biancademirandaperes mestrado p corrigida

5/22/2018 BiancadeMirandaPeres Mestrado P Corrigida

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BIANCA DE MIRANDA PERES

Bactrias indicadoras e patognicas em biofilmes de sistemas de tratamento de gua, sistemas

contaminados e esgoto

rea de concentrao: Microbiologia

Orientador: Ren Peter Schneider

SO PAULO

2011

Dissertao apresentada ao Programa dePs-Graduao em Microbiologia do

Instituto de Cincias Biomdicas daUniversidade de So Paulo, para aobteno do Ttulo de Mestre emCincias.

"Verso corrigida. Verso original seencontra arquivada no Servio deComunicaes do ICB"


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RESUMO

BIANCA, M. P. Bactrias indicadoras e patognicas em biofilmes de sistemas de

tratamento de gua, sistemas contaminados e esgoto. 2011. 105f. Dissertao (Mestrado

em Microbiologia) - Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, 2011.

Amostras de biofilme de biomassa suspensa de tanque de aerao de lodo ativado, de crrego

contaminado com esgoto e de superfcies de planta de tratamento de gua expostas gua

bruta ou parcialmente tratada, como tanque de floculao, tanques de areia, canais de ligaoentre os tanques e manacial, foram analisadas com relao presena de bactrias indicadoras

e patognicas. Nos testes presuntivos foram detectados todos os microrganismos-alvo

(Coliformes, Salmonella spp, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp.,

Enterococcus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp.,

Campylobacter spp. e Legionella. spp.), porm nos testes confirmatrios por PCR e teste

bioqumico somente as espciesE. coli, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi,

K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, e L. pneumophila foram confirmadas paraalgumas cepas selecionadas dos testes presuntivos. S. flexneri foi somente confirmada por

teste bioqumico eS. aureus somente por PCR. Nenhuma amostra deC. jejuni foi confirmada

por nenhum dos testes. Estes resultados demonstram que os meios seletivos para testes

presuntivos no se mostraram confiveis uma vez que muitas amostras presuntivas no foram

confirmadas por PCR ou teste bioqumico especfico. Estes resultados demonstram o

potencial de biofilmes microbianos como reservatrio de patgenos.

Palavras-chave: Biofilmes. Patgenos. Esgoto. Sistemas de tratamento de gua. Bactrias

indicadoras.


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ABSTRACT

BIANCA, M. P. Pathogenic and indicator bacteria in drinking water treatment plants, in

sewage treatment plants and in a creek contaminated with raw sewage. 2011. 105f.

Master thesis. Dissertao (Mestrado em Microbiologia) - Instituto de Cincias Biomdicas,

Universidade de So Paulo, 2011.

Biofilm samples from activated sludge reactors, surfaces from water treatment plants and

water samples from a creek contaminated with raw sewage were analyzed for the presence of

microbial indicator bacteria and pathogens. All target organisms (Coliforms, Salmonellaspp,

Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Vibrio spp.,

Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp. and Legionella. spp.)

were detected by using presumptive testing media. Only a small proportion of positive

colonies from presumptive tests were confirmed as pathogenic strains of E. coli, Salmonella

enterica subsp. Enterica serovar Typhi, K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, and L.

pneumophilain confirmatory testing by selective PCR and biochemical tests . S. flexneri was

only confirmed in biochemical tests,S. aureus only by PCR and no colony of C. jejuni was

confirmed positive by either PCR or biochemical testing.Presumptive media are therefore not

safe means for assessing pathogen load in biofilm samples. These results demonstrate the

importance of microbial biofilms as reservoirs for microbial pathogens.

Key words:Biofilms. Pathogens. Sewage. Drinking water treatment plants. Indicator bactria


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1 INTRODUO E REVISO BIBLIOGRFICA

1.1 gua potvel, tratamento da gua e monitoramento da qualidade da gua

A gua um bem necessrio para o sustento da vida e, portanto, deve atender a

padres de qualidade para no expor a populao a situaes de risco sade.

Empresas produtoras de gua potvel so responsveis por garantir a qualidade da

gua distribuda e o tratamento da gua visa retirada de slidos suspensos e dissolvidos,

microorganismos potencialmente prejudiciais sade, minerais como ferro e mangans e

poluentes. O tratamento bsico consiste nas seguintes etapas: pr-clorao, pr-alcalinizao,

coagulao, floculao, decantao, filtrao, ps-alcalinizao, desinfeco e por fim

fluoretao.

A qualidade da gua depende da combinao da proteo das fontes de gua, controle

dos processos de tratamento e da gesto da distribuio da mesma. O propsito dos programas

de monitoramento microbiano nos sistemas de distribuio garantir que os suprimentos de

gua estejam de acordo com as orientaes, padres ou regulamentaes.

medida que a gua atravessa o sistema de distribuio, a qualidade da gua pode ser

degradada. Esta degradao causada por vrios fatores, incluindo reduo da concentrao

do resduo de desinfetante, destacamento de biofilme, ressuspenso do sedimento da

tubulao causada por rpidas mudanas no fluxo, rupturas na tubulao, entrada de

contaminantes na rede da tubulao, conexes cruzadas, recrescimento de bactrias que

sobreviveram aos processos de tratamento e crescimento de biofilmes nas paredes das

tubulaes e superfcies de tanques e reservatrios (Fox et al., 2006).

Embora existam testes para a deteco direta dos microorganismos patognicos, estes

so caros, demorados e geralmente difceis de implementar (World Health Organization,

2004) alm disso, quando detectados, j foram disseminados pelo sistema de distribuio. Os

mtodos aplicados na rotina para monitoramento da qualidade microbiolgica de guas de

abastecimento so os que detectam e enumeram os indicadores fecais que no so

necessariamente causadores de doenas, porm so, assim como os patognicos, de origem

fecal.


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1.2 Parmetros utilizados na avaliao da qualidade da gua

Para atender ao nvel de qualidade esttica (sabor, cor e odor) e de potabilidade, a guadeve ser avaliada com respeito a aspectos qumicos, radiolgicos, de aceitabilidade e por fim,

e no menos importante, os microbiolgicos.

