CV). CV dari

metode dapat dilihat pada tabel V. Menurut Anonim (2004a) CV yang masih

diterima untuk sampel dengan kadar dibawah 0,1% adalah 20%, sedangkan

metode ini memberikan CV sebesar 5,25 %. Dengan demikian, CV dari metode

yang diteliti masih dapat diterima.

4. Linearitas

Parameter linearitas diperoleh melalui informasi tentang koefisien

korelasi yang diperoleh dalam pembuatan kurva baku. Anonim (2004a)

memberikan batasan koefisien korelasi yang dapat diterima untuk analisis


40

kuantitatif adalah sebesar 0,99. Kurva baku yang dibuat pada konsentrasi antara 3

– 8 ppm menghasilkan koefisiean korelasi sebesar 0,9971 menunjukkan bahwa

metode ini memberikan linearitas yang baik.

Akurasi dan presisi, yang menjadi parameter utama dalam penelitian ini,

terutama dipengaruhi oleh preparasi sampel. Tahap preparasi sampel yang

semakin panjang berpotensi menurunkan kualitas akurasi dan presisi metode

karena kemungkinan terjadinya kesalahan juga meningkat.

Validasi metode yang dilakukan Pertiwi (2006) menghasilkan akurasi

yang lebih baik dibandingkan penelitian ini, tetapi presisi yang dihasilkan sama.

Rentang % recovery pada penelitian tersebut antara 98, 51 – 101, 99 %,

sedangkan penelitian ini menghasilkan % recovery pada rentang 84,25 – 97,54 %.

Penurunan akurasi ini dipengaruhi oleh preparasi sampel yang lebih panjang dan

penggunaan sediaan farmasi (gel). Pertiwi (2006) melakukan validasi metode

penetapan kadar dengan sampel berupa baku kuersetin. Validasi metode yang

dilakukan Pertiwi (2006) menghasilkan CV pada rentang 4,11 – 8, 28 %,

sedangkan pada penelitian ini dihasilkan CV 5,25%.


41

BAB V

KESIMPULAN, SARAN DAN KETERBATASAN

A. Kesimpulan

Metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida memberikan

akurasi dan presisi yang baik untuk penetapan kadar flavonoid total terhitung

kuersetin pada sediaan gel teh hijau.

B. Saran

Penelitian ini perlu dilanjutkan dengan penelitian penetapan kadar

flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau.

C. Keterbatasan

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan aglikon

flavonoid sedangkan di alam flavonoid ditemukan sebagai glikosida.


42

DAFTAR PUSTAKA

Amidon, G.E., 2005, Citric Acid Monohydrate, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/ 1000293169.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007

Amiji, M. M., 2003, Complexation and Protein Binding, in Brown M., and Sheinis, L. A., Applied Physical Pharmacy, 200-201, The McGraw-Hill Companies, Inc., USA

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 1999, Assay Camellia Sinensis #1, http://ukcrop.net/perl/ace/enh_tree/PhytochemDB?name=Camellia%20sinensis%20%231&class=Assay&expand=Result#Result, diakses tanggal 23 Oktober 2007

Anonim, 2004a, Guidelines For the Validation of Analytical Methods For Active Constituent, Agricultural and Veterinary Chemical Products, Australian Pesticides & Veterinary Medicines Authority, Australia

Anonim, 2004b, The United States Pharmacopeia 28, the United States Pharmacopeial Convention, Inc

Anonim, 2005, Material Safety Datasheet Quercetin Dihydrate MSDS, http://www.sciencelab.com/xMSDS-Quercetin_Dihydrate-9924781, diakses tanggal 27 Oktober 2007

Brady, J. E., 1998, General Chemistry Princples & Structure, 5th Ed., Jilid 1, diterjemahkan oleh Sukmariah Maun, Kamianti Anas, dan Tilda S. Sally, 455, Binarupa Aksara, Jakarta

Bruneton, J., 1993, Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants, 2nd Ed., translated by Caroline K. Hatton, 1076-1077, Intercept Ltd., Londress, Lavoisier Publishing, Paris

Cairns, D., 2003, Essential of Pharmaceutical Chemistry, 2nd edition, 151; 154, Pharmaceutical Press, Great Britain

Chebil, L., Humeau, C., Anthoni, J., Dehez, F., Engasser, J., and Ghoul M., 2007, Solubility of Flavonoids in Organic Solvents, J. Chem. Eng. Data , 52, 1552-155


43

Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, 6th Ed., 468, John Wiley & Sons, Inc., USA

De Muth, J.E., 1999, Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., USA

Drużyńska, D., Stepniewska, A., Wołosiak, R., 2007, The Influence of Yime and Type of Solvent on Efficiency of the Extraction of Polyphenols from Green Tea and Antioxidant Properties Obtained Extracts, Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 6(1), 27-36

Ermer, J. and Miller, J. H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis, 32, Wiley - VCH Verlag GmbH & Co. KGaA

