LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK DASAR LABORATORIUM

UJI HEMAGLUTINASI , HAMBATAN HEMAGLUTINASI & ELISA

Oleh :Novian Agni Y (1406504371)Kelompok 1PROGRAM MAGISTER BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIAJAKARTA

2014UJI HEMAGLUTINASI

A. TUJUAN

Mengukur titer hemagglutinin (HA) sediaan virus (dengan pengenceran tertinggi) yang masih memberikan reaksi aglutinasi positif ujikan (virus dapat berikatan dengan sel darah merah dari berbagai spesies), yang nantinya akan digunakan untuk uji Hambatan Aglutinasi (HI).B. PENDAHULUANPada taksonomi makhluk hidup, virus dikelompokkan pada kingdom tersendiri karena dapat dianggap sebagai benda mati atau benda hidup. Virus dianggap benda mati karena dapat dikristalkan, sedangkan dianggap benda hidup karena dapat memperbanyak diri dalam tubuh inang serta memiliki materi genetik. Virus hanya memiliki satu materi genetik yaitu DNA atau RNA. Virus influenza termasuk dalam kategori virus RNA. Virus influenza diklasifikasikan menjadi 3 golongan, yakni virus influenza A, B dan C (Teama, 2012). Virus H1N1 termasuk virus influenza tipe A yang dapat menginfeksi manusia maupun hewan seperti ayam

Gambar 1. Struktur virus influenzaVirus-virus tertentu (influenza) memiliki struktur khusus berupa selubung protein spesifik yang disebut hemagglutinin atau HA, yang dapat terikat pada reseptor sialic acid pada permukaan sel target. Virus ini juga dapat berikatan dengan eritrosit membentuk gambaran lattice (kisi/jeruji). Proses ini kemudian disebut hemaglutinasi, yang menjadi dasar pada beberapa uji laboratorium. Manfaat Uji hemaglutinasi dapat digunakan untuk membedakan subtipe HA, mengukur nilai HA sediaan virus influenza dan mengukur titer HA yang berguna saat ; kultur virus, mengambil stok virus, melakukan uji HI dan penentuan kadar 4HAU untuk standarisasi antigen uji HI. Uji hemaglutinasi (HA) yang dikerjakan pada praktikum ini bertujuan untuk menentukan titer antigen virus (influenza) yang kemudian akan digunakan untuk uji Hambatan Aglutinasi (HI) . Metode ini relatif mudah dilakukan dan sederhana.

Gambar 2. Virus mengikat selC. ALAT DAN BAHAN UJI HEMAGLUTINASIAlat :

1) Mikroplate dengan dasar berbentuk V2) MikropipetBahan :

3) Larutan PBS (Posphate Buffer Saline) : 50 l/well4) Antigen Virus H1N1 : 100 l 5) Sel Darah Merah Ayam : 50 l/wellD. LANGKAH KERJA UJI HEMAGLUTINASI1. Menyediakan mikroplate dengan dasar berbentuk V

2. Melabeli mikroplate: well A1-12 dan well C1-12 sebagai perlakuan uji, well E1 dan E2 sebagai kontrol

3. Memasukkan 50 l PBS pada well A2-12 dan C2-124. Memasukkan 100 l antigen H1N1 pada well A1 dan C15. Melakukan pengenceran menggunakan mikropipet dengan cara dilution fold: mengambil antigen 50 l dari well A1 dimasukkan ke A2, kemudian dari A2 diambil 50 l dimasukkan ke A3 dan seterusnya sampai A12. Demikian juga dengan kolom B, pengenceran dilakukan dengan cara dilution fold. Ulangi cara pada well C. 6. Memasukkan 50 l SDM pada setiap well, kemudian mencampur dengan baik secara manual dengan sedikit menggoyangkan mikroplate

7. Menginkubasi pada suhu ruang (22-25oC)

8. Catat pengenceran tertinggi antigen yang masih memberikan reaksi aglutinasi sel darah merah E. HASIL UJI HEMAGLUTINASI

