contoh ppt seminar
DESCRIPTION
akuTRANSCRIPT
-
UJI AKTIVITAS ANTIJAMUR (+)-KATEKIN
DAN GAMBIR (Uncaria gambir, Roxb)
TERHADAP BEBERAPA JENIS JAMUR DAN
MEKANISMENYA
Muh. Yanis Musdja
-
PENDAHULUAN
-
LATAR BELAKANG
Menyirih merupakan salah satu kegiatan yang memanfaatkan tanaman tradisional.
Gambir merupakan salah satu bahan menyirih.
Dibutuhkan penelitian ilmiah (SAINTIFIKASI) tentang kegunaan
gambir
Penelitian antijamur
-
Tujuan Penelitian
Mengetahui aktifitas anti jamur (+)- katekin gambir dan ekstrak air gambir terhadap beberapa jamur.
Mengetahui mekanisme penghambatan anti jamur (+)-katekin gambir dan ekstrak air gambir terhadap beberapa jamur.
-
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan memberikan gambaran dan informasi tentang aktivitas anti jamur dari (+)-katekin dan ekstrak air gambir, serta mekanisme panghambatannya terhadap beberapa jamur untuk menunjang saintifikasi gambir sebagai pengobatan tradisional.
-
Bongkahan Gambir
-
Kandungan kimia
Kandungan Kimia Daun Gambir dan Bongkahan Gambir Kandungan katekin total daun gambir 13,7 % (Anggraini et al, 2011), kandungan (+)-katekin daun gambir 9,4% (Das N.P, 1967). Kandungan utama bongkahan gambir adalah katekin (40-60%), zat penyamak (22-50%), serta sejumlah alkaloid seperti gambirtannin, turunan dihidro dan okso-gambirtannin. (Wiart, 2006; Amos, 2010). Taniguchi et al (2008) menemukan 9 jenis katekin pada gambir, yakni, (+)-catechin, (-)-epicatechin Gambiriin A1, Gambiriin A2, Gambiriin B1, Gambiriin B2, Catechin-(4-8)-ent-epicatechin, Gambirflavan D1 dan Gambirflavan D2.
-
Khasiat empirik
Kegunaan gambir secara tradisional adalah sebagai pelengkap makan sirih dan obat-obatan, gambir juga digunakan untuk obat luka bakar, di samping rebusan daun muda dan tunasnya digunakan sebagai obat diare serta obat kumur-kumur pada sakit kerongkongan.
Secara moderen gambir banyak digunakan sebagai bahan baku industri farmasi dan makanan, di antaranya bahan baku obat penyakit hati dengan paten catergen, bahan baku permen yang melegakan kerongkongan bagi perokok di Jepang karena gambir mampu menetralisir nikotin.
Sedangkan di Singapura gambir digunakan sebagai bahan baku obat sakit perut dan sakit gigi
-
(+)-Katekin
(+)-Katekin adalah golongan senyawa pilofenol tipe flavonoid, yang banyak dijumpai pada teh, anggur, buah-buahan dan tumbuh-tumbuhan polon-polongan. Lima jenis katekin terbesar yaitu (+)- katekin, (-)- epikatekin, (-)-epigallokatekin (EGC), (-)- apikatekin gallat, dan (-)- epikatekin gallat (I. C. W., Arts et al, 1998).
-
Metode Pengujian Antimikroba
Metode Difusi Metode Dilusi
-
Bongkahan gambir
Dilarutkan dalamaquadest
Freeze drying
Fraksinasi etil asetat
Ekstrak etil asetat gambir
Kromatografi kolom
(+)-katekin
Ekstrak air gambir
Uji aktivitas antijamur
-
Pengujian aktivitas antijamur
Pengujian kebocoran membran sel
Analisa morfologi sel dgn SEM
Penentuan MIC
Penentuan zona hambat
Analisa kebocoran
protein dan asam nukleat dgn UV
Analisa kebocoran ion logam dgn AAS
-
Analisis kerusakan bakteri (Carson et al. 2002)
Diambil 10ml suspensi bakteri Sentrifuge dingin, kec 3500
rpm, 20menit
Filtrat dibuang, endapan
dicuci dan ditambahkan
buffer fosfat
Ditambahkan sampel
dengan dosis 1 KHM & 2
KHM
Diinkubasi shaker 24 jam,
150rpm
Suspensi disentrifuge, 15 mnt,
kec 3500 rpm
Disaring dengan kertas
saring steril pellet
supernatan
Analisis kerusakan sel
dengan SEM
analisis kebocoran
protein dan asam nukleat
dengan spektro UV-Vis
Analisis kebocoran
ion-ion logam K+ dan
Ca2+ dengan AAS
-
HASIL PENELITIAN
-
Isolasi dan Identifikasi (+)-Katekin
Hasil dari KLT didapatkan beberapa fraksi yang digabungkan, yaitu : 1-8, 9-10, 11-28, 29-40, 41-75.
