Putri Rahayu

P27834113044

D4 Analis Kesehatan

TUGAS BAKTERIOLOGIA. Identifikasi Bakteri Secara Umum

1. Menyiapkan Alat dan Bahan

2. Menyiapkan sampel (Darah, Sputum, Feses, Rectal Swab, Nanah, atau Biopsi

Jaringan)

3. Menanam sampel pada media pemupuk

Media Pemupuk atau media diperkaya adalah media yang digunakan untuk

memperbanyak / menumbuhkan bakteri menjadi lebih banyak. Media ini bersifat

universal, yaitu dapat ditumbuhi oleh hampir semua jenis bakteri.

Contoh : Mannitol Selenite Broth (MSB), Blood Agar, Brain Hearth Infusion Broth

(BHIB), Nutrient Agar, dan sebagainya.

4. Menanam bakteri yang tumbuh pada media differensial

Media Differensial adalah media yang digunakan untuk memindahkan

pertumbuhan mikroorganisme, media ini juga berguna untuk membagi bakteri

menjadi 2 kelompok besar yaitu bakteri gram positif atau gram negatif.

Contoh : Media EMB Agar, CLED Agar, Mac Conkey, dan sebagainya.

5. Memindahkan biakan bakteri ke media selektif

Media Selektif adalah media yang digunakan untuk memilih koloni satu jenis

bakteri dari koloni yang lain. Media ini menumbuhkan, mengembang-biakkan bakteri-

bakteri tertentu, sedangkan bakteri lainnya dihambat agar tidak tumbuh.

Contoh : Media TCBS Agar, Media Sabroud Dextrose Agar, Salmonella Shigella

Agar (SSA), dan sebagainya.

6. Melakukan uji pada media Biokimia reaksi

Media ini digunakan untuk identifikasi atau untuk menentukan jenis bakteri

yang lebih spesifik berdasarkan sifat-sifat biokimia reaksi yang ditimbulkan.

Contoh : Media KIA/TSIA, media gula-gula, Simmon’s citrate agar, dan sebagainya.

7. Melakukan Test Kimiawi.

B. Identifikasi Bakteri genus Enterobacteriaceae.

Identifikasi Bakteri Shigella sp

1. Menyiapkan Alat dan Bahan

2. Menyiapkan sampel berupa rectal swab/Feses

3. Menanam sampel pada media pemupuk

Sampel ditanam pada media Manitol  Selenit  Broth  (MSB) sebagai media

pemupuk ( Enrichment Medium), lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.

Pada media pemupuk ini semua bakteri dapat tumbuh. Oleh karena itu, untuk

mengetahui spesies yang lebih spesifik bakteri yang tumbuh dipindah ke media

differential.

4. Menanam bakteri yang tumbuh pada media differensial

Bakteri yang tumbuh pada media pemupuk, di tanam pada Media Mac

Conkey disimpan pada suhu 15⁰C - 25⁰C dengan pH 6,9 – 7,4. Media ini untuk

menumbuhkan bermacam-macam bakteri khususnya untuk bakteri gram negatif

basil seperti Salmonella, Shigella, Hidrocolera, dan E.Coli. Warna koloni shigella

yang tumbuh pada media mac conkey tidak berwarna karena Shigella sp tidak

memfermentasi laktosa kecuali Shigella sonnei.

Gambar koloni Shigella sp pada media Mac Conkey tampak tidak berwarna

Kandungan dalam media mac conkey :

a. Pepton sebagai sumber nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri.

b. Laktosa sebagai sumber energi dan bahan karbohidrat.

c. Bile salt dan kristal violet sebagai penghambat tumbuhnya bakteri gram positif.

d. NaCl sebagai pengatur keseimbangan tekanan osmosis pada media.

e. Neutral red sebagai indikator untuk mengetahui terbentuk tidaknya asam karena

pemecahan karbohidrat.

f. Agar sebagai bahan pemadat media dan tempat tumbuhnya mikroba atau bakteri.

