Laporan PraktikumHari/ Tanggal: Kamis/ 04 Desember 2014BioinformatikaWaktu: 09.00-11.00PJP: Dr Laksmi Ambarsari MSAsisten: Asep Didi Suryadi M. Maftuchin S Rini Kurniasih

PRIMER DESIGN DAN MULTIPLE SEQUENCE ALIGNMENT

Kathirina B Riwu Wolo G841110021Desi AmaliawatiG84110037

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR2014

PENDAHULUANBioinformatika adalah organisasi dan analisis komplek data yang dihasilkan dari analisa molekuler dan teknik biokimia, disamping itu bioinformatika merupakan teknologi untuk koleksi, peyimpanan analisis, interprestasi, pelepasan dan aplikasi untuk informasi biologi. Analisis dilakukan dengan cara membandingkan data yang masuk dengan ribuan data lain yang tersedia di dalam pangkalan data. Suatu urutan DNA ataupun asam amino dari hasil sekuensing dapat diketahui kemiripannya dengan urutan yang tersimpan dalam data base melalui teknik bioinformatik. Bahkan dari urutan DNA maupun asam amino yang ada, dapat diprediksikan peran proteinnya, tingkat aktivitas dan mekanisme kerjanya menggunakan berbagai jenis perangkat lunak yang tersedia. Selain itu, dengan bioinformatik perancang primer untuk mendeteksi keberadaan suatu gen dari spesies tertentu dapat dilakukan (Krane dan Raymer 2003). Bioinformatika juga menerjemahkan penemuan ke klinik dengan menyebarkan penemuan melalui curated, database dicari seperti Pharm GKB, dbGaP, PacDB dan FDAAERS. Sebuah hambatan utama bagi database ini adalah kurasi manual data. Secara biologis dan secara medis fokus pada teks penambahan algoritma yang dapat mempercepat koleksi data terstruktur, seperti metode yang menggunakan sintaks kalimat dan pengolahan bahasa alami untuk mendapatkan obat-gen dan gen-gen interaksi dari literatur ilmiah. Database dan metode ini perlu dikembangkan dan digunakan dengan hati-hati. Semua sumber-sumber data yang rentan terhadap kesalahan dan sehingga validasi data sangat penting, terutama sebelum informasi tersebut diterapkan di klinik (Mount 2001).Gen yang dianalisis pada praktikum ini adalah gen p53 yang diperoleh dari individu Mus musculus baik yang mutan maupun yang tidak mutan. Gen p53 adalah tumor suppressor gene yang sering termutasi pada kanker manusia. Hilangnya fungsi G1-S checkpoint menjadi hallmark dari kanker dengan mutasi pada p53 (Gambar 1).

Gambar 1 Peranan gen p53Praktikum ini bertujuan mendesain primer heterologus yang spesifik untuk mengamplifikasi fragmen ataupun full length dari suatu gen baik secara manual maupun dengan menggunakan program. Selain itu pula melatih untuk mencari domain atau daerah terkonservasi menggunakan multiple sequence alignment.