Com intuito de monitorar a qualidade da gua, as autoridades sanitrias e rgos de

saneamento realizam testes para deteco de microorganismos indicadores de poluio fecal,

sobretudo em guas destinadas ao consumo humano (WHO, 2004). Os mtodos aplicados so

os que detectam e enumeram os indicadores fecais.

De acordo com Bitton (2005) e Environmental Protection Agency (2002), os critrios

para que um microorganismo seja considerado um indicador ideal so: deve pertencer

microflora intestinal de animais de sangue quente exclusivamente, deve estar presente sempre

que um patgeno entrico esteja , deve estar presente em nmeros maiores que os patgenos,

deve ter, no mnimo, resistncia igual dos patgenos em relao aos fatores ambientais e

desinfeco da gua e deve ser rapidamente detectvel por mtodos simples e no deve

crescer em guas naturais.

No existe nenhum microorganismo que possua todas as caractersticas listadas acima,

mas a Escherichia coli um membro dos coliformes fecais que satisfaz a maioria destes

critrios. A ausncia de E.colino pode ser tomada como uma indicao absoluta de que os

patgenos intestinais esto tambm ausentes (EPA, 2002).

1.3 Microorganismos utilizados como indicadores

1.3.1 Bactrias heterotrficas

Estes microorganismos esto sempre presentes em concentraes maiores que os

coliformes e um aumento em sua concentrao indica falha no tratamento da gua,

contaminao ps-tratamento ou presena de depsitos, biofilmes ou ainda corroso na

tubulao (WHO, 2004). No entanto, no existe evidncia de que os microorganismos

heterotrficos sejam responsveis por efeitos na sade atravs da ingesto da gua (WHO,

2003). Os rgos de monitoramento da qualidade da gua estabeleceram um valor limite de


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at 500 UFC/100 mL uma vez que concentraes maiores interferem na recuperao dos

coliformes (LeChevallier, 1980).

Embora as bactrias heterotrficas no sejam indicadoras diretas de contaminaofecal, indicam variao da qualidade da gua e potencial para a sobrevivncia e recrescimento

dos microorganismos patognicos (Maier et al., 2004).

1.3.2 Coliformes totais e termotolerantes

Conforme mencionado, os coliformes so utilizados como indicadores de

contaminao fecal. No entanto, este grupo dividido entre coliformes totais e

termotolerantes. Os coliformes totais so definidos como bacilos Gram-negativos, no

formadores de esporos, capazes de crescer aerobicamente e anaerobicamente na presena de

sais biliares ou agentes tensoativos. Geralmente fermentam a lactose a 35-37C, com

produo de cido, gs e aldedo em 48h. Possuem a enzima -galactosidase e so oxidase

negativos. As bactrias coliformes pertencem famlia Enterobacteriacea e os gneros

geralmente encontrados em suprimentos de gua so Citrobacter,Enterobacter,Escherichia,

Hafnia,Klebsiella, Serratiae Yersinia. (CETESB, 2009).

Uma fonte potencial de coliformes no abastecimento de gua resulta de uma operao

sub-tima do processo de tratamento da gua ou ingresso atravs de quebras na integridade do

sistema de distribuio. Isto inclui: vazamentos nos reservatrios, contaminao das vlvulas,

infiltrao nos reservatrios, conexes cruzadas e efeitos de refluxo (EPA, 2002).

O grupo dos coliformes tem sido usado como um padro para a avaliao dacontaminao fecal para guas potveis e recreacionais desde o comeo do sculo XX. No

entanto, existem muitas deficincias no uso desses indicadores. Como exemplos podemos

citar o recrescimento deste grupo nos ambientes aquticos e sistemas de distribuio,

supresso por um alto crescimento de bactrias heterotrficas e inexistncia de relao de

proporcionalidade com a infestao da gua com protozorios patognicos entricos e vrus

entricos (Maier et al., 2004).

Os coliformes termotolerantes possuem caractersticas dos coliformes totais, mas so

capazes de fermentar a lactose a 44-45 C com formao de cido/gs e provas bioqumicas


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positivas para indol, -glucuronidase e ausncia de urease. O termo coliforme fecal no

preciso porque somente E.coli, de origem exclusivamente fecal. Sabe-se que os outros

membros do grupo coliforme esto presentes no solo e em outros materiais ambientais e so

capazes de crescer em guas eutrficas e biofilmes.

A E.coli encontrada nas fezes de todos os mamferos frequentemente em nmero

elevado (109por grama de fezes) e mesmo que possa ser detectada mais facilmente que outros

membros do grupo dos coliformes, possui as mesmas limitaes dos coliformes totais como

indicador de contaminao fecal (Maier et al., 2004).

1.3.3 Enterococos intestinais

Os enterococos intestinais so um subgrupo dos estreptococos fecais, definidos como

cocos Gram-positivos que tendem a formar pares ou cadeias, no formadores de esporos,

oxidase negativos e catalase negativos. Podem crescer tanto aerobicamente quanto

anaerobicamente na presena de sais biliares e so relativamente tolerantes a cloreto de sdio

e pH alcalino (CETESB, 2009).

Incluem espcies que ocorrem em fezes humanas e de animais de sangue quente como

Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans e Enterococcus hirae.

Alm disso, podem ser encontrados em alimentos onde sua presena geralmente no est

relacionada com contaminao fecal direta.

A principal razo para sua enumerao avaliar a significncia da presena de

bactrias coliformes na ausncia de E.coliou prover informao adicional na avaliao deuma potencial contaminao fecal. Sua sobrevivncia 10 vezes menor que a da E.colinos

ambientes aquticos e estes organismos so mais resistente clorao. Estes microorganismos

possuem algumas vantagens sobre os coliformes, pois raramente se multiplicam em gua, so

mais resistentes aos estresses ambientais e clorao que os coliformes e geralmente

persistem por mais tempo no ambiente (Maier et al., 2004).


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1.3.4 Clostri dium perf ri ngens

C. pefringens um bacilo Gram positivo, anaerbio, formador de esporo e sulfito

redutor exclusivamente de origem fecal. Os esporos so extremamente resistentes ao calor e a

desinfetantes e, por isso, sua deteco indica deficincias no tratamento e a possvel presena

de organismos mais resistentes como protozorios parasitas ou vrus (Maier, 2004).

