LAPORAN PRAKTIKUMMIKROBIOLOGI

Acara II DASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGIDisusun oleh :Cindy Laura148114042Harno Parihala148114043Aldo Christian148114044Eko Aprilianto148114045Kelompok Praktikum / Kelas : B / A

Nilai LaporanTanggal dan Paraf Asisten

LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMAYOGYAKARTA2015ACARA IIDASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

A. Tujuan1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media untuk pertumbuhan mikroba.2. Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi.3. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis.4. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.5. Mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecatan/pewarnaan bakteri.6. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam.

B. Tinjauan PustakaMenurut Willey, Sherwood, dan Woolverton (2011) mikroorganisme yang terdapat di alam biasanya bertumbuh dengan kompleks, populasi dari gabungan beberapa spesies. Hal ini yang menyebabkan masalah yang cukup serius bagi ahli mikrobiologi karena tipe tunggal mikroorganisme tidak dapat dipelajari secara tepat dalam kultur gabungan. Ada beberapa cara untuk membuat kultur murni : Streak PlateJika sel mikroorganisme berasal dari gabungan mikroorganisme dapat diisolasi secara spasial dari sel yang lain, maka setiap sel akan membentuk koloninya sendiri secara terpisah. Setiap koloni yang terbentuk merupakan sel tunggal, koloni tersebut menggambarkan kultur murni. Salah satu metode yang digunakan untuk memisahkan sel mikroorganisme yang satu dengan yang lainnya adalah dengan cara Streak Plate. Sel dipindahkan ke media dengan menggunakan jarum inokulasi. Setelah sel berada pada jarum inokulasi jarum digoreskan pada media yang berada pada kuadran 1 dengan menggoreskan secara zig-zag. Selanjutnya mengambil sel mirkoorganisme dari kuadran 1 dan menggoreskannya ke kuadran 2. Ulangi langkah tersebut hingga kuadran 4. Cara ini bertujuan untuk menghasilkan koloni yang terpisah. Spread PlateTeknik spread plate dilakukan dengan mencampurkan mikroorganisme ke dalam cairan tertentu dan setelah itu disebarkan pada media. Penyebaran ke dalam media dibantu dengan menggunakan spreader. Setelah disebarkan diamkan media mengering. Mikroorganisme yang terpisah akan membentuk koloni sendiri. Pour PlatePada teknik pour plate lebih digunakan untuk bakteri, archae dan fungi. Mirkoorganisme pertama kali dilarutkan beberapa kali yang bertujuan untuk mengurangi populasi mirkoorganisme dan mendapatkan koloni terpisah. Mirkoorganisme dimasukan ke dalam media yang sudah dileburkan pada suhu 45C. kemudian media dan mirkoorganisme yang sudah menyatu dimasukan kedalam cawan petri dalam hal ini sampel akan membentuk koloni di permukaan. Ambil mirkoorganisme pada media dengan jarum ose dan suspensikan lagi. Lakukan cara ini sampai beberapa kali agar pada 1 cawan petri hanya terdapat 1 mikroorganisme.Menurut Tortora, Funke, and Case (2010) Kultur media merupakan tempat dimana mirkoorganisme dapat tumbuh karena terdapat materi nutrisi didalamnya. Tidak semua mikroorganisme dapat hidup di semua media, ada juga mikroorganisme yang membutuhkan media khusus agar dapat bertumbuh. Mikroorganisme yang dapat tumbuh dan berkembang biak di dalam media disebut kultur.Media yang paling cocok untuk digunakan dalam penanaman mikroba adalah media agar. Karena media agar memiliki kandungan penting yang membuat media agar merupakan media yang paling cocok untuk mikroba, media dapat menjadi padat ketika ada bakteri yang dapat mendegradasi media agar. Agar memiliki titik leleh pada suhu 100 C.Chemically Defined Media adalah media yang sudah diketahui kandungan kimianya. Untuk bakteri kemoheterotrof media yang digunakan harus mengandung senyawa organik seperti : karbon. Kebanyakan bakteri kemoheterotrof dan fungsi hanya dapat tumbuh pada media kompleks yang terbentuk dari nutrisi termasuk ekstraksi ragi, daging, atau tumbuhan. Dalam media jenis ini energi, karbon, nitrogen dan sulfur yang dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk bertumbuh akan disediakan oleh protein.Menurut Slonczewski and Foster (2009) beberapa hal yang dapat membunuh mikroba, yaitu : Temperature dan Tekanan TinggiPada air yang mendidih mikroorganisme yang hidup akan mati. Namun pada suhu itu spora tidak mati. Mematikan spora dibutuhkan suhu dan tekanan yang cukup tinggi. Pada saat tekanan tinggi titik didih air akan meningkat, dan suhu itu akan mencapai suhu yang dapat mematikan mikroba. Prinsip kerja dari temperatur dan tekanan ini merupakan prinsip kerja dari alat yang bernama autoklaf. Spora akan mati dengan menggunakan autoklaf yang diatur pada suhu 121 C dan tekanan pada 15 dan waktu yang digunakan selama 20 menit. PasteurisasiPada zaman dahulu digunakan untuk menjaga wine dari bakteri. Sekarang digunakan untuk memanaskan makanan pada suhu tertentu. Ini juga dapat digunakan untuk menyembuhkan penyakit yang disebabkan oleh mikroba. DinginBakteri akan terhambat pertumbuhannya jika berada pada suhu yang cukup rendah, dan akan membunuhnya. Pada suhu 4-8 C beberapa mikroorganisme pertumbuhannya akan menjadi lambat sehingga dapat digunakan sebagai pengawet makanan. Kecuali pada bakteri gram positif yang dapat tumbuh pada suhu rendah sekalipun. FiltrasiDengan menggunakan saringan milipore yang berukuran 0,2 m dapat mengihalangkan sel mikroba, tetapi tidak dapat menghilangkan virus. Filtrasi lebih menguntungkan karena tidak merusak matria streril. Tetapi kekurangannya hasil saringan tidak benar-benar steril karena tidak menyaring virus. Microbiology safety cabinet yang memiliki HEPA (High Efficiency Particulate Air) dapat digunakan untuk menyaring udara. Penyinaran Sinar RadiasiPenyinaran dengan sinar UV hanya mensterilkan pada bagian permukaan yang terkena paparan sinar UV saja. Ada bermacam-macam proses penyinaran yaitu : sinar gamma, sinar elektron dan x-rays. Penyinaran tersebut akan merusak DNA dari mikroba dan akan menyebabkan mikroba mati.

