kelompok 4 - klt dan aplikasinya pada isolasi senyawa flavonoid

8/13/2019 Kelompok 4 - KLT Dan Aplikasinya Pada Isolasi Senyawa Flavonoid

1/42

Fitri Wulandari

Dyan Oktavia Rindhu S.R

Bernita Yanuaritmala

M. Falahudin

Dianah Rosikhoh


2/42

Metode pemisahan ini menggunakan lapisantipis adsorben sebagai media pemisahan (kromatografi adsorbsi)

Proses isolasi yang terjadi berdasarkan dayaserap dan daya partisi serta kelarutan darikomponen-komponen kimia yang akanbergerak mengikuti kepolaran eluen, olehkarena daya serap adsorban terhadap

komponen kimia tidak sama, maka komponenbergerak dengan kecepatan yang berbedasehingga hal inilah yang menyebabkanpemisahan


3/42

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah metode kromatografi

sederhana-- bermanfaat untuk analisis Obat

Lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan

kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang

digunakan juga lebih sederhanaWaktu cukup singkat (15-60 menit)

Jumlah zat yang diperiksa cukup kecil (kira-kira 0,01 g

senyawa murni, 0,1 g simplisia) sehingga hampir semua

laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.


4/42

Penggunaan KLT umum untuk tujuan

1.Analisa Kualitatif

2. Analaisa Kuantitatif

3. Analisa Preparatif/ analitik


5/42


6/42

Analisa Preparatif/ KLT analitik

Kromatografi analitik biasanya dipakai pada tahap permulaan

untuk semua cuplikan, Kromatografi preparatif dilakukan

untuk memperolah fraksi murni dari campuran.

Ketebalan lapisan

- KLT preparatif 0,5-2 mm dg ukuran plat 20x20 am atau 20x40

cm

- KLT analitik 0,1-0,2 mm umumnya 0,25 mm (untuk HPTLC/ KLT-

KT umumnya 0,2 mm)


7/42

1. Lebih cepat dan lebih reproducible dari kromatografi kertas.2. Untuk menyempurnakan pemisahan, lempeng dapat dibuat dengan

campuran adsorben sebagai berikut :

a. Campuran homogen dari beberapa adsorben

b. Satu lempeng dilapisi dengan adsorben yang berbeda-beda

c. Satu lempeng dilapisi dengan campuran dua adsorben dengankonsentrasi bervariasi dari 0% ke 100% untuk adsorben yang

satu dari ujung lempeng yang satu ke ujung lempeng yang lain

dan sebaliknya.

3. Area dari bercak lebih kompak dan jenis spray-reagents lebih

banyak termasuk yang bersifat korosif dapat digunakan bilaadsorben bukan selulosa.

4. Identifikasi komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,

fluoresensi atau pemadaman fluoresensi, radiasi UV


8/42

5. Dapat dilakukan elusi dengan mekanik

(ascending) atau menurun (descending) atau

dengan cara elusi 2 dimensi

6. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baikkarena komponen yang ditentukan

merupakan noda yang tidak bergerak


9/42

Kekurangan dari teknik ini mungkin hanya

pada prosedur pembuatan lempengnya yang

memerlukan tambahan waktu, kecuali bila

telah tersedia lempeng yang diproduksisecara komersial.


10/42

Harmita, 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia.

Departemen Farmasi FMIPA Universitas

Indonesia


11/42

Perbedaan Analitik&Preparatif


12/42

Analitik Preparatif

Tujuan utama adalah

untuk analisis

Fase diam yang

digunakan sedikit Pada aplikasinya

menggunakan cara

penotolan

Bertujuan untuk

pemisahan/ isolasi

Fase diam yang

digunakan lebihbanyak.

Dibuat pita


13/42

Pemilihan Adsorben


14/42

Faktor yang harus diperhatikan dalam

pemilihan jenis adsorben :

Tidak bereaksi dengan senyawa yang akan

dianalisis Tidak larut dalam pelarut yang digunakan

Bersifat stabil selama berlangsungnya proses

pemisahan

Ukuran partikel seragam


15/42

Adsorben yang umum digunakan adalah:Silika gel

Alumina

Tanah diatomeaeSerbuk selulosa


16/42

Pemilihan Sistem Pengemban(eluen)


17/42

Tergantung sifat campuran senyawa yangakan dipisahkan, kepolaran senyawa

Menggunakan kombinasi pelarut

Dikerjakan dengan dua arah pendekatan,melalui data pustaka atau dengan coba-coba


18/42

Pemilihan Pelarut


19/42

Pada penggunaan pelarut perlu diperhatikan :

Kemurnian Pelarut

Campuran pelarut hanya boleh digunakan

maksimum 2-3 kali

Komposisi campuran dapat berubah karena

penyerapan atau penguapan

Reaksi satu sama lain komponen-komponen

campuran pelarut


20/42


21/42

Lempeng TLC yang sering digunakan ialah

lempeng silika.

Macam lempeng lainnya yang jarang

digunakan sekarang

selulosa danpoliamida


22/42

Eluen yang Dapat Digunakan


23/42

Dianah Rosikhoh

1106009223

M. Falahuddin


24/42

Diambil dari jurnal


25/42

1. Daun dipisahkan dari tanamannya.

2. Dicuci dibawah air mengalir.

3. Dikeringkan 45C di dalam oven.

4. Kemudian daun kering dihaluskan menjadiserbuk.


26/42

1. Masukkan 10 gram serbuk simplisia ke

dalam 100 ml methanol.