Graas sua resistncia, so teis em avaliaes complementares, como indicadores

de poluio remota ou intermitente (CETESB, 2009).

1.4 Recrescimento

O recrescimento o aumento do nmero de bactrias que ocorre depois do ponto de

tratamento. Estes organismos derivam de clulas viveis e clulas dormentes ou ainda de

clulas injuriadas que passaram pela planta de tratamento (Power, 1995).

Este fenmeno mais comumente observado em coliformes totais, seguidos pelas

bactrias heterotrficas e raramente os coliformes fecais. A deteco do recrescimento destes

organismos pode ser devido natureza seletiva dos programas de monitoramento de gua que

somente enumeram certos organismos ou devido s caractersticas fisiolgicas das clulas que

resulta na sobrevivncia de alguns organismos ao tratamento enquanto outras morrem (Power

et al., 1996).

No caso de bactrias heterotrficas, o recrescimento ocorre quando a concentrao decloro residual encontra-se abaixo de 0,2 mg/L, a temperatura da gua excede 10 C e o

carbono orgnico assimilvel maior que 50 g/L (Maier et al., 2004). O recrescimento

destes microorganismos pode inibir ou mascarar a deteco dos organismos indicadores. Esta

inibio pode ser resultado tanto da produo de substncias semelhantes bacteriocinas

quanto pelo crescimento em altos nmeros de antagonistas aos coliformes (LeChevallier e

McFeters, 1985a). A no deteco dos microorganismos indicadores pode, por sua vez,

implicar em surtos de doenas de transmisso hdrica uma vez que os microorganismos

patognicos poderiam estar presentes, porm foram subestimados. Outra razo pela qual se

deve evitar o recrescimento bacteriano a habilidade dos organismos que fazem parte da


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microbiota natural heterotrfica dos sistemas de distribuio em se comportar como

patgenos oportunistas. Estes organismos so considerados patgenos emergentes que

apresentam um srio problema de sade pblica (Reasoner, 1992).

Um dos principais parmetros ligados ao recrescimento a desinfeco da gua e a

presena de cloro residual. A manuteno do resduo desinfetante importante para controlar

uma possvel contaminao e na desativao de qualquer clula que tenha sobrevivido ao

tratamento ou ainda clulas que venham a se dispersar dos biofilmes. A manuteno

inadequada de um resduo tambm permitir a recuperao ou reativao de bactrias

parcialmente injuriadas (LeChevallier e McFeters, 1985b).

A carga orgnica da gua tratada tambm possui um efeito sobre o recrescimento porinterferir com a eficincia dos desinfetantes e tambm por representar uma fonte de nutriente

ao crescimento bacteriano (Power, 1995). Os nveis de carbono orgnico assimilvel so

reduzidos medida que a gua se move atravs do sistema sendo estes valores

correlacionados ocorrncia de coliformes e de bactrias heterotrficas (LeChevallier et al.,

1991).

A temperatura da gua no s importante devido correlao com o crescimento

bacteriano, mas tambm por afetar a taxa das reaes qumicas relativas destruio dos

microorganismos pelos desinfetantes ou a atividade das enzimas de crescimento dos

organismos (Hutchinson e Ridgway, 1977).

Os biofilmes presentes em um sistema de distribuio so os principais contribuidores

do recrescimento (Power, 1995).

1.5 Biofilmes

Um biofilme microbiano constitudo por clulas envoltas em uma matriz de

exopolmeros produzida pelos prprios microorganismos, que as mantm unidas. Pode estar

aderido ou no a um substrato e seu desenvolvimento depende do carbono orgnico

assimilvel.

Seu desenvolvimento ocorre em estgios (Figura 1). No primeiro e no segundo

estgios, ocorre uma associao frouxa ou transiente entre o microorganismo e a superficieseguida de uma adeso forte. A ligao reversvel mediada pela atrao fsico-qumica,


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ocorrendo em funo de uma atrao inicial da bactria pela superfcie e controlada por

diversas foras competitivas como foras repulsivas eletrostticas e foras atrativas de van der

Waals.

As propriedades da superfcie podem ser modificadas pela adsoro de um filme

condicionante de compostos orgnicos. A ligao bacteriana promovida quando o material

orgnico cobre a superfcie dos slidos uma vez que a solubilidade da gua tenha se tornado

limitante (Maier, 2009).

A ligao reversvel dos organismos s superfcies pode, com o tempo, se tornar

permanente. Esta ltima inicia-se pela excreo dos polmeros extracelulares produzidos pelas

bactrias ligadas ainda de modo reversvel. A excreo da matriz prov a ligao das bactriase forma a arquitetura interna da comunidade. O desenvolvimento de um biofilme maduro

devido no somente proliferao das clulas aderidas mas tambm pela contnua deposio

de clulas planctnicas (Maier, 2009).

Os exopolmeros tambm influenciam no funcionamento e sobrevivncia do biofilme

em ambientes hostis (Sandrin et al, 2009).

Nos estgios trs e quatro, h a agregao das clulas em microcolnias e subseqentecrescimento e maturao (Stoodley et al., 2004). O ltimo estgio caracteriza-se pela

possibilidade de ocorrer disperso do biofilme por eroso (apenas uma clula) ou por

sloughing (pedao de biofilme). O exato mecanismo de como e porque ocorre a disperso

ainda est sob investigao, mas est provavelmente ligado a fatores de presso ambiental

como diminuio da matria orgnica disponvel ou superpopulao (Richards e Melander,

2009).


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Figura 1 - Estgios da formao de um biofilme. Legenda: 1) e 2) Adeso inicial e fraca dos

microorganismos ao substrato. 3) e 4) Agregao de microcolnias e subseqente crescimento

e maturao do biofilme. 5) Estgio final caracterizado por eroso ou sloughing.

FONTE: Fairley (2010).