Menurut Cappucino and Sherman (2011) sterilitas adalah tanda keberhasilan sebuah pekerjaan di laboratorium mikrobiologi dan sterilisasi adalah proses menjadikan medium atau material bebas dari segala bentuk kehidupan untuk mencapai sterilitas, adalah hal wajib bagi praktikan menggunakan peralatan steril dan teknik aseptis. Tabung kultur kaca dan cawan petri digunakan untuk menanam mikroorganisme. Mikroorganisme harus dipindahkan dari stok kultur ke berbagai media untuk pemeliharaan dan penelitian. Pemindahan yang demikian disebut subkultur dan harus ditangani dengan cara aseptis untuk mencegah kontaminasi. Jarum ose dan needle dibuat dari logam inert seperti platinum dan dimasukkan ke dalam batang logam yang berfungsi sebagai pegangan. Jarum tersebut dapat dengan mudah disterilisasi dengan pemijaran di daerah biru api bunsen.

C. Landasan TeoriMacam-macam organisme yang terdapat di alam bebas disebut kultur gabungan. Kultur gabungan sangat sulit ditentukan karena itu kultur gabungan harus dibuat menjadi kultur murni. Ada berbagai cara untuk membuat kultur murni : Streak PlateTeknik ini menggunakan jarum ose yang telah dimasukan ke dalam kultur murni. Lalu jarum digoreskan pada kuadran pertama pada media, selanjutnya pada saat memulai goresan kedua, bakteri diambil dari kuadran 1. Begitupun selanjutnya pada kuadran selanjutnya. Spread PlateTeknik ini memindahkan bakteri ke tengah-tengah media. Dan selanjutnya disebar secara merata dengan menggunakan spreader, penyebaran dilakukan setelah media memadat. Pour Plate Media dicampurkan dengan kultur murni dengan suhu 45-50 C . setelah dicampurkan cawan petri digoyangkan supaya media tersebut tercampur merata. Tujuan metode ini adalah untuk menentukan sifat dan jumlah sel dalam populasi.

Media yang digunakan pada percobaan mikrobiologi kali ini adalah bahan atau media yang digunakan sebagai tempat menumbuhkan mikroorganisme, selain itu juga digunakan untuk mengembangkan dan mengetahui sifat-sifat dari bakteri itu sendiri. Media yang digunakan juga harus memiliki syarat-syarat media yang baik untuk digunakan dalam mengembangkan mikroorganisme. Syarat-syarat media yang baik antara lain yaitu : mengandung nutrisi yang baik untuk pertumbuhan mikroba lingkungannya ( kondisi pH dan suhu harus sama seperti lingkungan hidup bakteri di alam) media yang digunakan harus steril dan memiliki tingkat kelembapan yang cukup