Dari hasil percobaan, diperoleh reaksi aglutinasi positif pada well A dan C, yaitu mulai dari well A1 dan C1 (antigen yang tidak mengalami pengenceran) sampai well A4 dan B4 (antigen dengan pengenceran 1/8). Hasil positif menunjukkan terjadinya ikatan antara eritrosit ayam dengan antigen virus sehingga membentuk gambaran lattice yang melapisi well, sedangkan hasil negatif ditandai dengan adanya endapan eritrosit pada dasar well. Pada well dengan hasil positif, pengenceran 1/8 merupakan pengenceran tertinggi yang masih dapat mengaglutinasi eritrosit. Karena volume reaksi pada percobaan ini adalah 50 l, maka untuk menentukan unit 8 HA adalah dengan membagi 8 dengan 8 menjadi 1. Hal ini berarti 1 bagian antigen tidak lagi diencerkan dengan PBS sehingga nantinya akan diperoleh 8 unit HA (yang digunakan untuk uji HI). Well E1 dan E2 sebagai kontrol negatif menunjukkan hasil yang negative dimana tidak terjadi aglitunasi. UJI HAMBATAN AGLUTINASI

A. TUJUAN

Mengukur titer antibodi spesifik (dengan pengenceran tertinggi) terhadap hemagglutinin (HA) sediaan virus yang masih dapat menginhibisi terjadinya aglutinasi sel darah merah.B. PENDAHULUAN

Secara bahasa haemagglutination inhibition dapat diartikan sebagai hambatan haemaglutinasi. Sedangkan haemaglutinasi merupakan penggumpalan dari sel darah merah. Kemampuan mengaglutinasi tidak dimiliki oleh semua virus atau bakteri yang menyerang ayam tetapi hanya beberapa virus dan bakteri yang memiliki zat haemaglutinin, diantaranya paramyxovirus (ND), poxvirus (Pox), adenovirus (EDS), orthomyxovirus (AI), bakteri Mycoplasma sp., Haemophilus paragallinarum maupun Salmonella pullorum. Zat haemaglutinin yang terdapat dalam tubuh virus atau bakteri tersebut bersifat antigenik yang dapat merangsang terbentuknya antibodi spesifik. Antibodi yang terbentuk tersebut memiliki kemampuan mengambat terjadinya aglutinasi darah yang disebabkan oleh haemaglutinin dari virus atau bakteri.

HI test menggunakan reaksi hambatan haemaglutinasi tersebut untuk membantu menentukan diagnosa penyakit secara laboratorium dan mengetahui status kekebalan tubuh (titer antibodi). Prinsip kerja dari HI test ialah mereaksikan antigen dan serum dengan pengenceran tertentu sehingga dapat diketahui sampai pengenceran berapa antibodi yang terkandung dalam serum dapat menghambat terjadinya aglutinasi eritrosit. HI test merupakan metode uji serologis yang mudah dilakukan dan hasilnya dapat diketahui dengan cepat.C. ALAT DAN BAHAN

Alat :

1. Microplate dengan dasar berbentuk V

2. Micropipet

Bahan :

1. 12,5 l Larutan PBS (Phosphat Buffer Saline)

2. 12,5 l Antigen virus H1N1 (4 HAU) 3. 25 l serum positif (serum darah kelinci yang sudah divaksinasi H1N1, mengandung Ab terhadap virus H1N1)

4. 25 l serum negatif (serum darah kelinci yang belum divaksinasi H1N1, tidak mengandung Ab terhadap virus H1N1)

5. 50 l Sel darah merah ayam segarD. LANGKAH KERJA

1. Menyediakan mikroplate dengan dasar bentuk V

2. Melabeli mikroplate: well A2-12 dan B2-12 sebagai perlakuan serum positif, well D2-12 dan E2-12 sebagai perlakuan serum kontrol. Well G1-2 sebagai kontrol PBS. Melabeli serial delusi pada well (1-2048)

3. Memasukkan 25 l PBS pada well A2-12 dan B2-12 (serum positif), 25 l PBS pada well D2-12 dan E2-12 (serum negatif) dan 25 l PBS pada well G1-2 (sebagai kontrol)

4. Memasukkan 25 l serum positif pada well A1,B1 dan 25 l serum negatif pada well D1,E15. Melakukan pengenceran menggunakan mikropipet dengan cara dilution fold: mengambil serum 12,5 l dari well A1 dimasukkan ke A2, kemudian dari A2 diambil 12,5 l dimasukkan ke A3 dan seterusnya sampai A12. Demikian juga dengan kolom B,D dan E pengenceran dilakukan dengan cara dilution fold.