Persentase kadar (+)-katekin yang didapat sebesar 22,54%
-
Pengujian zona hambat
Aktivitas Gambir dan Katekin terhadap 5 jamur pada konsentrasi 7000 g
No. Jamur uji Diameter hambat
1 Candida albicans -
2 Saccharomyces cerevisiae -
3 Fusarium oxysporum -
4 Aspergillus niger -
5 Aspergillus flavus -
6 Kontrol pelarut -
-
Penentuan MIC
Penentuan nilai MIC
2,5 mg/ml 25 mg/ml
No. Jamur uji Nilai MIC (mg/ml)
Gambir (+)-katekin
1 Candida albicans
- -
2 Saccharomyces cerevisiae
7,5 12,5
3 Fusarium oxysporum
- -
4 Aspergillus niger
- -
5 Aspergillus flavus
- -
6 Kontrol pelarut - -
-
Analisa kebocoran protein dan asam nukleat dgn spektrofotometri UV VIS
Data Spektrofotometri UV VIS Gambir S. cerevisiae
Panjang gelombang
Absorbansi
Kontrol 1 MIC 2 MIC
260 nm 0,693 0,747 0,873
280 nm 0,870 0,895 0,957
-
Analisa kebocoran protein dan asam nukleat dgn spektrofotometri UV VIS
Data Spektrofotometri UV VIS (+)-Katekin S. cerevisiae
Panjang gelombang
Absorbansi
kontrol 1 MIC 2 MIC
260 nm 0,693 1,575 1,816
280 nm 0,870 2,032 2,658
-
Analisa kebocoran ion-ion logam
Konsentrasi Data ion Ca2+ Data ion K+
(+)-katekin Gambir (+)-katekin Gambir
Kontrol Ca2+ 1,57 1,57 1,57 1,57
Kontrol K+ 85,7 85,7 85,7 85,7
1 MIC 5,96 2,73 88,5 92,9
2 MIC 6,36 4,99 89,4 119,5
-
Perubahan Morfologi Sel Saccharomyces cerevisiae
(a) (b) (c)
-
Perubahan Morfologi Sel Saccharomyces cerevisiae
(d) (e)
-
Perubahan Morfologi Sel Saccharomyces cerevisiae
Morfologi sel S. cerevisiae kontrol (a), sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengan gambir 1 MIC (b), sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengan gambir 2 MIC (c), sel S.cerevisiae setelah perlakuan dengan katekin 1 MIC(d), dan sel S. cerevisiae setelah perlakuan dengan katekin 2 MIC (e) (Pembesaran 15.000 kali). Tanda panah adalah terjadinya kerusakan sel.
-
KESIMPULAN
1. Persentase kadar (+)-katekin yang disiolasi dari gambir yang berasal dari Payakumbuh, Sumatera Barat sebesar 22,54%.
2. Nilai MIC gambir pada S. cerevisiae (LIPIMC) adalah 7,5 mg/ml dan untuk (+)-katekin sebesar 12,5 mg/ml. Sedangkan gambir dan (+)-katekin tidak menunjukan aktivitas antijamur terhadap C. albicans (LIPIMC), A. niger (LIPIMC 759), A. flavus (LIPIMC 745), F.oxysporum (LIPIMC 762) hingga konsentrasi uji 25 mg/ml.
-
KESIMPULAN
3. Mekanisme penghambatan gambir dan katekin terhadap Saccharomyces cerevisiae adalah dengan mengganggu permeabilitas membran sel.