A estrutura do biofilme depende da natureza dos microorganismos presentes, da

concentrao de nutrientes, das propriedades hidrodinmicas e presena de alguma fora

mecnica, portanto pode variar de um tipo achatado at uma organizao complexa em forma

de cogumelo envolvendo agregados separados por canais de gua, sendo que este ltimo

forma-se em ambientes de baixa concentrao de nutrientes, alto estresse hidrodinmico e

ausncia de foras mecnicas, abrasivas e compressivas (Wilson, 2001).

Por causa do gradiente dos nutrientes e de fatores fsico-qumicos, as clulas em

diferentes profundidades dentro do biofilme esto expostas a diferentes condies e, portanto,

apresentaro padres diferentes de expresso de genes e consequentemente diferentes

fentipos (Wilson, 2001).

Uma componente chave, que permite certo grau de homeostase dentro do biofilme, a

matriz exopolimrica (Davey e OToole, 2000). A matriz desempenha diversas funes: pode

estar relacionada ao desenvolvimento e estrutura do biofilme, concentrao de nutrientes

essenciais e fatores de crescimento (Wolfaardt et al., 1998), preveno da entrada de agentes

antimicrobianos dentro do biofilme (Gilbert et al., 1997), adsoro de metais, ctions e

toxinas e proteo contra estresses ambientais, como UV, variao de pH, choque osmticoe dessecao (Flemming H-C.,1993).


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Devido aos canais de gua, a troca de nutrientes e metablitos com a massa de gua

mais eficiente, o que aumenta a disponibilidade de nutrientes e a remoo de substncias

potencialmente txicas (Costerton et al., 1995).

Muito do que se sabe do incio do desenvolvimento do biofilme, origina-se de estudos

a respeito do quorum sensing (QS). QS o termo empregado para descrever como as

bactrias se comunicam com as outras para coordenar a expresso gnica dentro da

populao. A inibio do QS atravs do uso de homoserinolactonas a base para o controle

dos biofilmes (Simes et al., 2007).

1.5.1 Fatores que contribuem para a formao dos biofilmes nos sistemas detratamento e distribuio de gua potvel

A maioria das bactrias em ambientes oligotrficos cresce em biofilmes em vez de

crescerem como clulas individuais planctnicas. Isto porque os biofilmes podem prover um

grau de proteo e estabilidade em relao s mudanas do ambiente (Stoodley e Stoodley,

2004). Os principais fatores que favorecem o crescimento de biofilmes nos sistemas de

tratamento e distribuio de gua potvel so: fatores ambientais, presena de nutrientes,

interaes microbianas, material da tubulao, hidrulica do sistema, resduo desinfetante e

acumulao de sedimentos (EPA, 2002).

Temperaturas mais amenas facilitam o crescimento microbiano e diminuem a

eficincia dos desinfetantes. Outros fatores ambientais que afetam o desenvolvimento do

biofilme so turbidez da gua final e pH. A turbidez pode interferir com a desinfeco j que

as partculas podem proteger os patgenos adsorvidos a elas, impedindo que eles entrem emcontato com o desinfetante enquanto o pH influencia a efetividade dos desinfetantes ou

mesmo podem causar o destacamento dos coliformes dos biofilmes (EPA, 2002).

Os nutrientes tendem a se acumular na interface slido/lquido, criando um ambiente

favorvel para o crescimento do biofilme (Lechevallier, 1989). A acumulao de depsitos

nos sistemas gerada por muitos mecanismos, entre eles, a precipitao, floculao e

sedimentao de material durante o tratamento da gua ou corroso da superfcie da tubulao

(Batt et al., 2003).


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A ausncia ou presena de nutrientes especficos pode selecionar uma populao

microbiana, incluindo os patgenos. No entanto, alguns microorganismos, como a P.

aeruginosa, especialmente verstil em relao aos nutrientes orgnicos que ela pode usar

(WHO, 2002).

Alguns microorganismos oportunistas como L. pneumophila e patgenos primrios

como V. cholerae e E. coli 0157:H7 sobrevivem e at crescem dentro de certas amebas e

portanto, esto protegidos da desinfeco (Barker e Brown, 1994).

Em relao ao material da tubulao, alguns so especialmente favorveis ao

desenvolvimento de biofilme. Enquanto alguns provm um nicho onde o crescimento pode

ocorrer, outros provm nutrientes que mantm o crescimento microbiano (WHO, 2002). Atubulao antiga e de ferro, facilita a formao de tubrculos que so primariamente xidos de

ferro (Tuovinen et al., 1980) que adsorvem matria orgnica (Geldreich, 1996). O

sloughing dentro da coluna d`gua tambm pode ocorrer como resultado de um alto nvel

de biofilmes sobre a tubulao de ferro (Norton e Lechevallier, 2000).

Uma variedade de fatores relacionados hidrulica do sistema como longos tempos de

residncia devido a baixas taxas de fluxo ou tubulao em looping, altas taxas de fluxo, ou

mesmo taxas flutuantes de fluxo, podem influenciar a sobrevivncia e crescimento de

microorganismos em biofilmes. Uma velocidade muito elevada de gua na tubulao pode

aumentar o nvel de nutrientes e desinfetantes em contato com o biofilme, bem como causar o

despreendimento dos biofilmes que podem conter patgenos da superfcie da tubulao. A

reverso do fluxo tambm pode causar o espalhamento de biofilmes que por sua vez, levam

ao desprendimento de microorganismos dos biofilmes que podem se acumular em reas de

baixo fluxo (WHO, 2002).

Uma vez que o biofilme estabilizado, ele pode demandar uma alta taxa de cloro

residual (maior que 0,2 mg/L) para reduzir os nveis microbianos significativamente

(Lechevallier, 1989). No entanto, a manuteno de altos nveis de cloro pode ser complicada

pela necessidade de controlar os subprodutos e a corroso da tubulao e tambm os

problemas relacionados ao sabor e odor da gua (WHO, 2002).


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1.6 Doenas transmitidas pela gua

Muitas doenas esto relacionadas gua. De acordo com a causa, estas doenaspodem ser classificadas em quatro tipos (Maier et al., 2009):

Transmisso hdrica. Os microorganismos patognicos so de origem fecal; transmissopor ingesto.

Privao hdrica. Microorganismos de origem fecal; transmisso por contato devido falta de saneamento ou higiene.