Pada percobaan kali ini, media yang digunakan adalah agar, karena agar mencair pada suhu yang tinggi, yaitu pada suhu 100c dan setelah media dingin, dapat segera memadat dengan suhu yang sudah mulai dingin. Pada awalnya media yang digunakan adalah gelatin, namun ternyata gelatin dapat tercamar oleh bakteri dan jika demikian maka dapat mengganggu pengamatan.Media agar yang akan digunakan pertama-tama harus disterilkan terlebih dahulu. Metode sterilisasi yang digunakan adalah Metode menggunakan Autoclaf. Dalam Metode ini digunakan temperature yang tinggi yaitu 121c dimana dalam suhu ini bakteri dapat dibunuh, dan juga dengan menggunakan uap yang bertekanan untuk membunuh bakteri pada media dengan cara mengumpulkan protein didalam bakteri itu. Dengan cara seperti ini maka media yang akan digunakan akan steril, dan dengan media yang steril maka bisa menjadi indicator keberhasilan dalam melakukan percobaan ini.Pemindahan mikroba dilakukan dengan teknik aseptis bertujuan untuk meminimalkan kontaminasi dari mikroorganisme. Pemindahan secara aspetis dilakukan dengan cara mengerjakan semua proses didekat lampu bunsen. Dengan adanya lampu Bunsen diharapkan tidak ada mikroorganisme yang berada disekitar yang akan mengganggu pengamatan.

D. Skema Kerja1. Media dan Cara Pembuatan MediaAlat dan Bahan :1. Media Nutrient Agar (NA) Oxoid1. Media Nutrient Agar (NB) Oxoid1. Aquades1. Cawan Petri1. Tabung Reaksi1. Batang Pengaduk1. Pipet Volume1. ErlenmeyerSkema Kerja :Media NA dan NB ditimbang sesuai prosedur

Aquades ditambahkan dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk

Media dipanaskan sampai tercampur homogen

Media NA dan NB dituang dalam tabung reaksi dengan volume tertentu,tutup rapat dengan kapas

Disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit, tekanan 1 atm dan suhu 121C

Media NA dituang dalam cawan petri dan biarkan memadat dan media NB dalam tabung reaksi dibiarkan dingin

1. Teknik-Teknik Pemindahan Kultur MikrobaAlat dan Bahan :1. Media NA miring dalam tabung reaksi1. Media NA tegak dalam tabung reaksi1. Media nutrient cair atau NB dalam tabung reaksi1. Jarum Ose1. Kultur murni bakteri1. Lampu Bunsen1. Jarum Inokulasi1. Vortex MixerSkema Kerja :Tutup masing-masing tabung dilonggarkan (jangan dilepas)

Tabung yang mengandung kultur bakteri E.Coli dipegang ditangan kiri

Jarum Ose dipegang pada tangan kanan dan bakar hingga memijar dimulai dari pangkalnya

Ose dipegang menggunakan ibu jari dan jari telunjuk, gunakan jari kelingking untuk membuka tutup tabung

Mulut tabung dibakar, jarum ose dimasukkan dan 1 ose biakan bakteri diambil

Mulut tabung dibakar kembali dan ditutup

Tabung yang akan diinokulasi diambil dengan tangan kiri, dengan cara yang sama diatas

Biakan bakteri diinokulasi pada tabung reaksi dengan cara goresan zigzag pada permukaan NA yang miring

Mulut tabung reaksi dibakar dan tutup kembali, kemudian ose dibakar

Diberi label : tanggal percobaan , nama bakteri , teknik pemindahan dan nama kelompok

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya

Lakukan hal yang sama untuk media nutrient cair1. Teknik-Teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba1. Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar)Alat dan Bahan:1. Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky1. Pipet Volume1. Lampu Bunsen1. Media NA dalam cawan petri1. Kultur murni bakteri1. Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)Skema Kerja:10-1 - 10-6 dari kultur murni bakteri diencerkan dengan larutan pengencer

Tabung reaksi yang mengandung kultur murni diambil, dibuka dan dibakar leher tabung

0,1 ml kultur bakteri dipindahkan ke permukaan media NA secara aseptis

Spreader dicelupkan kedalam alcohol lalu dibakar dan dibiarkan mendingin

Dengan Spreader kultur bakteri disebarkan secara merata dan dibiarkan mengering

Setelah kering diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar

Perubahan yang terjadi diamati1. Pour Plate Method (Cara Tabur)Alat dan Bahan:1. Media NA dalam tabung reaksi (Hasil percobaan 1)1. Cawan Petri Steril1. Kultur Murni Bakteri1. Pipet Volume1. Lampu BunsenSkema Kerja :Media NA didinginkan dalam tabung reaksi sampai suhu 45-50C

Tutup tabung yang mengandung kultur bakteri dibuka dan mulut tabung dibakar

1 ml kultur murni bakteri dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang mengandung NA secara aseptis

