mamben klt jadi

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

A. TUJUAN PERCOBAAN : 1.Menentukan komposisi eluen yang tepat

dengan metode cincin terkonsentrasi.

2. Menentukan nilai Rf dari zat warna pada

tanaman dengan menggunakan pelat KLT.

B. DASAR TEORI

Kromatografi lapis tipis (KLT) atau Thin Layer Chromatography

(TLC) dalah salah satu jenis kromatografi cair-cair dan berdasarkan

mekanisme pemisahannya termasuk kromatografi adsorpsi serta jika ditinjau

dari konfigurasinya termasuk kromatografi planar. Dasar pemisahan

kromatografi lapis tipis adalah perbedaan kecepatan migrasi di antara fasa

diam yang berupa padatan dan fasa gerak yang merupakan campuran solven

(eluen) yang dikenal dengan pelarut pengembang campur. Fasa diam yang

digunakan adalah lapisan tipis adsorben yang disalurkan pada sebuah pelat

dari kaca, aluminium foil tebal, atau plastik. Sebagai adsorben dapat

digunakan silika gel, aluminium, atau selulosa.

Pelat KLT dibuat dengan mencampurkan adsorben dengan suatu bahan

pengikat, seperti kalium sulfat (gips), polivinil alkohol, atau kanji dan air

sehingga menjadi suatu bubur kental. Kemudian bubur kental disalutkan ke

pelat secara merata dengan ketebalan 0,1 – 0,25 mm untuk tujuan analitik atau

sekitar 1 – 2mm untuk KLT preparatif. Setelah itu pelat dikeringkan dan

dipanaskan dalamoven pada suhu 110C untuk mengaktifkan adsorben

tersebut. Pengovenan ini dimaksudakan agar pelat lebih kering lagi dan

molekul air yang terikat dipelat terlepas sehingga pelat dapat mengikat

molekul lain dan noda yang didapatkan tampak jelas.

Analisis dengan KLT yaitu

1. Persiapan pelat

Untuk pengujian cincin terkonsentrasi, pelat diberi tanda titik dengan

pensil untuk tempat menotolkan noda dan tiap titik memiliki jarak yang

sama panjangnya satu sama lain. Dan untuk penentuan Rf, pelat diberi

tanda garis sebagai dengan pensil yang berjarak 1 cm dari bagian bawah

dan 0,5 cm dari bagian atas. Pada pemberian tandadan garis ini tidak

menggunakan tinta melainkan menggunkan pensil karena jika

menggunakan tinta nanti tintanya bisa ikut berpendar atau memancarkan

warna sebab tinta terdiri dari berbagai macam warna.

2. Pemilihan pelarut pengembang (eluen)

Pemilihan eluen tergantung pada jenis analit yang akan dipisahkan.

Eluen yang menyebabkan seluruh noda yang ditotolkan pada pelat naik

sampai batas atas pelat (solvent front) tanpa mengalami pemisahan

berarti eluen terlalu polar. Sebaliknya jika noda yang ditotolkan sama

sekali tidak bergerak berarti eluen kurang polar. Untuk menguji

kesesuain eluen dengan analit digunakan metode cincin terkonsentrasi

yang memberikan gambar sebagai berikut

Hasil kromatografi yang diadapat dari penggunaan eluen yang kurang

polar, polar dan eluen yang sesuai adalah

Kurang polar Normal Terlalu polar

Noda sampel

Lapisan luar pelarut (solvent front)

Kurang polar Kurang polar Terlalu polar

3. Persiapan “Chamber”

Chamber yang digunakan dapat berupa bejana, gelas, atau botol dari

kaca dengan dasar rata. Bagian dalam chamber dilapisi dengan kertas

saring sampai seluruh dinding chamber tertutup oleh kertas saring tetapi

bagian atas chamber tidak tertutup kertas saring sekitar 2 –3 cm.