Base hdrica. Organismos originrios da gua ou com parte do ciclo de vida na gua;transmisso por contato dos humanos com gua ou por inalao.

Criao hdrica. Microorganismos com ciclos de vida associados a insetos que vivem ouproliferam na gua.

A via de transmisso mais relevante das doenas de transmisso hdrica a fecal-oral.

Os microorganismos atingem a gua atravs das excretas de humanos ou outros animais

infectados e esta gua ao ser ingerida ou utilizada no preparo de alimentos, pode causar

distrbios gastrointestinais. Outras vias correspondem inalao e contato direto (Figura 2).

Figura 2 -Vias de transmisso de microorganismos patognicos

FONTE: WHO (2004)


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Os organismos que podem ser transmitidos pela via fecal-oral atravs da gua de

consumo humano esto listados na Tabela 1.

Tabela 1 - Patgenos de transmisso fecal-oral e sua significncia nos suprimentos de gua

potvel

FONTE: adaptado de WHO, 2004

(a) Perodo de deteco da forma infecciosa na gua a 20 C: baixa-at uma semana, moderada-1 semana a 1

ms, elevada>1 ms.

(b) Dose para causar infeco em 50% em voluntrios sadios

Patgeno Significncia

sanitria

Persistncia

na gua

Resistncia

ao cloro (a)

Dose

infectante

(b)

Reservatrio

animal

Bactrias

Campylobacter

jejuni

Alta Moderada Baixa Moderada Sim

E. coli

patognica

Alta Moderada Baixa Alta Sim

Salmonella

typhi

Alta Moderada Baixa Alta No

Outras

Salmonellae

Alta Prolongada Baixa Alta Sim

Shigellaspp. Alta Curta Baixa Moderada No

Vibrio cholerae Alta Curta Baixa Elevada No

Yersinia

enterocolitica

Alta Prolongada Baixa Elevada

(?)

No

Pseudomonas

aeruginosa

Moderada Pode

multiplicar-

se

Moderada Elevada

(?)

No

Aeromonas spp Moderada Pode

multiplicar-

se

Baixa Elevada

(?)

No


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1.6.1 Surtos de doenas de transmisso hdrica

Surtos causados por bactrias de transmisso hdrica continuam ocorrendo naatualidade, apesar de todos os aprimoramentos da tecnologia de tratamento de gua e de

desinfeco. Estes surtos no esto confinados a pases em desenvolvimento, onde a

infraestrutura de tratamento e distribuio de gua mais precria, mas ocorrem tambm em

pases desenvolvidos.

Em janeiro de 1991, uma epidemia de clera iniciada no Per, resultou em mais de

533.000 casos e 4700 mortes dentre 19 pases da Amrica do Sul. Na cidade de Trujillo, a

gua no era clorada e sua contaminao era comum (Swerdlow et al., 1992a). Outros fatoresque contriburam para o espalhamento da contaminao foram ligaes cruzadas irregulares, e

baixa e intermitente presso da gua na rede (WHO, 2004).

Outro grande surto ocorreu nos EUA, em 1992, em um pequeno povoado em

Missouri, onde havia um abastecimento de gua no clorada (Swerdlow et al., 1992b). O

microorganismo em questo foi a cepa enterohemorrgica E.coliO157:H7 que provocou 243

casos. Um estudo mostrou que durante o pico do surto, a diarria sanguinolenta ocorreu 18.2

vezes mais nas pessoas que viviam na cidade e que e que usavam a gua municipal do que nas

pessoas que viviam fora da cidade e utilizavam gua de fontes particulares. O nmero de

casos declinou quando os residentes foram ordenados a ferver a gua e a gua de

abastecimento foi clorada.

Em 2000, Walkerton, uma pequena cidade do Canad, sofreu um surto onde quase

metade da populao apresentou gastroenterite causando a morte de seis pessoas. Os

patgenos primeiramente identificados foram E. coli O157:H7 e Campylobacter jejuni

embora outros patgenos tambm estavam presentes. O surto foi atribudo contaminao de

um poo raso por esterco de gado de uma fazenda prxima seguida de um intenso perodo de

chuvas (Hrudey et al., 2003).

Embora P.aeruginosa no tenha sido conclusivamente relacionada em um surto de

veiculao hdrica, est muito relacionada a surtos em hospitais (EPA, 2002).

O caso clssico causado por L. pneumophila ocorreu em 1976 em Filadlfia, EUA.

Um surto de pneumonia acometeu a American Legion Conventione, por isso, a doena foi


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denominada Doena dos Legionrios. O microorganismo s foi identificado depois de uma

exaustiva investigao microbiolgica.

1.7 Crescimento de microorganismos nos sistemas tratamento e distribuio de guapotvel

Os sistemas de distribuio de gua potvel podem representar um hbitat favorvel ao

desenvolvimento dos microorganismos. Os principais fatores que controlam o crescimento

bacteriano neste ambiente so: temperatura, pH, oxignio, nutrientes, variaes hidrulicas e

caractersticas dos materiais.

O crescimento microbiano na superfcie das tubulaes da rede de distribuio pode

causar vrios problemas como corroso (Beech e Sunner, 2004), formao de biofilmes

(Camper, 2004) e a consequente persistncia dos patgenos (Emtiazi et al., 2004),

deteriorao da qualidade esttica da gua (sabor, odor e descolorao) e interferncia nos

mtodos utilizados para monitorar os parmetros de potabilidade da gua (WHO, 2004). Uma

vez que os microorganismos patognicos podem tambm estar presentes nos sistemas de

distribuio, isto se torna um problema de sade pblica, pois podem ocorrer surtos de

doenas de veiculao hdrica.

Nos sistemas de distribuio, a relao volume:superfcie drasticamente diferente

dos reatores e reservatrios; estima-se que 95% da biomassa presente nos sistemas esteja

aderida s paredes em contato prximo com a gua (Flemming et al., 2002), contribuindo para

a contaminao da mesma (Block, 1992).