5. Memindahkan biakan bakteri ke media selektif

Koloni dipindahkan pada media Salmonella  Shigella Agar (SSA),

diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Media ini memang dikhususkan untuk

mengisolasi bakteri Salmonella sp dan Shigella sp dari sampel pasien. Campuran

bile salt, sodium sitrat, dan brilliant green dalam SSA akan menghambat bakteri

gram positif, sebagian besar bakteri coliform dan pertumbuhan swarming Dari

Proteus Sp. Sehingga, bakteri Salmonella sp dan Shigella sp dapat tumbuh dengan

baik.

Gambar koloni Shigella sp pada media SSA tampak tidak berwarna

Indikator SSA adalah Neutral Red, oleh karena itu prinsip terbentuknya

koloni sebenarnya sama seperti koloni pada media mac conkey. Bakteri Shigella sp

membentuk koloni yang bersih transparan dan tidak berwarna karena tidak meragi

laktosa. Sedangkan, bakteri koliform pertumbuhannya akan terhambat dengan

membentuk koloni yang kecil, berwarna merah muda sampai merah.

6. Melakukan uji pada media Biokimia reaksi

a. Kigler Iron Agar (KIA)

Dalam media KIA, bakteri di inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.

Tujuan media ini untuk menguji adanya H2S, Fermentasi karbohidrat, dan Gas.

Media TSIA mengandung glukosa, laktosa, ferri sulfat (untuk mendeteksi

produksi H2S), dan indikator pH (fenol merah), dimana apabila bakteri

mengkatabolisme glukosa dan laktosa, maka akan mengubah indicator tersebut

menjadi warna kuning.

Gambar Shigella sp pada media KIA (kanan)

Jika bakteri memfermentasikan glukosa bagian miring dan pangkal akan

berubah warna kuning akibat sejumlah kecil asam yang dihasilkan. Apabila

produk fermentasi kemudian dioksidasi menjadi CO2 dan H2O dan dilepaskan

dari agar miring serta dekarbosilasi oksidatif protein masih berlanjut dengan

pembentukan amino ,bagian miring berubah menjadi alkalin (merah). Bakteri

Shigella sp menunjukkan lereng dari media KIA berwarna merah yang berarti

bersifat Alkali, dan dasarnya berwarna kuning yang berarti bersifat acid, juga

tidak tampak adanya gas serta tidak berwarna hitam berarti H2S juga negatif.

b. Urea Agar

Biakan dari media KIA ditanam pada  Urea Agar  dengan  bentuk zig-zag

pada bagian Lereng dengan menggunakan Oce. Tujuan uji pada urea agar ini

untuk menguji fermentasi bakteri terhadap urea. Bakteri Shigella sp

menunjukkan hasil negatif karena tidak terjadi warna merah lembayung (pink).

c. Simmon’s Citrate Agar

Digunakan untuk mengetahui apakah bakteri menggunakan citrat sebagai

sumber karbon atau tidak. Shigella dysentriae menunjukkan hasil negative

karena tetap berwarna hijau, berarti menunjukkan bahwa bakteri dengan spesies

tersebut tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Namun, beberapa

spesies shigella lainnya menunjukkan hasil positif yang ditandai terjadinya

perubahan warna hijau menjadi biru atau suasananya alkalis.

d. Motility Indol Ornithin (MIO)

Biakan ditanam  pada MIO dengan menggunakan Nal dan kemudian

ditusuk dengan Nal sampai ke dasar tabung. Bakteri Shigella sonnei

menunjukkan hasil positif (+) terjadi kekeruhan pada tusukan kemudian terjadi

cincin merah lembayung setelah penambahan larutan kopacs dan terjadi warna

ungu.

e. Methyl Red (MR)

Gambar Shigella sp pada MR menunjukkan hasil (+)

Biakan Shigella sp yang ditanam pada Methyl Red menuunjukkan hasil

positif karena berubah warna dari jernih menjadi merah setelah penambahan

reagen Metil Red.

f. Media Gula-Gula

Uji dengan Laktosa, Sukrosa, Maltosa, Manitol menunjukkan hasil Positif

(+) karena terdapat warna kuning pada permukaan larutan Gula – gula dan tidak

menghasilkan gas pada tabung durham. Ujia pada Glukosa juga Positif (+) dan

terbentuk gas pada sisi dalam larutan Glukosa.