Kemudian eluenyang digunkan dimasukkan kedalam chamber sebanyak

5 mL untuk menjenuhi kertas saring dengan uap eluen tersebut dan

selama proses penjenuhan chamber harus ditutup dengan pelat kaca

sampai kertas saring basah seluruhnya. Kertas saring tidak boleh

melebihi tinggi gelas karena uapnya dapat keluar melalui kertas saring

yang berada di luar gelas sehingga chamber tidak jenuh lagi dan noda

tidak naik. Jika kertas saring terlalu kecil maka chamber tidak akan

jenuh semuanya sehingga noda sulit naik atau berkembang.

4. Tahap penotolan dan tahap pengembangan

Untuk pengujian cincin terkonsentrasi, pada sebuah pelat ditotolkan

beberapa noda sampel yang sama kemudian setiap noda ditotolkan eluen

yang berbeda. Sedangkan untuk penentuan Rf, pada sebuah pelat

ditotolkan beberapa noda yang sama di batas bawah pelat. Kemudian

pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan. Penempatan

pelat dilakukan dengan hati-hati sehingga lapisan tipis fasa diam pelat

tidak bersentuhan dengan kertas saring di dalam chamber dan noda yang

ditotolkan tidak terkena pelarut. Setelah pelat diletakkan dengan benar,

chamber ditutup dan dibiarkan eluen merambat naik secara kapiler.

Setelah eluen mencapai batasatas pelat, maka pelat segera diangkat dan

noda yang terbentuk ditandai dengan pensil, kemudian diukur Rf-nya.

Jika tidak ada noda yang terlihat maka pelat disemprot dengan pereaksi

penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat, amonium

sulfida, dan sebagainya. Atau dengan cara menyinari pelat dengan

lampu ultra violet atau menjenuhkan pelat dengan uap iodium.

Cara menghitung Rf adalah

Cara menentukan simpangan baku adalah

C. ALAT DAN BAHAN

a. Pelat kaca yang berukuran 5x 2 cm dan 3 x 5 cm

b. Pipa kapiler

c. Pinset panjang

d. Corong pemisah 100 mL

e. Gelas yang memiliki dasar rata, lurus, diameter 10 cm dan tinggi 7

cm

f. Kertas saring Whatman selebar bagian dalam gelas dan setinggi 2-3 cm

dibawah mulut gelas

g. Gelas ukur 10 mL

h. Erlenmeyer 100 mL

i. Kaja arloji

j. Pelat kaca

k. Pelat cat air

l. Metanol

m. Daun pandan betawi yang sudah diblender kering 25 g

D. CARA/ALUR KERJA1. Persiapan Sampel

Sampel: pandan betawi

2. Persiapan pelat

25 gr pandan betawi yang sudah dihaluskan

25 mL metanol

+ 25 mL diklorometan

Direndam Diambil filtratnya (diperas dengan

tangan yang sudah memakai sarung tangan) setelah larutan berwarna cukup tua.

Filtrat dimasukkan ke dalam corong pemisah.

Campuran dikocok baik-baik dengan arah sama sambil sekali-sekali dibuka tutupnya.

Campuran didiamkan sampai terbentuk dua lapisan.

Lapisan bawah diambil dan digunakna sebagai pigmen sampel.

Pelat 3 X 5 cm

Pelat 2 X 5 cm

Dioven Diberi beri titik-titik dengan pensil

untuk tempat menotolkan noda dengan jarak 1 cm dan sehingga dapat memuat 6 titik

Diberi batas dengan pensil. Batas bawah 1 cm dan batas atas 0,5 cm

3. Persiapan Eluena dan Tahap Penotolan dan Pengembangan Sampel

a. untuk cincin terkonsentrasi

b. Untuk penentuan Rf

Metanol

diklorometana

Dicampur ke dalam vial-vial dengan perbandingan metanol : diklorometan sebagai berikut:A. 3 : 7B. 4 : 6C. 5 : 5D. 6 : 4E. 7 : 3F1. 8 : 2F2. 2 : 8

Kertas saring

+ 5 mL campuran metanol dan diklorometana

Dimasukkan ke dalam gelas hingga menutupi seluruh dinding gelas tetapi tidak melebihi bagian atas gelas.