1.7.1 Patgenos

Nos estudos dos patgenos nos sistemas de distribuio so analisados os seguintes

aspectos: monitoramento da qualidade higinica da gua, avaliao dos padres de

transmisso dos surtos de doenas de veiculao hdrica, esclarecimento das fontes

microbianas de contaminao e por fim, entendimento da emergncia de novosmicroorganismos patognicos (Brettar e Hfle, 2008).


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As maiores fontes de bactrias patognicas so o esgoto, principalmente o oriundo de

hospitais e o inadequadamente tratado das grandes reas urbanas (Brettar e Hfle, 2008).

A maioria das bactrias nos sistemas de distribuio ocorrem dentro de biofilmes(Szewzyk et al., 2000) e estes podem atuar como uma forma de proteo contra condies

ambientais extremas (September et al., 2007) para os patgenos alvo deste estudo. Sendo

assim, os biofilmes podem se tornar um reservatrio para o susbsequente espalhamento de

organismos patognicos (Camper et al., 1996).

Alm disso, patgenos que sobreviveram ao tratamento podem colonizar um biofilme

pr-existente, onde podem crescer e mais tarde serem liberados no fluxo de gua. Os

patgenos liberados na gua representam um risco aos consumidores (September et al., 2007).

A maioria dos microorganismos em biofilmes de gua potvel so bactrias Gram

negativas, particularmente patgenos oportunistas como Pseudomonas spp. Pseudomonas

aeruginosa sensvel desinfeco e sua entrada no sistema de distribuio pode ser

minimizada por desinfeco adequada, medidas de controle de crescimento de biofilmes

restrio do tempo de residncia da gua no sistema e manuteno dos resduos desinfetantes

(WHO, 2006).

September et al. (2007) coletaram amostras de biofilme de sistemas de distribuio

assim como de reservatrios domsticos na frica do Sul a fim de determinar a prevalncia de

patgenos, dentre eles:Aeromonas,E.coli,Pseudomonas, Salmonella, Shigellae Vibrio. Estes

microorganismos foram selecionados com base na anlise da qualidade da gua bruta nos

mananciais de abastecimento. Os autores concluram que os sistemas de distribuio menores

apresentam nmeros maiores de patgenos do que os grandes sistemas. Outra concluso

importante foi a constatao da inadequao dos meios seletivos utilizados; nenhuma dasamostras putativas de Salmonella e Shigellapuderam ser confirmadas, indicando que estes

patgenos no podem ser recuperados por mtodos de cultivo em se tratando de biofilmes

relacionados aos sistemas de distribuio.

Legionella spp. tambm um patgeno tipicamente encontrado em biofilmes e em

sistemas de distribuio j que muito resistente ao cloro (Maier et al., 2009). Como os

biofilmes demonstram ser um fator importante no crescimento de Legionellanos ambientes

de gua potvel (Rogers e Keevil, 1992), medidas de controle do crescimento dos biofilmesassim como controle da temperatura podem minimizar o risco de infeco por este


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microorganismo. De acordo com Steinert et al. (1998),Acanthamoeba polyphagapode conter

altos nveis de L. pneumophila, protegendo as clulas contra os desinfetantes. Havendo

depleo do desinfetante, pode ocorrer a recolonizao dos biofilmes pelos patgenos que

estavam protegidos na ameba (Thomas et al, 2004).

Geralmente as espcies de Klebsiella detectadas em gua potvel so organismos

localizados em biofilmes, porm estes no representam um risco sade, pois so organismos

razoavelmente sensveis aos desinfetantes e sua entrada nos sistemas de distribuio pode ser

prevenida pelo tratamento adequado da gua (WHO, 2006).

Embora Shaphylococcus aureus possa ocorrer nos sistemas de distribuio, no h

evidncia de transmisso atravs do consumo de gua potvel. Apesar de ser altamenteresistente aos resduos de cloro, sua presena na gua controlada por tratamentos

convencionais e processos de desinfeco

A habilidade de Aeromonas sp crescer e sobreviver na gua potvel, tem sido

demonstrada em diversos estudos devido ao potencial de se desenvolver em biofilmes (Sen e

Rodgers, 2004). Havelaar et al. (1990), reportaram o recrescimento na maior parte do sistema

de distribuio analisado.

Resultados baseados em estudos de laboratrio sugerem que os biofilmes representam

um mecanismo eficaz de persistncia das espcies de Vibrio no ambiente. Uma pesquisa

epidemiolgica e ecolgica no ecossistema da costa da baa de Bengala produziu evidncias

de que Vibrio choleraeO1 em estado no cultivvel, estava presente em biofilmes coletados

de corpos d`gua que serviam de fonte de gua potvel para uma rea de Bangladesh onde

surtos de clera ocorrem anualmente (Alam et al., 2006).

Estudos recentes tm reportado a sobrevivncia de Campylobacterspp. em biofilmes

(Buswell et al., 1998). A deteco deCampylobacter jejuni na gua problemtica devido aos

baixos nmeros e ao crescimento lento do organismo. As tcnicas de cultivo apresentam

falhas no que diz respeito ao isolamento de microorganismos de amostras provenientes de

guas contaminadas que possam ser a causa de epidemias recorrendo-se, portanto, aos

mtodos moleculares (Ferreira Miguel, 2007).


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1.7.1.1Shigella spp.

Pertencentes famlia Enterobacteriacea, so bacilos Gram negativos, no mteis,que crescem tanto na presena quanto na ausncia de oxignio. Os membros deste gnero

possuem um padro antignico complexo e so divididos em 4 espcies: S. flexneri, S. sonnei,

S. dysenteriae e S. boydii (WHO, 2006). Shigellaspp. um gnero muito relacionado E.

coli, no entanto as espcies de Shigellaso geralmente patognicas ao homem podendo causar

uma gastroenterite grave (Madigan, 2004).

geralmente encontrada em guas poludas com esgoto humano e transmitida pela

rota fecal-oral (Maier, 2009).

Sua presena em gua potvel sugere contaminao recente uma vez que so

particularmente instveis em ambientes aquticos e so sensveis desinfeco. E. coli um

ndice adequado indicao da presena de Shigella spp. nos sistemas de abastecimento de

gua potvel.

1.6.1.2Salmonell a spp.