Leher tabung dibakar diatas Bunsen dan media NA yang mengandung kultur murni mikroba dituangkan ke dalam cawan petri

Digoyang perlahan agar media dan kultur murni bercampur homogeny dan memadat

Diinkubasikan secara terbalik selama 24 jam dan dilakukan setelah media memadat

Diamati pertumbuhannya1. Streak Plate Method ( Cara Gores )Alat dan Bahan :1. Media NA dalam cawan petri1. Kultur murni bakteri1. Jarum Ose1. Lampu BunsenSkema Kerja:Jarum Ose dipanaskan hingga memijar di atas Bunsen dan dibiarkan mendingin

1 ose kultur murni diambil dan digoreskan pada permukaan media agar dimulai dari ujung dalam

Ose dipijarkan diatas Bunsen dan dibiarkan dingin setiap kali menggoreskan Ose untuk kuadran berikutnya

Diinkubasi secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam

Diamati perubahannya

1. Pembuatan Pulasan BakteriAlat dan Bahan:1. Gelas Benda1. Jarum Ose 1. Lampu Bunsen 1. Label Preparat1. Aquades Steril1. Kultur Murni Bakteri1. Penjepit Gelas BendaSkema Kerja :Gelas benda yang kering dan bersih dilabeli

Jarum Ose dipijarkan diatas Bunsen

Jika kultur dalam bentuk cair, diambil 1 ose penuh dan diletakkan ditengah-tengah gelas benda

Jika kultur dalam media padat, diambil dengan jarum ose satu bagian kecil kultur dan diletakkan ditengah-tengah gelas benda (sebelumnya sudah diberi aquades steril)

Dibiarkan mengering dengan mengangin-anginkan gelas benda

Pulasan bakteri difiksasi diatas nyala Bunsen (Jangan terlalu kering/gosong)

Pulasan bakteri siap untuk dicat/diwarnai 1. Pengenalan Mikroba di AlamAlat dan Bahan :1. Cotton Bud1. Cawan NA1. Aquades Steril1. SpidolSkema Kerja :Cawan petri berisi NA dibagi menjadi 4 bagian

Cotton bud dibasahkan kemudian diambil mikroba dari tempat-tempat yang memungkinkan terdapat mikroba dan diinokulasi dalam cawan petri

Diinkubasi secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam

Diamati pertumbuhannya

E. Hasil PengamatanSpread Plate

BPW 10-1Spread Plate

BPW 10-2

Spread Plate

BPW 10-3Spread Plate

BPW 10-4

Spread Plate

BPW 10-5Spread Plate

BPW 10-6

Streak Plate

Pour Plate

Mikroba Alam

NA tegak

NA miring

NB steril

NB tidak steril

F. Pembahasan1. Media dan Cara Pembuatan MediaTujuan praktikum kali ini adalah mengetahui cara-cara pembuatan media dan syarat-syarat media sebagai tempat untuk pertumbuhan bakteri. Pada praktikum ini, media yang digunakan adalah NA / Nutrient Agar (Oxoid) dan NB / Nutrient Broth (Oxoid). Komposisi dari NB adalah lab lemco powder (1g), natrium chlorida (5g), yeast extract (2g), dan epton (5g) ; sedangkan komposisi dari NA adalah agar (15g), lab lemco powder (1g), natrium chlorida (5g), yeast extract (2g), dan epton (5g). Media sendiri merupakan tempat/ bahan yang digunakan untuk tempat menumbuhkan mikroba yang terdiri dari nutrisi-nutrisi yang penting yang dibutuhkan bakteri untuk hidup.Pertama yang dilakukan adalah pembuatan media padat (NA/Nutrient Agar). Langkah pertama yaitu penimbangan 2,8 g NA dari NA 28 g/L. Dengan perhitungan :NA = 28 g/L

x = 2,8 gSetelah NA 2,8 g dilarutkan dalam 100 ml aquadest di dalam Erlenmeyer, larutan tersebut dihomogenkan sekaligus dipanaskan diatas penangas/hot plate dengan stirrer. Proses ini dibiarkan berjalan hingga campuran berwarna kuning jernih agar mempermudah proses pengamatan mikroba. Pada saat proses menghomogenkan, larutan jangan sampai berbuih hingga meluap, karena akan mengganggu proses pengamatan mikroba. Setelah homogen, campuran dipindahkan ke 3 tabung reaksi, yang pertama 10 ml untuk metode pour plate, 5 ml untuk NA miring, dan 10 ml untuk NA tegak. Sisanya dibiarkan tetap di Erlenmeyer.Selanjutnya adalah pembuatan media cair (NB/Nutrient Broth). Sama seperti pembuatan NA, NB ditimbang sebanyak 0,65 g dari NB 13 g/L. Dengan perhitungan :