Ditutup dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya.

Hasil

Hasil

4. Tahap penotolan dan pengembangan sampel

a. untuk cincin terkonsentrasi

b. untuk penentuan Rf

Sampel ditotolkan 2-3 kali dengan pipa kapiler pada enam titik yang telah diberi tanda dengan pensil tadi sampai warnanya cukup jelas. Noda yang ditotolkan harus pada tempat yang sama.

Diberi kode A-F untuk setiap noda Campuran pada vial A-F ditotolkan

pada noda Dibandingkan eluen mana yang cocok

untuk sampel.

Pelat 3 X 5 cm

Pelat 2 X 5 cm

Sampel ditotolkan pada batas bawah pelat KLT 2-3 kali hingga noda cukup jelas.

Pelat kaca dibuka. Pelat KLT dimasukkan ke dalam gelas

dengan hati-hati dengan menggunakan pinset sampai posisi pelat bagian bawah menyentuh dasar gelas (tidak boleh miring). Noda jangan sampai terkena eluen.

Segera ditutup kembali gelas tersebut dan dibiarkan mengembang sampai eluen tersebut menyentuh batas atas pelat.

Saat eluen menyentuh batas atas pelat, pelat KLT diambil dengan hati-hati.

Noda diamati dan diberi tanda pensil, dikeringkan.

Ditutup denga selotip agar noda tidak memudar warnanya.

Harga Rf setiap komponen yang dihasilkan oleh pemisahan dihitung.

Hasil

Hasil

E. DATA HASIL PENGAMATAN

1.Cincin terkonsentrasi

Jenis A B C D E F

Kunyit C C T T C C

Pandan C T C T C C

Keterangan :

K : kurang polar

C : cukup polar

T : terlalu polar

Kunyit : yang cukup polar adalah = E, F

Pandan : yang cukup polar adalah = C, E

Jadi eluen yang di gunakan adalah E dengan perbandingan metanol dan

diklorometana adalah 7 : 3.

2. Penentuan Rf

Rf1 Rf2 Rf3 Rf4 Rf5 Rf6

I II Rata2 I II Rata2 I II Rata2 I II Rata2 I II Rata I II Rata2

Kunyit 0,2

06

0,206 0,206 0,338 0,3

52

0,345 0,4

85

0,4

85

0,485 0,6

32

0,647 0,639

Pandan 0,5 0,529 0,5145 0,588 0,6

03

0,595 0,6

17

0,6

47

0,542 0,6

76

0,676 0,676 0,7

65

0,79

4

0,779 0,82

4

0,838 0,831

F. DISKUSI DAN PEMBAHASAN

Pada percobaan KLT ini dilakukan dengan beberapa tahap dan

digunakan dua jenis sampel yaitu kunyit dan daun pandan betawi. Pada

masing-masing sampel ini diambil ± 15gr ekstrak, kemudian pada ekstrak

daun pandan ditambahkan 25 ml metanol dan pada ekstrak kunyit

ditambahkan etanol sebagai pelarut. Fungsi dari masing-masing pelarut ini

adalah untuk mengekstrak zat warna pada sampel, yang ditunjukkan dengan

perubahan warna semakin tua. Hijau tua pada pandan dan kuning tua pada

kunyit.

Setelah diperoleh warna yang cukup tua, masing-masing sampel ini

dimasukkan dalam corong pemisah yang berbeda dan masing-masing

ditambahkan 25 ml diklorometan. Diklorometan ini berfungsi sebagai

pengikat pengotor pada sampel. Setelah terbentuk lapisan, dimana lapisan

bawah merupakan fase organik dan bagian bawah atas merupakan air dan

pengotor. Lapisan bawah (fase organik) ini diambil dan digunakan sebagai

pigmen sampel, yang merupakan pigmen murni dari pandan dan kunyit.