4. Karena gambir dan (+)-katekin terhadap C. albicans, A. niger, A. flavus , F.oxysporum , dan S. cerevisiae tidak menunjukan aktivitas hingga konsentrasi 25 mg/ml, maka sampel uji diklasifikasikan sebagai antimikroba resistant menurut data pengujian University of Pennsylvania dalam University of Pennsylvania Medical Centre Guide Lines for Antimicrobial Therapy.
-
saran
1. Perlu diperhatikan kualitas gambir, agar didapatkan hasil uji yang lebih baik.
2. Perlu dilakukan penelitian terhadap (+)- katekin dan gambir untuk pemanfaatan lainnya.
-
Tinjauan Tentang Jamur ciri cendawan
pH optimum 3,8-5,6
Suhu optimum 22-300 C (saprofit);30-370 C (parasit)
Gas Aerobic obligat (kapang); Fakultatif
(khamir)
Cahaya Tidak ada
Kadar gula dalam medium laboratories 4-5%
Karbon Organic
Komponen structural dinding sel Kitin, selulose, atau glukan
Kerentanan terhadap antibiotic peka terhadap griseofulvin
-
Pembuatan Medium
Potato Dextrose Agar (PDA)
Serbuk PDA sebanyak 39 gram dilarutkan dalam 1 L aquadest dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Larutan tersebut kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.
-
Potato Dextrose Broth (PDB)
Serbuk PDB sebanyak 24 gram dilarutkan dalam 1 L aquadest dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.
-
Pembuatan larutan Uji
Larutan uji dibuat dengan melarutkan gambir dengan DMSO 10% dan katekin dilarutkan dalam aseton (pengujian zona hambat) dan dalam methanol 20% (pengujian MIC). Untuk penentuan zona hambat antijamur, konsentrasi larutan uji yang dibuat sebesar 350 mg/ml untuk penentuan zona hambat jamur. Sedangkan untuk penentuan nilai MIC konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5 mg/ml; 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; dan 25 mg/ml.
-
Pembuatan Stok Jamur
Jamur uji diinokulasi dalam media agar PDA yang dibuat membentuk agar miring dengan cara menggoreskan masing-masing jamur menggunakan jarum ose steril ke dalam 5 ml media agar miring PDA dan diinkubasi pada suhu ruang selama waktu tumbuh optimum masing-masing jamur.
-
Pembuatan Suspensi Jamur
Biakan jamur yang telah diremajakan tersebut, diambil sebanyak 1 ose dan disuspensikan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml media cair PDB kemudian diinkubasi dengan shaker inkubator pada suhu ruang C selama waktu tumbuh optimum masing-masing jamur. Jumlah jamur yang terdapat dalam suspensi dihitung dengan menggunakan metode cawan hitung. Jumlah jamur tersebut nantinya digunakan untuk pengujian aktivitas antimikroba.
-
Penentuan Diameter Daerah Hambat Penentuan aktivitas antijamur dari gambir dan (+)- katekin
terhadap Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Aspergillus flavus ,dan Fusarium oxysporum dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan kertas cakram. Media agar PDA yang sudah dicairkan sebanyak 20 ml dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan menjadi padat. Setelah memadat, suspensi dari setiap jamur sebanyak 0,1 ml disebar ke permukaan agar secara merata pada cawan yang berbeda. Kertas cakram steril diletakkan di atas medium agar dan ditetesi larutan uji sebanyak 20 l. Untuk kontrol negatif digunakan pelarut DMSO 10% (pengujian gambir) dan aseton (pengujian katekin) sebanyak 20 l pada setiap jamur uji. Masing-masing cawan petri diinkubasi pada suhu ruang selama waktu tumbuh optimum masing-masing jamur. Aktivitas antijamur diamati berdasarkan diameter daerah hambat yang terbentuk di sekeliling kertas cakram. Pengujian dilakukan secara duplo.