NB = 13 g/L

x = 0,65 gSetelah ditimbang, NB 0,65 g dimasukkan ke Erlenmeyer dan dilarutkan dalam 50 ml aquadest. Setelah itu campuran dihomogenkan diatas hot plate dengan stirrer, tanpa dipanasi. Setelah tercampur homogeny, campuran tersebut dimasukkan ke tabung reaksi masing-masing 8 ml sebanyak 6 tabung. Kegunaan media NB sendiri adalah untuk mengetahui pergerakkan bakteri dan untuk mengetahui kebutuhan bakteri akan O2.Proses selanjutnya yaitu proses sterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Prinsip kerja autoklaf adalah mensterilisasi dengan uap panas bertekanan 1 atm dan suhu 121oC selama kurang lebih 15 menit. Karena menggunakan uap panas bertekanan tinggi maka tutup tabung reaksi agak dilonggarkan agar uap air dapat masuk ke dalam tabung reaksi.Syarat-syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah susunan makanannya (yang harus mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat/metabolism, mengandung sumber karbon, mineral, vitamin, dan gas), tekanan osmose yang isotonic, pH netral atau alkali, temperature sesuai, dan steril.Setelah proses sterilisasi selesai, media ditaruh sesuai dengan bentuk media yang diinginkan. NA 5 ml diletakkan miring untuk media miring yang berfungsi untuk menyetok bakteri karena permukaannya luas. NA 10 ml diletakkan tegal untuk mendapatkan media tegak yang berfungsi untuk menanam bakteri dengan melihat pergerakkannya di dalam medianya, di atas, atau di dasar media, dan media NA 15 ml dituangkan pada masing-masing cawan petri. Sedangkan media NB diletakkan d rak tabung reaksi.

2. SterilisasiSterilisasi adalah upaya untuk membebaskan alat dan bahan dari kontaminasi lingkungan luar sehingga bakteri-bakteri dari luar tidak akan mencemari bakteri yang digunakan dalam percobaan. Berbeda dengan aseptis, aseptis meruapakan usaha untuk meminimalisir terjadinya kontaminasi sehingga aseptis belum sebersih steril.Sterilisasi dibagi menjadi 3, yaitu :a. Sterilisasi dengan menggunakan panas (fisik) Udara panas kering (dry heat) : menggunakan oven, biasanya untuk sterilisasi alat-alat seperti cawan petri dan tabung reaksi. Biasanya menggunakan suhu 160-180C. Udara panas lembab (moist heat) : mengggunakan uap bertekanan tinggi, biasanya pada suhu 121C dan menggunakan autoklaf. Pemijaran : mensterilkan alat-alat besi seperti jarum ose, needle, batang bengkok besi, dll. Pemijaran dilakukan sampai alat berwarna merah bara dari pangkal ke ujung.b. Sterilisasi penyaringan : dilakukan pada bahan-bahan yang tidak tahan panas. Membutuhkan filter khusus untuk membebaskan media dari bakteri.c. Sterilisasi dengan bahan kimia : dilakukan pada alat yang tidak tahan panas, biasanya menggunakan etanol. Contohnya adalah batang pengaduk kaca.Prinsip kerja autoklaf dengan menggunakan tekanan yang ditimbulkan uap air yang bersuhu kira-kira 121C selama waktu yang ditentukan (biasanya 15 menit). Uap-uap panas yang dihasilkan akan masuk melalui tutup tabung reaksi yang kendur dan akan mendenaturasi protein pada bakteri, sehingga bakteri-bakteri yang berada di dalam akan mati.Dalam praktikum ini, sterilisasi yang digunakan yaitu dengan pemijaran pada bunsen terhadap jarum ose, neddle, dan tutup tabung, lalu sterilisasi dengan menggunakan bahan kimia alkohol terhadap batang bengkok/spreader, dan yang terakhir sterilisasi dengan autoklaf guna menghilangkan kontaminasi di awal dan pembersihan alat-alat dari media yang terdapat bakteri di dalamnya.

3. Teknik-Teknik Pemindahan MikrobaAgar dapat mengidentifikasi mikroba, maka diperlukan pemindahan mikroba. Mikroba yang digunakan dalam praktikum adalah bakteri Escherichia coli. Bakteri E. coli merupakan bakteri gram negatif. Klasifikasi bakteri tersebut adalah :Domain:Bacteria