Fell, A.F., 1986, UV and Visible Fluorescence Spectrophotometric, in Wade (Ed), Clarke’s Isolation and Identification of Drug, 2nd Ed., 222-225, The Pharmaceutical Press, London

Gillard, P., Pope, C., and Bore, P., 1985, Applications of Spectral Analysis of Polymers in Cosmetics, dalam Bore, P., Cosmetic Analysis: Selective Methods and Techniques, 16-27, Marcell-Dekker, Inc., United States of America

Johnsons. R., and Steer, R., 2005, Methylparaben, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/ 1000293170.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007

Mabry, T. J., Markham, K. R., and Thomas, M. B., 1970, The Systematic Identification of Flavonoids, 35, Springer-Verlag, Berlin

Markham, K.R., 1982, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 5, 25, 47, Penerbit ITB, Bandung

Mulya, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, Vol. III No.2, 71-76

Owen, S.C., 2005, Alcohol, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/ 1000293170.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007

Owen, S.C., and Weller, P.J., 2005, Propylene Glycol, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/ 1000303976.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007

Parsons, D., 2005, Carboxymethylcellulose Sodium, http://www.medicinescomplete.com/mc/excipients/current/1000295789.htm, diakses tanggal 24 Agustus 2007


44

Pertiwi, M.V., 2006, Penetapan Kadar Flavonoid Total Terhitung Sebagai Kuersetin dengan Menggunakan Metode Kolorimetri dalam Teh Hijau dan Teh Hitam [merkX], Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Riyanto, S., 1990, Flavonoid, dalam Mursyidi, A. (Ed), Analisis Metabolit Sekunder, 172; 175, Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Robinson, T., 1991, Kandungan Organik Tumbuhan tinggi, 6th Ed., 208, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung

Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, 251-252, Pustaka Pelajar, Yogyakarta

Svobodova, A., Psotova, J., and Walterova, D., 2003, Natural phenolics in prevention of UV-Induced Skin Damage (A review), Biomed. Papers, 147(2), 137-145

Swarbick, J., and Boylan, J.C., 1992, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, jilid 15, 415, Marcel Dekker Inc., Nem York

Syah, A.N.A., 2006, Taklukkan Penyakit dengan Teh Hijau, 46, AgroMedia Pustaka, Jakarta

Wijayanti, L.R., 2008, Optimasi Formula Gel Sunscreen Ekstrak Kering Polifenol Teh Hijau (Camellia sinensis (L.)) dengan CMC (Carboxymethylcellulose) Sebagai Gelling Agent dan Propilen Glikol Sebagai Humektan dengan Metode Desain Faktorial, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Zatz, J.L., and Kushla, G.P., 1996, Gels, in Lieberman, H.A., Rieger, M.M., and Banker, G.S., Pharmaceutical Dosage Forms Disperse Systems, Volume 2, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., USA


45

Lampiran 1. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar larutan baku

I II III Kertas 0,2029 0,1996 0,1963 Kertas + zat 0,22943 0,22506 0,22226 Kertas + sisa 0,20331 0,19952 0,19665 Zat 0,02612 0,02554 0,02561

Contoh perhitungan kadar larutan baku (replikasi II)

Kuersetin dilarutkan dalam etil asetat hingga volume 50,0 ml (larutan stok)

25,54 mg50,0 ml

= 51,08 mg100 ml

= 510,8 mg1000 ml

= 510,8 ppm

Diambil 2,5 ml larutan stok diencerkan dengan etil asetat hingga volume 25,0 ml

(larutan intermediet)

510,8 ppm × 2,5 ml = X ppm × 25,0 ppm

X = 510,8 ppm × 2,5 ml

25,0 ml

= 51,08 ppm

Dipipet 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; dan 4,0 ml, ditambahkan pereaksi dan

diencerkan dengan pelarut hingga volume 25,0 ml

Kadar I = 51,08 ppm × 1,0 ml

25,0 ml

= 2,04 ppm

Kadar II = 51,08 ppm × 1,5 ml

25,0 ml

= 3,06 ppm


46

Kadar III = 51,08 ppm × 2,0 ml

25,0 ml

= 4,09 ppm

Kadar IV = 51,08 ppm × 2,5 ml

25,0 ml

= 5,11 ppm

Kadar V = 51,08 ppm × 3,0 ml

25,0 ml

= 6,13 ppm

Kadar VI = 51,08 ppm × 3,5 ml

25,0 ml

= 7,15 ppm

Kadar VII = 51,08 ppm × 4,0 ml

25,0 ml

= 8,17 ppm

Dua replikasi yang lain dihitung dengan cara yang sama


47

Lampiran 2. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar teoritis sampel

1 2 3 4 5 6 7 Kertas 0,1936 0,1986 0,1963 0,1960 0,1972 0,1955 0,1974 Kertas + zat 0,21895 0,22348 0,22226 0,22167 0,22278 0,22114 0,22280Kertas + sisa 0,19358 0,19886 0,19665 0,19616 0,19728 0,19639 0,19822Zat 0,02537 0,02462 0,02561 0,02551 0,02550 0,02575 0,02458Basis gel 20,818 20,424 20,324 20,709 20,103 20,217 20,863