METODE PRAKTIKUMPraktikum Primer Design dan Multiple Sequence Aligment ini dilaksanakan di Ruang Kelas C9-C10, Fakultas Peternakan IPB, pada tanggal 4 Desember 2014 pukul 09.00-11.00 WIB. Alat Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah laptop, flashdrive, modem. Prosedur PercobaanPencarian daerah terkonservasi dari suatu gen. Untuk mendapatkan sekuen-sekuen yang homolog dari genp53 akan dilakukan dari situs NCBI, dipilih analisis blastn. Dari hasil blast dipilih beberapa sekuen yang menunjukkan homolohi cukup tinggi dengan query (nilai bit score tinggi) dan diklik pada accession numbernya. Sekuen yang merupakan full length CDS dipilih. Display diubah ke dalam bentuk FASTA kemudian sekuen di copy ke file baru di Notepad. Setelah itu, dibuka program Multiple sequence alignment ClustalW dan dimasukkan set sekuen dari Notepad dengan cara copy dan paste ke box input sequence. File sekuen juga dapat diunduh secara langsung dari situs NCBI. Daerah yang menunjukkan homologi sekuen yang tinggi diantara seluruh sekuen yang disebut daerah terkonservasi pada hasil alignment diperhatikan, diambil lalu di copy dan paste ke Notepad dan disimpan. Sekuen tersebut akan menjadi basis sekuen untuk mendesain primer heterologus spesifik untuk mengamplifikasi gen p53.Pendesainan primer secara manual. Sekuen Open Reading Frame dari gen p53 pada Mus musculus dan daerah terkonservasi diberikan. Masing-masing sekuen tersebut didesain sepasang primer (forward dan reverse) dengan ketentuan di buku penuntun praktikum. Kemudian ditentukan sekuen kedua pasang primer beserta suhu annealingnya. Hasil desain primer yang dilakukan secara manual dibandingkan dengan yang didesain menggunakan program komputer. Untuk mencari sekuen reverse complement primer dapat menggunakan program (http://www.bioinformatics.org/SMS/rev_comp.html).Pendesainan primer menggunakan program komputer. Pertama-tama dibuka situs program Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/) kemudian sekuen target dicopy pada box input sequence. Parameter yang diinginkan dipilih atau dapat diikuti default yang ada di program apabila sesuai kecuali mungkin ukuran produk PCR yang diinginkan, dipilih salah satu dari beberapa pilihan yang disediakan. Kemudian diklik pick primer. Akan tampak beberapa pilihan primer forward dan reverse, lalu dipilihlah yang terbaik.Analisis gen/protein family dengan multiple sequence alignment. Satu set sekuen protein dari bZIP transcription factor pada beberapa tanaman diberikan pada buku penuntun praktikum. Kemudian dicoba untuk melakukan multiple sequence alignment dengan menggunakan ClustalW atay ClustalX. Output dari alignment sekuen bZIP tersebut diperhatikan protein domain atau motif yang terkonservasi dari transcription factor bZIP dan perbedaan antara daerah terkonservasi antarspesies maupun satu spesies tanaman.

HASIL DAN PEMBAHASANSekuen sebagian digunakan untuk menemukan potensi homolog yang akan digunakan untuk menduga fungsi dari query sekuen yang merupakan target sekuen yang dibutuhkan untuk menganalisis atau untuk membantu dalam permodelan pada struktur 3 dimensi.Setelah informasi terkumpul dalam database, langkah berikutnya adalah menganalisa data. Pencarian database umumnya berdasar hasil alignment/pensejajaran sekuen, baik sekuen DNA maupun protein. Metode ini digunakan berdasar kenyataan bahwa sekuen DNA/protein bisa berbeda sedikit tetapi memiliki fungsi yang sama. Salah satu perangkat lunak yang digunakan untuk melakukan alignment terhadap sekuen terbatas di antaranya yang lazim digunakan adalah CLUSTAL dan CLUSTAL W.Clustal adalah program bioinformatrika untuk alignment multiple ( multiple aligment) yaitu aligment beberapa sekuens sekaligus. Dua varian utama clustal adalah clustal W dan clustal X.

Gambar 1 Tampilan ClustalW

Gambar 2 Daerah terkonservasi hasil aligment menggunakan clustalWClustal W adalah suatu program umum yang bertujuan untuk sekuensing alignment ganda. Langkah selanjutnya yaitu menganalisis sekuens asam amino menggunakan program ClustalX2.1, pada gambar 3 diperoleh daerah terkonservasi yang ditandai dengan tanda bintang *, daerah terkonservasi dapat digunakan sebagai primer untuk ketiga sekuens tersebut, daerah terkonservasi pada analisis ini cukup panjang, hal ini disebabkan karena sekuens yang didapat diperoleh dari gen p53, namun dengan mutasi dan tanpa mutasi yang dibandingkan

Gambar 3 Sekuens nukleotida gen p53Primer juga dapat didesain secara manual menggunakan ORF dan dihitung nilai tm.