Filum:Proteobacteria

Kelas:Gammaproteobacteria

Ordo:Enterobacteriales

Famili:Enterobacteriaceae

Genus:Escherichia

Spesies:E. coli

Pada umumnya, bakteri ini dapat ditemukan dalamusus besarmanusia. KebanyakanE. Colitidak berbahaya, tetapi beberapa, sepertiE. ColitipeO157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada manusia yaitudiareberdarah karenaeksotoksinyang dihasilkan bernamaverotoksin. E. Coliyang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan memproduksivitamin K2, atau dengan mencegah bakteri lain di dalam usus. Morfologi dan ciri-ciri pembeda Escherichia coli yaitu:(1) merupakan batang gram negative, (2) terdapat tunggal, berpasangan, dan dalam rantai pendek, (3) biasanya tidak berkapsul, (4) tidak berspora, (5) motil atau tidak motil, peritrikus, (6) aerobik, anaerobik fakultatif, (7) penghuni normal usus, seringkali menyebabkan infeksi.Pemindahan mikroba pada praktikum kali ini bermacam-macam, yaitu :1. Media Nutrient Agar miring (NA miring)NA miring dibuat dengan tujuan memperluas permukaan media sehingga dapat juga digunakan untuk menyetok bakteri pada permukaan media tersebut. Mikroba dipindahkan dengan menggunakan jarum ose yang sudah dipijarkan pada api bunsen. Proses pemindahannya juga harus aseptis, yang berarti harus berdekatan dengan nyala api bunsen. Mikroba pada jarum ose dipindahkan ke media dengan cara goresan pada permukaan dari bawah tabung naik ke atas. Penggoresan dengan zig-zag dilakukan agar meperluas daerah pertumbuhan mikroba. Setelah 24 jam didapati mikroba tumbuh mengikuti jalur zig-zag dan berwarna keruh. Berbentuk spreading, dengan pertumbuhan mikroba beberapa millimeter di sekitar bekas inokulasi.NA miring yang praktikan buat gagal, media NA tidak dapat memadat. Hal ini dikarenakan media NA dalam tabung reaksi tidak homogen. Seharusnya setelah media ditimbang dan dilarutkan dalam aquadest, dihomogenkan dengan menggunakan hot plate stirrer kemudian sambil digoyang pelan-pelan dipindahkan ke tabung reaksi sehingga media NA homogen.2. Media Nutrient Agar tegak (NA tegak)Mikroba pada kali ini dipindahkan dengan jarum inokulasi/needle yang telah dipijarkan pada api bunsen. Kemudian mikroba pada jarum inokulasi dipindahkan dengan cara ditusuk ke media. Mikroba yang akan dipindahkan ditusuk dibagian tengah media agar daerah untuk mencari nutrisi mikroba lebih luas. Karena apabila ditusuk dibagian dasar, pertumbuhan mikroba akan mengumpul di dasar dan praktikan tidak dapat melihat bentuk pertumbuhan mikroba. Tujuan menggunakan NA tegak adalah untuk mengamati morfologi mikroba. Selain itu NA tegak juga bertujuan untuk mengetahui pergerakkan mikroba berdasarkan oksigennya. Bila mikroba tersebut merupakan bakteri aerob maka pertumbuhan bakteri akan di atas permukaan karena membutuhkan oksigen, bila mikroba merupakan bakteri anaerob maka pertumbuhannya akan di dasar karena tidak memerlukan oksigen, dan fakultatif bila pergerakannya diantara aerob dan anaerob atau kedua-duanya. Bakteri yang praktikan amati bersifat fakultatif karena tumbuh di atas dan di tengah media dan berbentuk echinulate, dimana pertumbuhannya di sepanjang bekas inokulasi bergerigi/berbintik-bintik.3. Media Nutrient Cair (NB)Pembuatan NB bertujuan untuk membedakan media yang steril dan tidak steril. Oleh karena itu, pembuatan NB dibagi menjadi dua yaitu NB steril dan NB tidak steril. NB steril disterilkan dengan dimasukkan ke dalam autoklaf dan NB tidak steril tidak dimasukkan ke dalam autoklaf. Pemindahan mikroba dilakukan dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan dengan api bunsen. Mikroba ditusukkan di bagian tengah media NB tidak steril. Sehingga didapati dalam media NB steril tidak terdapat pertumbuhan bakteri dan di dalam media NB tidak steril terdapat pertumbuhan bakteri yang ditandai dengan munculnya warna keruh di permukaan media NB tidak steril.