Contoh perhitungan kadar kuersetin dalam sampel (replikasi 1)

Kuersetin dilarutkan dalam aseton hingga volume 50,0 ml

25,37 mg50,0 ml

50,74 mg100 ml

507,4 mg1000 ml

507,4 ppm

Diambil 1,5 ml diencerkan hingga volume 25,0 ml

507,4 ppm x 1,5 ml = X ppm x 25,0 ml

X = 507,4 ppm × 1,5 ml

25,0 ml

= 30,444 ppm

Diambil 20,0 ml lalu dicampurkan dalam basis gel, sehingga jumlah kuersetin

yang ditambahkan kedalam basis gel adalah :

30,444 mg1000,0 ml

0,609 mg20,0 ml

Jadi di dalam basis gel terdapat 0,609 mg kuersetin. Kadarnya adalah:

0,609 mg20,818 g

0,002925 g100 g

0,002925%

Enam replikasi yang lain dihitung dengan cara yang sama.


48

Lampiran 3. Data dan contoh perhitungan % recovery

Replikasi Absorbansi Nilai X Kadar terukur (%)

Kadar teoritis (%) % recovery

1 0,263 4,5853 0.002753 0.002925 94,13 2 0,240 4,1960 0.002568 0.002893 88,77 3 0,260 4,5345 0.002789 0.003024 92,22 4 0,242 4,2299 0.002553 0.002956 86,36 5 0,265 4,6192 0.002872 0.003044 94,35 6 0,277 4,8223 0.002982 0.003057 97,54 7 0,227 3,9760 0.002382 0.002828 84,25 Rata-rata 91,09 SD 4,784

Contoh perhitungan % recovery (replikasi 1)

Nilai X dihitung dari persamaan kurva baku Y = 0,05908X - 0,0079

0,263 = 0,05908X – 0,0079

X = 0,263 + 0,0079

0,05908

= 4,5853 ppm

Nilai X merupakan kadar kuersetin hasil pengenceran 5 ml larutan sampel dengan

pereaksi AlCl3, Na sitrat, dan pelarut asam asetat dalam metanol hingga volume

25,0 ml. Maka kadar kuersetin dalam larutan sampel adalah :

4,5853 ppm × 255

= 22,9265 ppm = 22,93 ppm

Jumlah kuersetin terukur dalam basis gel:

22,93 mg1000,0 ml

0,573 mg25,0 ml

Kuersetin terukur dalam basis gel sebanyak 0,573 mg. Kadarnya adalah :

0,573 mg20,818 g

=0,002753 g

100 g= 0,002753%


49

Perhitungan % recovery :

% recovery = ,,

× 100%

= 94,13 %

Enam replikasi yang lain dihitung dengan cara yang sama.


50

Lampiran 4. Perhitungan koefisien variansi (CV)

Replikasi x x2 1 94,13 8860,46 2 88,77 7880,11 3 92,22 8504,53 4 86,36 7458,05 5 94,35 8901,92 6 97,54 9514,05 7 84,25 7098,06 ∑ 637,62 58217,18

Perhitungan Rata-rata (x)

x = ∑

= 637,62

7 = 91,09

Perhitungan Standar Deviasi (SD)

SD = ∑ ∑

= 7(58217,18 ,

7(7-1) = 4,784

Perhitungan Koefisien Variansi (CV)

CV = SD

= 4,78491,09

×100% = 5,25%


51

Lampiran 5. Gambar endapan CMC-Na yang terbentuk

(a) Endapan yang terbentuk pada waktu isolasi dengan 40 ml aseton

(b) Endapan yang terbentuk pada waktu isolasi dengan 80 ml aseton

Proses isolasi yang telah selesai ditunjukkan dengan tidak adanya air yang terjebak dalam matriks gel seperti gambar (b)


52

BIODATA PENULIS

Penulis skripsi berjudul VALIDASI METODE

KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI

ALUMINIUM KLORIDA UNTUK PENETAPAN

KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM SEDIAAN

GEL BASIS NATRIUM

CARBOXYMETHYLCELLULOSE ini bernama

lengkap Laurentius Dian Ardiyanto. Penulis dilahirkan

di Yogyakarta pada tanggal 3 Februari 1986 sebagai

anak pertama dari pasangan Robertus Rudy Suselo dan Maria Magdalena Gani

Linarti.

Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah SD Pangudi

Luhur Yogyakarta (tahun 1992 hingga tahun 1998), SLTP Negeri 5 Yogyakarta

(tahun 1998 hingga tahun 2001), SMU Negeri 1 Yogyakarta (tahun 2001 hingga

tahun 2004). Pada tahun 2004 penulis melanjutkan studi di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma. Selama kuliah, penulis pernah mengikuti beberapa

kepanitiaan. Penulis juga aktif menjadi asisten beberapa mata praktikum.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · dari awal penelitian hingga laporan akhir...

Documents