LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DASAR

KI-3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK

Percobaan 8

INDUKSI β-GALAKTOSIDASE

Nama : Nisrina Rizkia

NIM : 10510002

Kelompok : 6

Tanggal Percobaan : 04 April 2013

Tanggal Laporan : 11 April 2013

Asisten Praktikum : Ka Aisyah

LABORATORIUM BIOKIMIAPROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2013

INDUKSI β-GALAKTOSIDASE

I. Tujuan

Menentukan aktivitas enzim β-galaktosidase secara kolorimetri.

II. Dasar Teori

Enzim β-galaktosidase adalah enzim hidrolase yang berfungsi untuk

mempercepat reaksi konversi dari galaktosida menjadi galaktosa, seperti laktosa

menjadi monosakarida yaitu galaktosa dan glukosa. Sintesis β-galaktosidase

dikendalikan oleh sistem pengendalian ekspresi genetik yaitu lac operon. Operon

adalah unit DNA genomik yang terdiri dari kluster gen yang berfungsi di bawah

kontrol promotor atau suatu sinyal tunggal. Lac operon adalah operon yang

mengendalikan ekspresi gen-gen untuk transpor dan metabolisme laktosa.

Aktivitas β-galaktosidase dapat ditentukan secara kolorimetri untuk mempelajari

ekspresi gen pada sistem lac-operon. ONPG (orto-nitrofenil- β-D-galaktopiranosida)

digunakan sebagai substrat pengganti laktosa. ONPG adalah senyawa yang tidak

berwarna, adanya aktivitas β-galaktosidase ditunjukkan dengan adanya warna kuning

karena terbentuknya ONP (orto-nitrofenol) dan memiliki serapan maksimum pada 420

nm.

III. Data Pengamatan

Pengukuran Optical Density (OD) pada λ = 600 nm

Sampel Absorbansi

NB 0.53

NB + Laktosa 0.537

NB + Glukosa + Laktosa 0.712

NB + Glukosa 0.414

NB + Sukrosa 0.536

NB + Maltosa 0.535

Absorban dari berbagai media

SampelAbsorban pada T tertentu (λ = 420 nm)

0 10 20 30 40

NB 0.131 0.136 0.355 0.340 0.287

NB + Laktosa 0.043 0.193 0.334 0.120 0.162

NB + Glukosa + Laktosa 0.027 0.202 0.342 0.264 0.379

NB + Glukosa 0.045 0.087 0.123 0.082 0.169

NB + Sukrosa 0.050 0.089 0.210 0.184 0.268

NB + Maltosa 0.083 0.107 0.236 0.237 0.136

IV. Perhitungan dan Pengolahan Data

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450

0.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

Kurva Absorban Vs Waktu

NBNB+laktosaNB+glukosa+laktosaNB+glukosaNB+sukrosaNB+maltosa

t (menit)

Abso

rban

Aktivitas enzim = A 420

t inkubasi xVolume xOD600

Misal tabung pertama untuk kultur NB dengan waktu inkubasi 10

Aktivitas enzim = 0.136

10 x 0.00167 x 0.53 = 15.37 menit-1 L-1

Dengan cara yang sama dapat diperoleh hasil sebagai berikut :

SampelAktivitas Enzim (menit-1 L-1)

0 10 20 30 40

NB 0 15.37 20.05 12.80 8.11

NB + Laktosa 0 21.52 18.62 4.46 4.52

NB + Glukosa + Laktosa 0 16.99 14.38 7.40 7.97

NB + Glukosa 0 12.58 8.90 3.95 6.11

NB + Sukrosa 0 9.94 11.73 6.85 7.49

NB + Maltosa 0 11.98 13.21 8.84 3.81

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450

5

10

15

20

25

Aktivitas Enzim Beta-Galaktosidase

NBNB+laktosaNB+laktosa+glukosaNB+glukosaNB+sukrosaNB+maltosa

t (menit)

Aktiv

itas e

nzim

men

it-1

L-1

V. Pembahasan

Operon adalah sekumpulan gen yang diapit oleh sepasang terminator dan promoter,

produk-produknya memiliki fungsi-fungsi yang berhubungan dan ditranskripsi bersama-sama

sebagai suatu kesatuan. Daerah operon adalah daerah yang berperan dalam regulasi ekspresi

gen. Contohnya saja operon lac yaitu operon yang mengendalikan kemampuan metabolism

laktosa pada bakteri E.Coli. Dalam operon lac terdapat tiga macam gen structural yang

mengkode protein yang berbeda yaitu gen Z untuk mengkode β-galaktosidase yang akan

menghidrolisis lakosa menjadi glukosa dan galaktosa, gen Y untuk mengkode permease yang

akan membawa laktosa ke dalam sel dan gen A untuk mengkode transasetilase yang akan

mentransfer gugus asetil dari acetyl-CoA ke β-galaktosidase. Masing-masing gen structural

tersebut mempunyai kodon inisiasi dan terminasi yang berbeda-beda, namun ekspresinya

dikendalikan oleh satu promoter yang sama. Saat transkripsi, operon lac menghasilkan satu

mRNA yang membawa kode-kode genetik untuk tiga macam polipeptida yang berbeda.