4. Teknik-Teknik Isolasi atau Penanaman MikrobaTujuan dilakukannya isolasi mikroba adalah untuk memisahkan mikroba dari kultur murninya untuk ditanam pada media tertentu. Proses ini harus dilakukan secara aseptis sehingga harus dilakukan di dekat nyala api bunsen.Teknik pengisolasian mikroba dibagi menjadi 3 metode atau cara, yaitu :1. Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar)Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. Dalam percobaan kali ini dilakukan pengenceran pada kultur bakteri karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikroba yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung. Pengenceran dilakukan dengan pengambilan 1 ml dari kultur murni bakteri sehingga didapat 10-1 hingga seterusnya mencapai pengenceran 10-6, digunakan BPW (Buffer Pepton Water) untuk pengenceran tersebut. Setelah pengenceran, hasil yang didapatkan pengenceran 10-1 masih banyak koloni-koloni dan semakin menuju pengenceran 10-6 semakin sedikit koloninya.Kelebihan metode spread plate adalah dapat membandingkan koloni bakteri antara 1 konsentrasi denan konsentrasi lainnya. Sedangkan kekurangannya adalah apabila penggunaan spreader terlalu kuat dapat merusak media agar dan mempersulit pengamatan.2. Pour Plate Method (Cara Tabur)Teknik pour plate ini dilakukan pada media yang sedang berproses menuju padatan pada suku kira-kira 45-50 C setelah disterilisasi pada autoklaf. Mikroba sebanyak 1 ml dituang ke media kemudian dihomogenkan dengan cara digoyang secara perlahan dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang dilakukan secara aseptis yaitu dilakukan di dekat nyala api bunsen. Tujuan dilakukan metode ini adalah untuk mengidentifikasi sifat bakteri. Perbedaan dari spread plate dan pour plate adalah pada spread plate bakteri diinokulasikan pada permukaan media saja, sedangkan pada pour plate bakteri dan media dihomogenkan. Kelebihan metode pour plate adalah didapatkan daerah sebaran mikroba yang merata, sedangkan kerugiannya adalah apabila penggojokan kultur bakteri dan media NA terlambat dapat menyebabkan koloni sukar menyebar.Metode pour plate yang praktikan buat gagal, media NA tidak memadat. Hal ini dikarenakan media NA dalam tabung reaksi tidak homogen. Seharusnya setelah media ditimbang dan dilarutkan dalam aquadest, dihomogenkan dengan menggunakan hot plate stirrer kemudian sambil digoyang pelan-pelan dipindahkan ke tabung reaksi sehingga media NA homogen. Juga penggojokan kultur bakteri dengan media NA sedikit terlambat.3. Streak Plate Method (Cara Gores)Tujuan dari metode streak plate adalah untuk mengisolasi koloni mikroba pada media agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Kelebihan metode streak plate adalah untuk mendapatkan koloni bakteri yang terpisah secara jelas, sedangkan kekurangannya adalah harus dilakukan dengan hati-hati dalam menggoreskan ose pada media karena dapat merusak media agar dengan tekanan yang kuat.Metode ini menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan dengan api bunsen. Cawan petri yang digunakan dibagi menjadi 3 kuadran. Kuadran I adalah bagian cawan, kuadran II adalah bagian cawan dan kuadran III juga merupakan bagian cawan.

5. Pembuatan Pulasan BakteriBakteri atau mikroba lainnya dpaat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa pewarnaan/pengecatan. Pengamatan tanpa pengecatan lebih sukar dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti karena sel bakteri atau mikroba lainnya transparan atau semi transparan. Dengan dilakukannya pengecatan, dapat dilihat struktur sel mikroba lebih seksama.Pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pengecatan. Hasil pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor tingkat pengecatan. Hasil pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu : fiksasi, substrat, dekolorisator dan sebagainya. Tujuan dilakukannya fiksasi adalah meregangkan sel bakteri sehingga memudahkan dalam penglihatan setelah pengecatan, membantu pelekatan bakteri di atas gelas benda, dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya, dan mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel.Cara fiksasi yang dilakukan adalah menggunakan gelas benda yang kering dan bersih serta menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan dengan api bunsen kemudian didinginkan. Diambil 1 ose bakteri dan diletakkan di tengah-tengah gelas benda. Pulasan bakteri tersebut kemudian difiksasi dengan melewatkannya di atas nyala bunsen, sehingga pulasan bakteri siap untuk diwarnai/dicat.

6. Pengenalan Mikroba di AlamTerdapat bermacam-macam bakteri di alam sekitar kita. Pengenalan mikroba ini bertujuan untuk mengetahui dan mengenali mikroba-mikroba di alam. Sampel pada percobaan kali ini diambil dari hidung, telinga, muktosa mulut, dan kotoran lebah. Caranya yaitu dengan menggunakan cotton bud. Setelah itu, cotton bud dengan sampel tersebut dioleskan pada media NA yang telah dibagi menjadi 4 kuadran. Kuadran 1 berisi sampel dari hidung, kuadran II berisi sampel dari telinga, kuadran III berisi sampel dari muktosa mulut, dan pada kuadran IV berisi sampel dari kotoran lebah. Setelah 24 jam didapati pada kuadran 1, 2, dan 4 terdapat sedikit bakteri, sedangkan pada kuadran 3 terdapat banyak bakteri. Sampel pada kuadran III yang digunakan terdapat banyak bakteri karena muktosa mulut tersebut merupakan muktosa mulut praktikan yang sedang mengalami sakit.