Identifikasi Bakteri Klebsiella sp

1. Menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan

2. Menyiapkan sampel

3. Kultur pada media pemupuk

Media pemupuk merupakan media yang digunakan untuk memperbanyak

bakteri, media ini juga disebut sebagai media diperkaya. Spesimen pada uji ini

ditanam pada media Brain Hearth Infusion Broth (BHIB), replikasi bakteri

saluran dari usus normal dan meningkatkan bakteri  Klebsiella, Setelah itu

diinkubasi selama18-24 jam, pada media pemupuk bakteri gram (+) dan (-) dapat

tumbuh, lalu ditanam pada media differensial dan selektif.

4. Kultur pada media differensial

Media differensial digunakan untuk membedakan organisme atau

kelompok organisme yang terkait erat. Karena adanya zat pewarna atau bahan

kimia tertentu di media, organisme akan menghasilkan perubahan karakteristik

atau pola pertumbuhan yang digunakan untuk identifikasi atau diferensiasi. 

Pada uji ini digunakan media BAP (Blood Agar Plate). Media ini

digunakan untuk isolasi, menumbuhkan berbagai macam bakteri patogen dan

menetapkan bentuk hemolisa dari bakteri tersebut. Media kultur ini kaya nutrien

yang menyediakan kondisi pertumbuhan bakteri yang optimal. pH media ini

sekitar 6,8 untuk menstabilkan sel darah merah dan menghasilkan media

hemolisa yang jelas. Kandungan yang didapat pada agar darah seperti nutrien

substrat (ekstrak hati dan pepton), NaCl, agar – agar, darah domba.

Media Agar Darah merupakan media differensial yang berfungsi

membedakan bakteri berdasar kemampuan bakteri melisiskan sel darah merah.

Ekspresi dari hemolisis bakteri dapat diketahui ada atau tidaknya zona bening

disekeliling koloni bakteri. Terdapat 3 tipe sifat hemolisis yaitu alpha, beta, dan

gama. Bakteri yang memiliki tipe hemolisis alpha adalah S. Pneumoniae.

Hemolisis alpha terjadi penurunan hemoglobin sel darah merah di sekitar koloni

sehingga sekeliling bakteri akan tampak warna hijau atau coklat dalam medium.

Hemolisis beta didefinisikan lisis lengkap dengan tampilan warna tranparan

disekeliling bakteri pada medium. Bakteri yang termasuk beta hemolisis adalah

Streptococcus hemolitik, Streptococcus pyogenes. Tipe hemolisis gamma

menunjukan kurangnya tanda hemolisis. Bakteri yang memiliki sifat ini adalah

Klebsiella sp., Enterococcus faecalis.17 Gambaran pertumbuhan Klebsiella sp.

pada media agar darah ditunjukkan pada Gambar

Gambar Koloni K. pneumoniae pada agar darah (Gama-hemolisis)

5. Kultur pada media selektif differensial

Media selektif merupakan media yang selain mengandung nutrisi juga

ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan

mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Pada kultur ini

menggunakan Mac Conkey. Media Mac Conkey agar termasuk salah satu media

isolasi primer. Mac Conkey merupakan medium selektif differensial yang

mengandung zat warna khusus dan karbohidrat untuk membedakan koloni yang

memfermentasikan laktosa (bewarna merah jambu) dengan yang tidak

memfermentasikan laktosa (tidak bewarna), ukuran dan bentuk koloni bervariasi

tergantung species. Kelompok lactosa fermenter seperti Klebsiella sp. menghasilkan

koloni bewarna merah jambu pada media isolasi primer. Koloni Klebsiella sp.

membentuk koloni yang mukoid, kapsul polisakarida yang besar, kurang motil dan

menunjukan positif untuk lisin dekarbosilase dan sitrat. Media Mac Conkey

memungkinkan identifikasi persumtif secara cepat pada bakteri interik. Gambaran

pertumbuhan Klebsiella sp. pada media Mac Conkey ditunjukkan pada Gambar.