6. Memasukkan 25 l virus 8 HAU ke semua well kecuali well kontrol

7. Mencampur secara manual dengan sedikit menggoyangkan microplate, kemudian menginkubasi selama 30 menit

8. Memasukkan 50 l SDM ke semua well dan menginkubasi selama 10 menit atau sampai terlihat hasilnya

9. Mencatat hasilnya

123456789101112

A

B

C

D

E

F

G

H

Serum positif

Serum negatif

PBS

PBS (kontrol)

E. HASIL

Reaksi hambatan aglutinasi yang positif didapatkan pada well D dan E yaitu pada well dengan pengenceran antibodi 1/128 dan 1/256, yaitu well D6 dan E7 hingga pada well yang tidak mengalami pengenceran , well D1 dan E1. Hal ini menunjukkan bahwa titer antibodi serum yang digunakan masih sangat tinggi, sehingga dengan pengenceran 1/256 pun masih menunjukkan hasil yang positif. Reaksi hambatan aglutinasi yang positif ditunjukkan dengan adanya endapan sel darah merah (ring) pada dasar well. Hal ini dimungkinkan karena antibodi spesifik pada serum positif akan berikatan dengan antigen virus, sehingga antigen virus tadi tidak sempat mengikat sel darah merah sehingga sel darah merah akan mengendap pada dasar well. Reaksi hambatan aglutinasi negatif ditunjukkan pada well A1-A12 dan B1-B12 serta pada well kontrol G1 dan H1. Hal ini dapat terjadi karena serum kontrol tidak mengandung antibodi spesifik terhadap antigen virus sehingga ketika ditambahkan antigen virus ke dalam well, maka antigen virus akan mengikat sel darah merah dan terjadi aglutinasi sel darah merah. Percobaan ini terbalik antar well uji dan kontrol yang dikarenakan salah komunikasi atau pelabelan.ELISAA. TUJUAN

Mengetahui titer antibodi spefisik (dengan pengenceran tertinggi) terhadap antigen, yang masih memberikan perbedaan bermakna dengan kontrol, melalui pembacaan absorbansi dengan spektrofotometer.B. PENDAHULUAN

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) suatu pemeriksaan untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label). Terdapat 2 Teknik Metode ELISA, yaitu teknik kualitatif, berdasarkan fakta bahwa tiap antibodi berikatan pada antigen yang spesifik. Teknik kuantitatif, berdasarkan jumlah ikatan antigen-antibodi yang ditentukan dengan nilai absorbansi. Teknik ini menggabungkan spesifitas antibody dengan kepekaan uji enzymatis dengan spektrofotometer biasa atau antigen dilekatkan pada enzyme yang mudah ditera. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi.

Ada beberapa type ELISA, yaitu direct ELISA, biasanya digunakan dengan kompetisi dan Inhibisi ELISA, digunakan untuk deteksi antigen. Indirect ELISA, antigen terikat pada plate, digunakan untuk deteksi antibody spesifik terhadap antigen tertentu. Sandwich ELISA, antibodi terikat pada plate, digunakan untuk deteksi antigen. Capture ELISA, antihuman antibodi terikat pada plate, digunakan untuk deteksi antibody.

ELISA sebagai salah satu metode uji serologis mempunyai satu kelebihan yaitu mampu mendeteksi beberapa jenis antibodi dari 1 sampel serum (tergantung dari kit ELISA yang digunakan). ELISA juga memiliki tingkat spesifikasi (yaitu kemampuan mendeteksi ayam yang tidak terinfeksi atau ayam yang tidak terinfeksi dinyatakan negatif) yang tinggi.C. ALAT DAN BAHAN Alat :