G. Kesimpulan1. Media adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme yang terdiri atas nutrisi / zat zat makanan yang dibutuhkan mikroba. Dalam praktikum ini digunakan media NA (padat) dan NB (cair).2. Syarat-syarat media untuk pertumbuhan mikroba adalah:- lingkungan kehidupan sesuai dengan lingkungan pertumbuhan mikroba dalam hal susunan makanan tekanan osmotik yang isotonik ph yang netral temperatur yang seuai dan steril3. Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat dan bahan dari segala macam bentuk kehidupan,terutama mikroorganisme.4. Teknik pemindahan mikroba pada NA miring dan NB cair menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan. Sedangkan NA tegak digunakan jarum inokulasi yang telah dipijarkan juga. Saat pemindahan dan penanaman mikroba dilakukan di dekat api Bunsen (aseptis) agar tidak terdapat kontaminan.5. Teknik isolasi dan penanaman mikroba terdapat 3 macam, yaitu : Spread plate, Pour plate, dan Streak plate.6. Di alam terdapat banyak mikroba seperti di mukosa mulut, kotoran lebah, telinga, dan hidung.

H. Daftar PustakaCappuccino, J. G., and Sherman, N., 2011, Microbiology A Laboratory Manual, 9th edition, Pearson Education Inc., San Francisco, pp. 3-6.Madigan, T. M., Martinko, M. J., Dunlap, V. P., and Clark, P. D., 2009, Biology of Microorganisms, 12th edition, Pearson Education Inc., San Francisco, pp. 154-155, 780-786.Slonczewski, J. L., and Foster, J. W., 2009, Microbiology An Envolving Science, 2th edition, W. W. Norton, New York, pp. 146-151.Tortora, J. G., Funke, R. B., and Case, L. C., 2010, Microbiology An Introduction, 10th edition, Pearson Education Inc., San Francisco, pp. 8, 164-167, 170, 174-176, 186, 188-191.Willey, M. J., Sherwood, M. L., and Woolverton, J. C., 2011, Prescotts Microbiology, 8th edition, McGraw-Hill, New York, pp. 146-151.

I. Jawaban Pertanyaan0. Fungsi agar pada media pertumbuhan yaitu sebagai nutrisi dan sumber energi bagi mikroorganisme, tempat mikroba untuk berkembang biak, tempa yang efektif bagi manusia untuk membiakan kultur murni dari mikroba tertentu, untuk isolasi, pengujian sifat mikroba, serta untuk memadatkan media.0. Pada waktu inkubasi cawan petri harus diletakan secara terbalik karena untuk menghindari tetes uap air yang menetes pada media, yang dapat menggangu pertumbuhan bakteri.0. A. Streak plate :Prinsip : Menggoreskan kultur mikroba pada permukaan media agar NATujuan : Untuk mendapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murniB. Pour plate:Prinsip : Menginokulasikan kultur mikroba pada media agar NA yang cairTujuan : Untuk memperoleh koloni bakteri yang terbesar dan menentukan kebutuhan bakteri dan O2C.Spread plate :Prinsip : Menyebarkan kultur mikroba pada media agar Na, menggunakan metode pengenceran.Tujuan : Untuk mendapatkan koloni bakteri koloni bakteri, yang dapat dihitung jumlahnya.0. Kultur murni / biakan adalah biakan mikroba yang terdiri dari 1 spesies mikroba dan merupakan perbanyakan dari 1 sel mikroba.0. Teknik penggoresan yang benar pada streak plate adalah dengan menggunakan jarum ose yang sebelumnya telah disterilkan dengan cara pemijaran. Penggoresan dilakukan secara zig-zag dan diusahakan agar jarum ose tidak merusak/merobek media, melainkan hanya menyentuh permukaan media saja. Dalam metode streak plate dibuat 3 kuadran, setiap akan berpindah ke kuadran berikutnya, jarum ose harus disterilkan terlebih dahulu dengan pemijaran. Untuk membuat kuadran II dilakukan dengan melanjutkan akhir goresan pada kuadran I, begitu pula seterusnya. Penggoresan diusahakan tidak bertumpuk agar didapatkan koloni terpisah.1. Fiksasi dilakukan dalam pengecatan bakteri saat pembuatan pulasan bakteri yng siap diwarnai. Tujuan fiksasi adalah 5. Melekatkan sel mikroba dengan cepat tanpa merusak bentuk dan struktur sel5. Meningkatkan afinitas sel akan cat5. Mencegah otolisis sel5. Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel

Yogyakarta, 12 Maret 2015 Praktikan

Cindy LauraHarno Parihala Aldo Christian Eko Aprilianto

J. Lampiran