Gambar. Koloni K. pneumonia tampak berwarna merah muda mukoid pada media

Mac Conkey (laktosa positif)

6. Pewarnaan kapsul

Pewarnaan kapsul dengan menggunakan teknik burri-gins memiliki tujuan

untuk mengetahui ada tidaknya kapsul pada bakteri. Kapsul bakteri mudah ditembus

zat warna namun sukar dalam mengikat zat wana. Pada pewarnaan ini bakteri

bewarna terang jernih dengan latar belakang yang gelap.

7. Uji biokimia

a. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

TSIA merupakan media yang dapat mengidentifikasi bakteri sesuai dengan

karakter spesifik yang ditunjukan oleh bakteri. Media TSIA mengandung 0,1%

glukosa, 1% sukrosa, 1% laktosa, ferosulfat (untuk mendeteksi produksi H2S),

ekstrak jaringan (substrat pertumbuhan protein), dan indikator pH (fenol merah),

dimana apabila bakteri mengkatabolisme glukosa, sukrosa dan laktosa, maka akan

mengubah indicator tersebut menjadi warna kuning. Zat tersebut dimasukkan

kedalam tabung reaksi sehingga menghasilkan agar miring dengan bagian pangkal

yang dalam dan diinokulasi dengan menusukkan pertumbuhan bakteri ke dalam

bagian pangkal. Jika memfermentasikan glukosa bagian miring dan pangkal akan

berubah warna kuning akibat sejumlah kecil asam yang dihasilkan. Apabila

produk fermentasi kemudian dioksidasi menjadi CO2 dan H2O dan dilepaskan

dari agar miring serta dekarbosilasi oksidatif protein masih berlanjut dengan

pembentukan amino ,bagian miring berubah menjadi alkalin (merah). Reaksi oleh

Klebsiella sp. pada TSIA yaitu asam/asam bewarna kuning pada bagian pangkal

dan miring, dapat terdeteksi gas, tidak dihasilkan H2S.

b. Tes motilitas pada agar semisolid

Uji ini dignakan untuk mengetahui pergerakan bakteri. Bakteri diinokulasikan

dengan menggunakan suatu kawat lurus melalui pusat medium. Organisme-

organisme non-motil seperti Klebsiella sp. hanya tumbuh pada garis inokulum.

Sedangkan organisme yang motil tumbuh keluar dari medium, yang menjadi

keruh.

c. Tes Indol

Uji indol untuk menilai pembentukan indol oleh bakteri dari triptopan sebagai

sumber karbon. Bila positif menghasilkan warna merah sedangkan apabila negatif

menghasilkan warna kuning. Klebsiella sp. merupakan bakteri dengan indol

negative.

d. Tes metil merah dan Voges – Prokauer (VP)

Tes metil merah digunakan untuk mendeteksi produksi asam kuat selama proses

fermentasi glukosa. Pembentukan asam pada fermentasi glukosa memberikan

warna merah dengan indikator metil merah. Voges – Prokauer merupakan uji

untuk menentukan organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan

fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem buffer dan menentukan

bakteri yang menghasilkan produk netral (asetil metal karbinol atau aseton) dari

hasil fermentasi glukosa. Klebsiella sp menghasilkan warna merah yang

memberikan hasil positif terhadap reaksi VP.

e. Tes sitrat

Biakan diinokulasi pada media simmon sitrat agar dengan inokolum yang tipis

kemudian diinkubasi pada suhu 35°C selama 48 jam. Jika hasil positif terjadi

perubahan warna indikator dari hijau menjadi biru yang bermakna pertumbuhan

bakteri pada medium sitrat menghasilkan keadaan alkalis dan bakteri telah

menggunakan sitrat. Klebsiella sp. memberikan reaksi positif terhadap

penggunaan sitrat.

f. Tes urease

Uji hidrolisis urea menunjukan bakteri menghasilkan enzim urease. Dilakukan

dengan cara menggoreskan pembiakan 1 ose pada permukaan agar miring.

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C Shigella sp. Tes dinilai positif apabila

menghasilkan warna merah muda dan negatif apabila warna tidak berubah.

Bakteri Klebsiella sp. menghasilkan nilai positif pada pemeriksaan ini.