Gambar 4 Pencarian reverse complement Desain primer secara manualtm= 4(G+c) + 2(A+T)= 4(7)+ 2(3)= 28 + 6= 34Disain primer dapat menggunakan program dari PRIMER3 yang dapat diakses melalui internet. PRIMER3 merupakan program untuk perancangan primer. Primer berfungsi sebagai penginisiasi reaksi polimerisasi DNA secara in vitro, karena tanpa primer, reaksi polimerisasi DNA tidak akan terjadi meskipun enzim dan komponen lainnya sudah tersedia. Selain itu primer juga berfungsi untuk membatasi daerah mana yang akan diamplifikasi pada reaksi PCR. Tahap-tahap dalam merancang primer denagn mentukan tujuan, menyiapkan sekuens referensi, dan bisa di desain dengan batuan software. Perancangan primer menggunakan software PRIMER 3 dengan memeprhatikan parameter untuk masing-masing primer sebagai berikut. Panjang primer Secara umum disepakati bahwa panjang primer PCR yang optimal adalah 18-22 bp. Panjang ini cukup panjang untuk mencapai spesifisitas yang cukup, dan cukup pendek bagi primer untuk terikat dengan mudah pada DNA template pada suhu annealing-nya.Suhu leleh atau melting temperature (Tm) adalah temperatur dimana setengah dari duplex DNA akan terpisah menjadi utas tunggal dan Tm juga mengindikasikan stabilitas duplex. Hasil terbaik biasanya diperoleh jika primer memiliki Tm 52-58 C. Primer dengan nilai Tm di atas 65 C memiliki kecenderungan untuk terjadinya annealing sekunder. Nilai Tm bisa diindikasikan dari GC content dan dapat dihitung secara akurat menggunakan rumus-rumus tertentu. Nilai Temperatur Leleh (Tm) merupakan estimasi stabilitas hibrid DNA-DNA dan penting untuk menentukan suhu annealing. Jika Ta terlalu tinggi maka akan menyebabkan hibridisasi primer-template yang kurang baik sehingga yield produk PCR pun akan rendah. Sebaliknya jika Ta terlalu rendah maka bisa menyebabkan banyaknya produk-produk non-spesifik karena akan terjadi banyak mismatch yang menurunkan spesifisitas PCR.Clustal juga merupakan program bioinformatika untuk alignment multipel (multiple alignment), yaitu alignment beberapa sekuens sekaligus. Dua varian utama Clustal adalah ClustalW dan ClustalX. Metode lain yang dapat diterapkan untuk alignment sekuens adalah metode yang berhubungan dengan Hidden Markov Model ("Model Markov Tersembunyi", HMM). HMM merupakan model statistika yang mulanya digunakan dalam ilmu komputer untuk mengenali pembicaraan manusia (speech recognition). Selain digunakan untuk alignment, HMM juga digunakan dalam metode-metode analisis sekuens lainnya, seperti prediksi daerah pengkode protein dalam genom dan prediksi struktur sekunder protein. Berikut adalah out out dari analisis primer menggunakan program primer3 pada sekuens Mus musculus mutant p53 mRNA, Mus musculus p53 mRNA, dan Mus musculus tumor supresor p53 mRNA (Gambar 5).

Gambar 5 Output dari program primer3

Gambar 5 (lanjutan) Out put dari program primer3

Gambar 5 (lanjutan) Out put dari program primer3Berdasarkan hasil analisis yang diperoleh maka ditentukan primer yang digunakan yaitu left primer CACGTACTCTCCTCCCCTCA, right primer ATTCCTTCCACCCGGATAC dengan produk yang memiliki ukuran 229bp, pemilihan primer ini didasari oleh jumlah GC yang lebih sedikit dibandingkan dengan primer 1, 2, dan 3.

SIMPULANprimer dapat didesain secara otomatis mneggunakan program komputer maupun secara manual.DAFTAR PUSTAKAKrane, DE dan ML Raymer. 2003.Fundamental Concepts of Bioinformatics. San Francisco: Benjamin Cummings.Mount, DW. 2001.Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press