2. Larutan dipanaskan 55C di water bath

selama 5 menit.3. Simpan selama 1 hari

4. Larutan kemudian dipekatkan dibawah

tekanan pada suhu 45C menggunnakan

rotary evaporator, hingga mencapai 1/10volume larutan mula-mula.


27/42

Solvent yang digunakan:

Etil Asetat: Asam Asetat Glasial: Asam Formiat :

Aquadest(12.1: 1.3: 1.1: 2.8)

Ukuran pelat:

3 x 10 cm (TLC Silica gel 60 F254, Merck)

1. Ekstrak diteteskan di atas pelat. Lalu pelat

dielusikan ke dalam chamber yang telah jenuh

dengan 10 ml solvent.

2. Pelat diperiksa dibawah sinar UV pada panjang

gelombang 366 nm. Keberadaan flavonoid

dapat diperjelas dengan menyemprotkan

larutan etanol 1% dalam AlCl3.


28/42

1. Ukuran pelat: 20 x 10 cm (HPTLC Silica gel 60 F254,

Merck)

2. Pelat diaktivasi pada suhu 110 C selama 30 menit.

3. 2000l ekstrak diaplikasikan sebagai pita tunggal

dengan panjang 180 mm pada pelat HPLTC.

4. Pelat dikembangkan dengan 10 ml solvent. Solvent

yang digunakan adalah Etil Asetat : Asam Asetat

Glasial : Asam Formiat : Aquadest (12.1: 1.3: 1.1: 2.8).


29/42

5. Pelat diperiksa dibawah sinar UV 366 nm. Hasil:

Bercak 1: Rf = 0,15 dengan fluoresensi coklat.

Bercak 2: Rf = 0,20 dengan fluoresensi biru muda.Bercak 3: Rf = 0,45 dengan fluoresensi biru muda.

Bercak 4: Rf = 0,33 dengan fluoresensi biru terang.

Bercak 5: Rf = 0,82 dengan fluoresensi coklat muda.

6. Pita yang berfluoresensi biru tipis dengan Rf = 0,33

dipertimbangkan sebagai kemungkinan flavonoid, sehingga

dipilih untuk diisolasi.


30/42

Pelat HPLTC pada fluoresensi 366 nm


31/42

1. Pita yang terpilih dikerok bersama dengan silikanya, menggunakan

pisau tajam dan dikumpulkan di eppendorf tube.

2. Komponen flavonoid dielusikan dari silica gel dengan methanol,

sehingga komponen flavonoid akan terlarut dalam methanol.

3. Larutan ini kemudian diuapkan pada suhu ruangan hingga volumenya

mencapai 1/3 volume awal. Dan beri nama fraksi 1.

4. Fraksi 1 dilakukan co-kromatografi dengan ekstrak kasar untuk

memastikan pitanya memiliki Rf yang sama.

5. Hasilnya adalah pita tunggal yang tajam dan berfluoresensi biru yang

diduda flavonoid.


32/42

Pelat HPLTC fraksi 1 pada fluoresensi 366 nm


33/42

6. Ukur serapan pada

spektrofotometer UV Vis. Dan

serapan maksimum muncul pada

365-370 nm.

7. Fraksi 1 hanya menampilkan peak

tunggal pada 370-380 nm. Dan

dapat dikonfirmasi bahwa ini

merupakan komponen flavonoid.


34/42

8. Lihat struktur fraksi 1 dengan menggunakan infra

merah. Hasil:

3195.74cm-1: alkana bebas (=CH).

3423.47cm-1: fenol atau alkohol (-OH).

1652.32cm-1: aromatik (C=C).


35/42

Mishra, Gaurav J, dkk. 2012. Isolation of

Flavonoid Constituent from Launaea

procumbensRoxb. by Preparative HPTLC

Method.Gujarat: Veer Narmad South Gujarat

University.


36/42


37/42


38/42

Flavon yang termetilasi atau terasetilasi tinggi dan

juga flavonol eluen non polar, seperti kloroform :

methanol (15 : 1)

Aglikon flavonoid (apigenin, luteolin, quersetin)

kloroform : methanol (96 : 4) dan eluen dengan

kepolaran yang setara dengan itu

Glikosida flavonoid etil asetat : asam format :asam asetat glasial : air (100 : 11 : 11 : 26)

Rutin dan vitexin-2-O-rhamnosideetil asetat : etil

metil keton : asam format : asam asetat glasial : air

(50 : 30 : 7 : 3 : 10)


39/42

Kehati-hatian dalam pemilihan sistem eluen

dapat memisahkan glukosida flavonoid dari

bentuk analog galaktosida

Misal, 8-C-glucosylapigenin (vitexin) dapatdipisahkan dari 8-C-galactosylapigenin

dengan eluenetil asetat : asam format :

air (50 : 4 : 10)


40/42

Penyemprot iodinespot kuning-coklat

dengan latar putih

Spektrofotometri UV-Vis (254 nm) dengan

plat silika gel F 254

spot gelap Spektrofotometri (365 nm)kuning gelap,

hijau, atau biru (tergantung jenis flavonoid)


41/42

Untuk hasil yang lebih pasti, bisa digunakanHPTLC

Plate yang digunakan untuk tujuanpemisahan pada HPTLC silika gel 60 F 254,

RP-18, Diol HPTLC Eluen (pada plat RP-18) methanol : air

Glikosida yang polar memerlukan persentaseair yang besar sehingga didesain plat

HPTLC yang khusus,


42/42

Sumber :

Andersen, Oyvind M., Kenneth Markham. 2006.

Flavonoids : Chemistry, Biochemistry, and

Applications.Boca Raton : CRC Press.

kelompok 4 - klt dan aplikasinya pada isolasi senyawa flavonoid

Documents