Salmonella um grande grupo de bacilos, Gram negativos, no mteis, que no

fermentam a lactose, mas produzem gs ou H2S a partir da fermentao de carboidratos.

Compreendem mais de 2000 sorotipos conhecidos que so membros da famlia

Enterobacteriaceae. Todos os sorotipos so patognicos a humanos e podem causar uma srie

de sintomas variando desde uma gastroenterite branda a uma doena severa ou mesmo morte

(Maier, 2009).

Est amplamente distribuda no ambiente e particularmente S. typhi e paratyphi so

restritas a humanos, embora S. paratyphi possa ser raramente encontrado em animais

domsticos. Os patgenos tipicamente entram no sistema de distribuio de gua potvel

atravs da contaminao fecal por descargas de esgotos, de gado e animais selvagens, sendo a

rota de transmisso fecal oral. Esta transmisso, mais comumente envolvendo S. typhimurium,

tem sido associada com o consumo de gua subterrnea e abastecimento de guas superficiaiscontaminados (WHO, 2006).


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Salmonellaspp. relativamente sensvel desinfeco e E.coli um ndice adequado

para a indicao da presena de salmonelas em sistemas de fornecimento de gua potvel

(WHO, 2006).

1.7.1.3Aeromonas spp.

Aeromonasspp. so bacilos anaerbios facultativos no formadores de esporos, Gram-

negativos e pertencentes famlia Aeromonadacae. As espcies mais importantes para a

sade humana so A.hydrofila, A. caviae, A. veronii subsp. sobria, A. jandaei, A.veronii

subsp. veronii andA. schubertii (CETESB, 2009).

So geralmente encontradas em guas doces e tm sido detectadas em sistemas de

distribuio, porm os dados disponveis no so suficientes para comprovar sua transmisso

hdrica. Medidas de controle para otimizar a remoo de carbono orgnico, restrio do tempo

de residncia na gua do sistema de distribuio e manuteno dos resduos desinfetantes,

podem limitar o crescimento desta bactria neste ambiente (WHO, 2006).

Tem sido considerada problemtica uma vez que pode gerar resultados falsos positivos

na contagem de coliformes e, por isso, a E. colino um ndice adequado para indicar sua

presena (WHO, 2006).

1.7.1.4Pseudomonas aeruginosa

um bacilo Gram negativo, aerbio, no esporulante e membro da famlia

Pseudomonadacea.Algumas linhagens produzem um pigmento no fluorescente denominado

piocianina enquanto outras adicionalmente produzem um pigmento fluorescente verde, a

pioverdina. Pseudomonas aeruginosa, assim como outras linhagens fluorescentes, produz

catalase, oxidase e amnia a partir de degradao da arginina e pode crescer com citrato como

fonte de carbono (Madigan, 2004).

Por ser um microorganismo ubquo, pode ser isolado de diversas fontes, inclusive deambientes hospitalares, sistemas de aquecimento de gua e piscinas. Raramente causa doenas


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em indivduos saudveis, mas o patgeno oportunista que mais causa infeces em

indivduos imunocomprometidos e vtimas de queimaduras e geralmente causa infeces nos

olhos e sistema respiratrio. Numerosos casos de foliculite, dermatite e infeces do trato

urinrio foram reportados devido P.aeruginosa associada gua de piscina contaminada

(Maier et al., 2009). Trata-se de organismo extremamente resistentes maioria dos

antibiticos pela transferncia de plasmdeos de resistncia (Madigan, 2004).

Apesar da ingesto no ser uma fonte importante de infeco, a presena de altos

nmeros em gua potvel pode estar relacionada com queixas em relao ao sabor, odor e

turbidez. sensvel desinfeco e medidas de controle do crescimento de biofilmes

incluindo tratamento para otimizao da remoo do carbono orgnico, reduo de tempo de

residncia da gua nos sistemas de distribuio e manuteno dos resduos desinfetantes

dever reduzir o crescimento deste microorganismo. Por ser um microorganismo comum no

ambiente,E. colino adequada para detectar sua presena (WHO, 2006).

1.7.1.5Staphylococcus aureus

Este gnero de coco Gram positivo, no esporulante, aerbio, catalase positivo

relativamente resistentes a potenciais de gua reduzidos , exibindo tolerncia ao dessecamento

e s condies de alta salinidade (Madigan, 2004).

Apesar de S.aureusser membro da flora microbiana normal da pele humana, pode ser

liberado por contato humano em ambientes aquticos e tambm tem sido detectado em gua

potvel (WHO, 2006).

O contato com as mos a via mais comum de transmisso e no existem relatos de

transmisso de doena pela ingesto de gua contaminada. Como o microorganismo no

originado de material fecal, a E. coli no uma indicadora adequada de sua presena

(CETESB, 2009).


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1.7.1.6Campylobacter spp.

Campylobacter spp. um bacilo curvado e espiral com um flagelo polar

desembainhado, Gram negativo e microaeroflico.

frequentemente isolado de gado saudvel, frangos e aves e, portanto, carne e leite

no pasteurizado so importantes fontes de infeco. gua potvel contaminada tem sido

implicada como fonte de organismos em surtos (WHO, 2006).

Medidas de controle podem ser aplicadas para gerenciar o risco potencial de

Campylobacter spp. incluindo proteo das guas brutas de dejetos animais e humanos,

tratamento adequado e proteo da gua durante a distribuio. Os estoques de guas tratadas

e desinfectadas devem ser protegidos das fezes de aves. Campylobacterspp. so patgenos de

origem fecal e no so particularmente resistentes desinfeco. Deste modo, a E.coli um

indicador apropriado da presena/ausncia de Campylobacterspp. nos suprimentos de gua

potvel (WHO, 2006).

1.7.1.7Legionell a spp.

Legionellaspp, um gnero pertencente famliaLegionellaceae , e que compreende

bacilos Gram negativos, no formadores de esporos e que requerem L cistena para o

crescimento. So heterotrficas encontradas em ambientes aquticos e podem proliferar a

temperaturas acima de 25 C (WHO, 2006).