Pada tahap kedua merupakan tahap persiapan pelat. Pelat yang

digunakan pada percobaan ini berupa pelat aluminium, dengan ukuran 3x5

cm. Pada salah satu permukaan pelat ini terdapat lapisan tipis suatu adsorben

yang berfungsi sebagai media pemisahan (fase diam). Adsorben ini berupa

serbuk halus yang diubah menjadi bubur (slurry) berair dan direkatkan pada

pelat, untuk membantu perekatan pada pelat, surry ini ditambahkan zat

pengikat yang berupa gips, barium sulfat, polivinil alkohol atau kanji.

Adsorbenini mempunyai gugus OH yang dapat bereaksi dengan uap air

diudara, akibatnya silika adsorben dapat menjadi jenuh dan tidak dapat

digunakan lagi. Oleh karena itu sebelum dipakai adsorben ini diaktivasi

terlebih dahulu untuk menghilangkan kandungan airnya dengan cara

memanaskannya dalam oven. Selanjutnya pada pelat ini dibuat enam titik-titik

kecil dengan jarak antara masing-masing 1 cm dan titik dibuat dengan pensil

untuk menghindari kemungkinan ikut terlarut bila mengunakan bolpoint saat

ditotolkan pelarut.

Tahap berikutnya, masing-masing titik pada pelat satu ditotolkan

sampel dari daun pandan dan pada pelat dua ditotolkan sampel dari kunyit.

Sebelumnya masing-masing titik diberi tanda A, B, C, D, E, dan F.

Selanjutnya pada masing-masing titik-titik sampel ditambahkan pelarut

pengembang (eluen) yang terdiri dari metanol dan diklorometana. dengan

perbandingan :

A = 3:7

Bersifat urang polar

B = 4:6

C = 5:5

Bersifat cukup polar

D = 6:4

E = 7:3

F1 = 8:2

Bersifat terlalu polar

F2 = 8:2

Berdasarkan percobaan ini dihasilkan data :

Jenis A B C D E F

Kunyit K C T T C C

Pandan K T C T C K

Keterangan :

K : kurang polar

C : cukup polar

T : terlalu polar

Data 1 Tabel Cincin Terkonsentrasi

Dapat diketahui setelah diuji dengan eluen A, B, dan C ternyata

sampel kunyit kurang polar. Hal ini dapat dilihat dari bercak sampel yang

dihasilkan setelah ditambahkan eluen. Setelah penambahan eluen pada sampel

kunyit, bercak yang dihasilkan kurang mengembang, hal ini dikarenakan eluen

A, B, dan C kurang polar dari sampel. Akan tetapi bercak yang dihasilkan oleh

eluen A lebih lebar dari eluen B, dan bercak eluen B lebih lebar dari eluen C.

sehingga dapat diketahui eluen A lebih polar dari B dan B lebih polar dari C.

Pada tiga totolan sampel kunyit berikutnya dengan eluen D, E dan F

menghasilkan luas bercak yang hampir sama dan ketiga-tiganya cukup polar.

Selanjutnya pada sampel pandan dilakukan pengujian sebanyak

dua kali. Pada pengujian pertama dapat diketahui pada sampel A, B, C, D dan

E bersifat cukup polar. Pada sampel A, B, C, D dan E memiliki bentuk cincin

yang tidak bulat sempurna. Hal ini dapat disebabkan pada penotolan sampel

yang kurang merata dan penotolan eluen pada sampl tidak tepat pada titik

sampel. Cincin F terbebtuk cincin yang lebih sempurna, dimana bercak dapat

mengembang dengan sempurna saat ditetesi eluen. Hal ini menunjukkan

pelarut (eluen) F bersifat polar.