1. Micropipet

2. Microplate bentuk V3. SpektrofotometerBahan :

1. Larutan PBS (Phospate Buffer Saline)

2. Antigen Virus H1N1 (protein M)

3. Serum kelinci yang divaksin dengan protein M4. Substrat OPD

5. Larutan Streptavidine-HRP 1/20.000

6. Stop solution 2,5N H2SO4D. LANGKAH KERJA

1. Sediakan mickroplate dengan dasar berbentuk V.2. Pada mikroplate digunakan well A1-A3 dengan pasangan duplonya B1-B3 dan A7-A9 dengan pasangan duplonya B7-B9. Well E1-F3 dengan pasangan duplonya E1-F3 dan E7-E9 dengan pasangan duplonya F7-F9. Melabeli well A dan B untuk konsentrasi antigen 50 g/ml, E dan F untuk konsentrasi antigen 25 g/ml. Well A1-A3 (dan duplonya) untuk antibodi kontrol dan A7-A9 (dan duplonya) untuk antibodi pasca vaksinasi.3. Teteskan antigen dengan konsentrasi 50 g/ml pada well A1-A3 dengan pasangan duplonya B1-B3 dan A7-A9 dengan pasangan duplonya B7-B9.4. Teteskan antigen dengan konsentrasi 25 g/ml pada well E1-E3 dengan pasangan duplonya F1-F3 dan E7-E9 dengan pasangan duplonya F7-F9.

5. Lakukan inkubasi pada suhu 4oC selama 1 malam.6. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween), buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.

7. Masukkan blocking solution 5% skim milk pada setiap well, inkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam.8. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween), buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.

9. Tambahkan 50 l antibodi kontrol pada well A1 B1 E1 F1. Lakukan pengenceran secara delution fold pada well 2 dan 3.10. Tambahkan 50 l antibodi pasca vaksinasi pada well A7 B7 E7 F7. Lakukan pengenceran secara delution fold pada well 2 dan 3.

11. Lakukan inkubasi pada suhu 4oC selama 1 malam.

12. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween), buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.

13. Tambahkan 50 l antibodi kedua (antibodi anti rabbit berlabel biotin 1/1000) pada setiap well.14. Lakukan inkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam.

15. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween), buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.

16. Tambahkan 50 l streptavidine-HRP 1/20.000 ke setiap well.

17. Lakukan inkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam.

18. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween), buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.

19. Tambahkan 50 l substrat OPD

20. Lakukan inkubasi pada suhu ruangan selama 10-15 menit.

21. Tambahkan stop solution 25 l 2,5N H2SO4. Amati perubahan warna yang terjadi.22. Baca absorbansi larutan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm.23. Buat kurva persamaan garis linier, sengan sumbu X titer antibodi dan Y absorbansi.E. HASIL

Hasil absorbansi larutan uji yang mengandung kompleks antigen-antibodi dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm dapat dilihat pada tabel 1 dan 2. Rata-rata hasil absorbansi tertinggi sebesar 1.4745 ditunjukkan pada well A1 B1, yang menggunakan serum positif dan antigen dengan konsentrasi 50 g/ml (Tabel 2). Dari grafik 1, dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan absorbansi sebesar 0,108 (1.4745-1.366) antara serum kontrol dan serum positif, didapatkan pada well dengan pengenceran 1/100 dengan konsentrasi antigen 25 g/ml. Pada well dengan pengenceran 1/100 dengan konsentrasi antigen 50 g/ml berbedaan absorbansi antara serum kontrol dan serum positif sebesar 0,204. Jadi dapat disimpilkan semakin besar pengenceran semakin kecil nilai OD. Pada antigen yang telah ditambah antibodi ternyata memiliki nilai OD yang lebih kecil baik tanpa pengenceran maupun tanpa pengenceran hal ini dikarenakan virus tidak dapat mengikat antigen karena sudah memiliki antibodi terhadap virus tersebut.

Tabel 1. Optical Density

wellkont1 : 251 : 501 : 1001 : 251 : 501 : 100

A1B1A2B2A3B3A7B7A8B8A9B9

50 ng/ml1.4691.4801.5491.4291.4781.3201.1411.1541.0220.9730.8400.777

wellE1F1E2F2E3F3E7F7E8F8E9F9

25 ng/ml1.4421.3111.3331.2411.2271.1630.8040.7500.7590.6360.6310.531

Tabel 2. Optical Density rata-rata

Antigen tanpa antibodi (control)

Antibodi pasca vaksinasi

Antigen 50 g/mlAntigen 25 g/mlAntigen 50 g/mlAntigen 25 g/ml

1 : 251.47451.36651.0880.777

1 : 501.4891.2870.99750.6975

1 : 1001.3991.1950.80850.581

Grafik1. Pengenceran Antibodi terhadap OD 490

dilution fold

1