No mnimo 40 espcies de legionelas tm sido relacionadas a doenas, mas a espciemais proeminente L. pneumophila. o agente causador da febre Pontiac (casos brandos e

autolimitantes) e doenas dos legionrios (infeces com pneumonia). A rota mais comum de

infeco a inalao de aerossis sendo a aspirao identificada como rota em alguns casos.

No h evidncia de transmisso intrapessoal (WHO, 2006).

Este microorganismo est associado ao ambiente aqutico tanto natural como artificial

e tem sido isolado de gua potvel, gua subterrnea e superficial. Muitos autores tm isolado

Legionella spp. de ambientes artificiais como reservatrios de torres de resfriamento,


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condensadores evaporativos, aquecedores de gua, chuveiros etc (Kim et al., 2002; Mampel et

al., 2006; Pereira et al., 1990).

Esta bactria pode ser de vida livre, planctnica, estar associada a biofilmes ou aindaser parasita intracelular de protozorios (Carvalho et al., 2007). Estes protozorios podem

providenciar um ambiente intracelular para a multiplicao bem como manuteno e seleo

de cepas virulentas (Lau e Ashbolt, 2009). Legionella spp. pode se desenvolver em pelo

menos 20 espcies de amebas, duas espcies de protozorios ciliados e uma espcie de bolor

(Lau e Ashbolt, 2009).

Legionellaspp. no detectada por tcnicas de isolamento de heterotrficas e E. coli

no um ndice adequado para indicar presena deste organismo.

1.7.1.8Linhagens patognicas deEscherichi a coli

E.coli est presente em grandes nmeros na microbiota intestinal de humanos e

animais de sangue quente onde geralmente no causa danos. Entretanto, em algumas partes do

corpo, pode causar doenas graves como infeces do trato urinrio, bacteremia e meningite.

Um nmero limitado de linhagens enteropatognicas pode causar diarria aguda. Muitas

classes de E.coli enteropatognicas tm sido identificadas com base na diferenciao dos

fatores de virulncia incluindo E. colienterohemorrgica (EHEC), enterotoxignica (ETEC),

enteropatognica (EPEC), enteroinvasiva (EIEC), enteroagregativa (EAEC) e por fim,

difusamente aderente DAEC (CETESB, 2009).

Para todas, o via de trasmisso fecal-oral (Maier et al. 2004) e podem causar desdeuma diarria at colite hemorrgica ou disenteria.

A transmisso pela gua das E.coli enteropatognicas tm sido documentadas para

guas recreacionais e gua potvel contaminada. Em sistemas de distribuio, medidas de

controle podem ser aplicadas para gerenciar o risco potencial incluindo proteo da gua bruta

dos dejetos de animais e humanos, tratamento adequado e proteo da gua durante a

distribuio.


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1.7.1.9Vibrio spp.

O grupo Vibrio composto de bacilos Gram negativos aerbios facultativos e bacilos

curvos com metabolismo fermentativo, sendo que a maioria apresenta flagelos polares

(Madigan, 2004). So classificados de acordo com o antgeno O, destacando-se os sorotipos

O1 e O139 de V. choleraeque causam clera (CETESB, 2009).

O sorotipo O1 ainda dividido em dois biotipos, o clssico e o El Tor. Os humanos

so os nicos hospedeiros naturais conhecidos, embora reservatrios ambientais podem

existir, aparentemente em associao com coppodos e fitoplanctn (Maier, 2004).

A clera tipicamente transmitida pela rota fecal-oral e predominantemente

contrada pela ingesto de gua ou alimentos contaminados por fezes, disseminando-se

rapidamente nos locais onde as condies sanitrias so inadequadas (CETESB, 2009).

V. cholerae altamente sensvel aos processos de desinfeco. Os sorotipos O1 e no-

O1 tm sido detectados na ausncia deE.colie, portanto, este no um ndice adequado para

vibrios em gua potvel (WHO, 2006).

1.7.1.10Klebsiella spp.

Klebsiella spp., so bacilos Gram negativos, no mteis que pertencem famlia

Enterobacteriaceae. Aproximadamente 60-80 % de todas as Klebsiella spp. isoladas de fezes

ou espcimes clnicas, so K. pneumoniae. K. oxytoca tambm tem sido identifiada como

patognica. No considerada uma fonte de doena gastrointestinal pela ingesto de guapotvel, mas pode causar infeces nosocomiais por causa da colonizao de torneiras (WHO,

2006)

Klebsiella spp. capaz de sobreviver e at crescer em biofilmes de sistemas de

tratamento de gua potvel e tanques de armazenamento (LeChevallier, 1987).

Como Klebsiella spp. um coliforme, pode ser detectado por mtodos tradicionais

para coliformes totais (WHO, 2006).


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5 CONCLUSES

Apesar da deteco dos coliformes totais e termotolerantes serem o principal alvo nos

programas de monitoramento, tambm deve ser dada ateno aos microorganismos

patognicos e populao geral de microorganismos visto que alguns deles so patgenos

oportunistas. Alm disso, a E. coli no um ndice adequado para indicar a presena da

maioria dos microorganismos deste estudo.

Os meios seletivos para testes presuntivos no se mostraram confiveis uma vez que

muitas amostras presuntivas no foram confirmadas por PCR ou teste bioqumico especfico.

Como algumas bactrias podem entrar em estado vivel, mas no cultivvel, osresultados dependentes de cultivo devem ser complementados com mtodos que no

dependam de cultura.

A desagregao se mostrou eficiente na homogeneizao das amostras de biofilme

afetando muito pouco a viabilidade das clulas.

A tcnica de PCR se mostrou sensvel deteco de DNA em baixas concentraes.

Para a extrao de DNA, as bactrias Gram negativas, com exceo de S. flexneri, o mtodo

de choque trmico teve um maior rendimento de cido nuclico.

Devido ao alto nmero de deteco de bactrias potencialmente patognicas, os

biofilmes possivelmente servem como reservatrio de patgenos. Muitos destes organismos

podem persistir nos biofilmes e serem liberados na gua, representando um problema de

sade pblica que deve ser includo na avaliao de risco aplicado aos patgenos relacionados

gua. No entanto, os resultados no so ainda conclusivos uma vez que o seqenciamento

no foi realizado.


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