-
Penentuan MIC (Minimum Inhibitor Concentration) Penentuan MIC gambir dan (+)-katekin dilakukan dengan metode
makrodilusi dengan menggunakan petridish. Untuk pengujian MIC dengan metode makrodilusi masing-masing petridish diisikan medium PDA yang telah mengandung seri konsentrasi sampel uji 2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5 mg/ml dan 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; dan 25 mg/ml, kemudian ditotol suspensi jamur dan di inkubasi selama waktu tumbuh optimum masing-masing jamur pada suhu ruang. Setelah proses inkubasi, diamati masing-masing seri konsentrasi larutan uji terdapat pertumbuhan atau tidak. Untuk kontrol digunakan empat macam kontrol yaitu
kontrol media, hanya berisi media PDA kontrol negatif, berisi media PDA dan pelarut kontrol bakteri, berisi media PDA dan suspensi jamur Kontrol pelarut, berisi media PDA, suspensi bakteri dan pelarut Dari prosedur tersebut diperoleh nilai MIC
gambir dan katekin. Nilai MIC dinyatakan sebagai konsentrasi terkecil dari sampel uji yang dapat menghambat pertumbuhan jamur uji.
-
Analisis Kebocoran Protein dan Asam Nukleat (Carson et al., 2002)
Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dan pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 260 nm (untuk kandungan nitrogen dari asam nukleat) dan panjang gelombang 280 nm (untuk kandungan nitrogen dari protein). Suspensi jamur uji sebanyak 10 ml, yang telah ditumbuhkan selama 24 jam dalam media PDB, disentrifus dingin dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuang lalu endapan sel disuspensikan dengan 9,5 ml buffer fosfat pH 7,0. Selanjutnya ditambahkan sampel uji dengan dosis 1 MIC, 2 MIC dan kontrol, diinkubasi dalam shaker inkubator selama 48 jam. Setelah diinkubasi, suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit, lalu disaring untuk memisahkan supernatan dari sel. Cairan supernatan diambil dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV. Pellet jamur dikoleksi untuk difoto dengan SEM dengan perlakuan pada prosedur
-
Analisis Kebocoran Ion-Ion Logam
Untuk analisis kebocoran ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca2+ dan K+ yang keluar dari membran sel jamur akibat perlakuan dengan sampel. Kebocoran ion Ca2+ dan K+ dideteksi dengan menggunakan AAS. Sampel untuk analisis kebocoran ion logam berupa cairan supernatan yang berasal dari perlakuan pada prosedur
-
Penentuan diameter zona hambat bakteri
PDA steril yang telah memadat
Diinokulasikan 0,1 ml suspensi sel bakteri
Diratakan dengan batang spreader
Diletakan kertas cakram steril
Diteteskan 10 l (+)-Katekin/ ekstrak Gambir
Diinkubasi suhu 370 C, 24 jam
Diukur zona bening disekitar cakram
-
Penentuan KHM Ekstrak Gambir & (+)-Katekin Microplate
+100 l MHB, + 100 l suspensi bakteri
150 l MHB+100 l suspensi bakteri
Diinkubasi 24 jam, 37o C
Larutan uji dan pembanding (+50 l) Larutan kontrol
(+)-Katekin Ekstrak Gambir 100 l MHB+100 l suspensi bakteri +50 l pelarut
200 l MHB+50 l pelarut
250 l medium
Di plating, diinkubasi selama 24 jam37o C Diamati pertumbuhan bakteri
-
Analisis kerusakan Jamur (Carson et al. 2002)
Diambil 10ml suspensi bakteri Sentrifuge dingin, kec 3500
rpm, 20menit
Filtrat dibuang, endapan
dicuci dan ditambahkan
buffer fosfat
Ditambahkan sampel
dengan dosis 1 KHM & 2
KHM
Diinkubasi shaker 24 jam,
150rpm
Suspensi disentrifuge, 15 mnt,
kec 3500 rpm
Disaring dengan kertas
saring steril pellet
supernatan
Analisis kerusakan sel
dengan SEM
analisis kebocoran
protein dan asam nukleat
dengan spektro UV-Vis
Analisis kebocoran
ion-ion logam K+ dan
Ca2+ dengan AAS
-
Penentuan diameter zona hambat bakteri
MHA steril yang telah memadat
Diinokulasikan 0,1 ml suspensi sel bakteri
Diratakan dengan batang spreader
Diletakan kertas cakram steril
Diteteskan 10 l (+)-Katekin/ ekstrak Gambir
Diinkubasi suhu 370 C, 24 jam
Diukur zona bening disekitar cakram