Pada tahap penentuan Rf digunakan eluen E dengan perbandingan

metanol terhadap diklorometana adalah 7:3. pada percobaan ini digunakan dua

buah pelat pada masing-masing tepi atas dan bawah diberi batas 0,5 cm dan 1

cm dengan pensil. Selanjutnya pada masing-masing pelat pada batas bawah

ditotolkan pigmen kunyit dan pandan cina, Pelat ini dimasukkan dalam gelas

yang telah berisi eluen. Gelas yang digunakan harus berinding dan berdasar

rata. Hal ini untuk menghindari pelat agar tidak miring sehingga diperoleh

bercak sampel yang tegak lurus yang memeprmudah dalam menentukan jarak

perpindahannya. Akan tetapi sebelum eluen dimasukkan dalam gelas, pada

sekeliling tepi sebelah dalam pada gelas dilapisi dengan kertas saring,

kemudian eluen dimasukkan dan ditutup dengan kaca. Kertas saring ini

digunakan sebagai indikator jenuh tidaknya eluen. Apabila eluan jenuh maka

seluruh kertas saring akan basah. Perubahan ini dapat diamati melalui tutp

kaca. Setelah semua kertas basah, pelat yang telah ditotolkan sampel

dimasukkan dalam gelas dengan menggunakan pinset. Dan selanjutnya eluen

yang merupakan fasa gerak akan merambat naik hingga ujung atas pelat.

Secara bersamaan zat terlarut (sampel) akan terangkut dengan laju yang

bergantung pada kelarutannya dalam fasa gerak.pada jalur perpindahn ini

terdapat noda/warna sampel ang terpendar, dimana pada sampel kunyit

terbentuk dua noda warna yang berbeda. Noda ini merupakan jarak

perpindahan zat terlarut. Pada sampel satu (kunyit) dihasilkan noda 1 dan noda

2 pada jarak 0.7, 1.15, 1.65, dan 2.15 cm sedangkan pada sampel yang kedua

(kunyit) dihasilkan noda 1 dan 2 pada jarak 0.7, 1.2, 1.65 dan 2.7 cm. Pada

sampel pandan diperoleh noda pada sampel satu yaitu pada jarak 1.7, 2, 2.1,

2.3, 2.6, da 2.8cm. pada sampel dua diperoleh jarak pada 1.8, 2.05, 2.2, 2.3,

2.7 dan 2.85 cm. Seharusnya jarak noda yang ditempuh pada sampel satu dan

dua pada pigmen kunyit dan pandan adalah sama. Hal tersebut di sebabkan

karena jumlah sampel yang ditotolkan tidak sama dan cara penotolan yang

tidak sempurna sehingga baik pada kunyit maupun pada pandan betawi

terdapat sampel yang ditotolkan terlalu polar sehingga menyebabkan jarak

antara pandan dan kunyit tidak sama.

Berdasarkan data yang diperoleh dapat diketahui Rf dari masing-

masing noda yang dihasilkan. Rf merupkan perbandingan antara jarak

perpindahan zat dengan jarak perambatan larutan eluen.

Berdasarkan perhitungan dari data yang diperoleh didapatkan nilai Rf.

berdasarkan persamaan Rf = dengan :

A = jarak perpindahan sampel

B = jarak perambatan Eluen

Diperoleh Rf pada sampel kunyit dan pada pandan sebagai berikut

Sampel Rf Warna

Kunyit

1 0,206 kuning

2 0,345 Coklat kuningan

3 0,485 Coklat kekuningan

4 0,639 Kuning muda

Pandan 1 0,514 Hijau kuning

2 0,595 Hijau kuning ++*

3 0,632 Hijau kuning +++

4 0,676 Hijau kebiruan

5 0,779 Hijau daun

6 0,831 Kelabu* tanda + menekankan warna hijau

Nilai Rf dan beberapa pigmen secara teoritis adalah sebagai berikut:

Pigmen Rf Warna dibawah cahaya biasa

Feofitin a 0.93 Kelabu

Feofitin b 0.80 Coklat kekuningan

Klorofil a 0.60 Hijau biru

Klorofil b 0.35 Hijau kuning

Feoforbida a 0.18 Kelabu

Feoforbida b 0.70 Coklat kuning

Klorofida a 0.30 hijau biru

Klorofida b 0.20 Hijau kuning

Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui :

1. Kunyit

a. noda 1 dengan warna coklat kuning merupakan pigmen feoforbida

b dengan nilai Rf teoritis 0,700 dan berdasarkan percobaan nilai

RF yang didapatkan adalah 0,206

b. noda 2 dengan warna coklat kekuningan merupakan pigmen

feofitin b dengan nilai Rf teoritis 0,800 dan berdasarkan percobaan

nilai RF yang didapatkan adalah 0,345

c. noda 2 dengan warna coklat kekuningan merupakan pigmen



d. noda 2 dengan warna coklat kekuningan merupakan pigmen



2. Pandan

a. noda 1 dengan warna hijau kuning merupakan pigmen klorofil b

dengan nilai Rf teoritis 0,350 dan berdasarkan percobaan nilai RF

yang didapatkan adalah 0,514

b. noda 2 dengan warna Hijau kuning ++ merupakan pigmen

Klorofil b dengan nilai Rf teoritis 0,35 dan berdasarkan percobaan


c. noda 3 dengan warna Hijau kuning +++ merupakan pigmen

Klorofil b dengan nilai Rf teoritis 0,350 dan berdasarkan

percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,632

d. Noda 4 dengan warna hijau biru merupakan pigmen Klorofil a


yang didapatkan adalah 0,676.

e. noda 5 dengan warna kelabu merupakan pigmen feoforbida b



f. noda 5 dengan warna kelabu merupakan pigmen feoforbida b



G. SIMPULAN

1. Komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi adalah

perbandingan metanol dan diklorometan 7 : 3.

2. Nilai Rf dari zat warna pada Kunyit dengan menggunakan pelat KLT

adalah Rf1 = 0,206, Rf2 = 0,345, Rf2 = 0,485, dan Rf2 = 0,639. Sedangkan

nilai Rf pada Pandan dengan mengunakan KLT adalah Rf1 = 0,514, Rf2 =

0,595, Rf3 = 0,632, Rf4 = 0,676, Rf5 = 0,779 dan Rf5 = 0,77

H. TUGAS / JAWABAN PERTANYAAN

1. Apakah yang terjadi jika eluen yang digunakan sebagai pelarut

pengembang pada KLT terlalu polar atau kurang polar? Mengapa?

Jawab:

Jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT

terlalu polar, maka seluruh noda yang ditotolkan pada pelat akan naik

sampai batas atas pelat tanpa mengalami pemisahan. Sebaliknya, jika

eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT kurang

polar, maka noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak.

2. Apa fungsi kertas saring pada percobaan penentuan Rf?

Jawab:

Berfungsi untuk menjenuhkan gelas dengan uap pelarut setelah

dibasahkan dengan uap dari campuran pelarut pengembang.

3. Mengapa permukaan pelat KLT tidak boleh rusak?

Jawab:

Agar warna pada sampel dapat terpisah dengan baik.

4. Mengapa pelat KLT yang digunakan harus dikeringkan dulu dalam

oven?

Jawab:

Agar pelat bebas dari molekul-molekul air yang terikat. Jumlah air yang

terikat sangat berpengaruh pada pemisahan, karena air terikat sangat

kuat pada adsorben sehingga menghambat terjadinya kesetimbangan

dengan molekul-molekul analit

5. Mengapa batas atas dan batas bawah pelat harus diberi tanda dengan

pensil?

Jawab:

Karena warnanya tidak dapat menyebar pada pelat, dan tidak

mempengaruhi warna pada sampel yang diujikan. Namun jika

menggunakan pulpen, maka tinta pulpen warnanya akan menyebar dan

mempengaruhi warna pada sampel.

I. DAFTAR PUSTAKA

Sianita, Maria Monica. 2006. Kromatografi. Surabaya : Departemen

Pendidikan Nasional, FMIPA, UNESA.

Soebagio, dkk. 1999. Kimia Analitik II. Malang : Jurusan Kimia, FMIPA,

Universitas Negeri Malang.

mamben klt jadi

Documents