Ketiga gen struktural tersebut diatur ekspresinya oleh satu promoter yang sama (p). Operator

adalah bagian dari promoter tempat penempelan protein repressor yang dikode oleh gen I

(Warianto, 2011). Operon lac dibutuhkan dalam transport dan metabolism dari laktosa pada

E.coli dan berbagai macam bakteri lainnya. Operon diregulasi oleh adanya glukosa dan

laktosa. Gen structural akan aktif apabila ada induksi dari laktosa. Bila tidak adanya laktosa,

gen lac I akan menghasilkan protein repressor yang mengikat operator lac dan mencegah

terjadinya transkripsi karena RNA polimerase tidak lagi mengikat. Akan tetapi, saat aktossa

ditambahkan, repressor lac I akan terlepas karena terikat pada alolaktosa lalu transkripsi

ketiga gen structural akan berjalan (Joung, 2000).

Aktivitas operon dikendalikan oleh system regulasi positif dan negative. Pengendalian

positif pada suatu operon adalah operon dapat diaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator.

Sedangkan pengendalian negatif adalah operon dinonaktifkan oleh produk ekspresi gen

regulator. Terdapat dua macam produk gen regulator yaitu aktivator yang berperan dalam

pengendalian positif dan repressor yang berperan dalam pengendalian neagatif. Pengikatan

aktivator atau repressor pada promoter ditentukan oleh keberadaan suatu molekul efektor

yang biasanya merupakan molekul kecil. Molekul efektor yang mengaktifkan ekspresi suatu

gen disebut induser dan yang bersifat menekan ekspresi suatu gen disebut repressor. Pada

keadaan tidak ada laktosa, repressor lac akan berada dalam konfigurasi aktifnya. Sedangkan,

apabia terdapat laktosa, alolaktosa akan mengikatkan diri pada repressor lac dan mengubah

konformasinya, menghilangkan repressor untuk mengikatkan diri pada operator. Operator lac

akan menghasilkan mRNA untuk enzim-enzim jalur laktosa, hal tersebut dapat dilihat pada

gambar 1 dan 2.

Gambar 1. Pengaruh adanya laktosa Gambar 2. Pengaruh tidak adanya laktosa

Enzim β-galaktosidase dapat disintesis dalam jumlah yang layak, apabila terdapat laktosa

dan rendahnya glukosa. E.coli dapat mengetahui konsentrasi glukosa dengan mengandalkan

interaksi antara protein pengatur alosteik dengan suatu molekul organik yang berukuran kecil.

Molekul kecil tersebut adalah AMP siklik (cAMP) dan akan berakumulasi bila tidak ada glukosa.

Protein yang mengatur hal tersebut adalah protein repressor cAMP (cAMP reseptor protein atau

CRP) yang merupakan aktivator transkripsi. Ketika cAMP terikat pada CRP, protein akan

berubah ke bentuk aktifnya dan mengikatkan diri pada tempat tertentu di sebelah promoter lac.

Penempelan CRP pada DNA membuat RNA polymerase mudah terikat pada promoter dan

memulai proses transkripsi operon. Apabila jumlah glukosa meningkat maka cAMP akan

menurun dan CRP akan lepas dari operon lac. Keadaan dari repressor lac akan menentukan ada

atau tidaknya transkripsi gen operon lac. Kondisi CRP akan mengontrol laju transkripsi apabila

opero bebas dari repressor.

Pada percobaan ini dilakukan penentuan aktivitas β-galaktosidase yang diinduksi oleh

berbagai jenis gula. Medium yang digunakan ditambahkan dengan berbagai jenis gula, dalam

praktikum kali ini adalah NB, NB + laktosa, NB + glukosa + laktosa, NB + glukosa, NB +

sukrosa dan NB + maltosa. Sebelumnya medium yang sudah ditambahkan berbagai jenis gula ini

disentrifugasi untuk mengendapkan bakteri dan memisahkannya dari media. Buffer Z untuk

mencuci sisa media yang masih ada, sentrifuga dilakukan beberapa kali agar bakteri dapat

terpisahkan dengan baik. Kloroform berfungsi untuk mengekstrak komponen sel yang sudah

tidak dibutuhkan. SDS untuk merusak membrane sel agar terjadi proses lisis sel. Setelah itu

diinkubasi pada suhu 37oC karena suhu optimum untuk kerja β-galaktosidase. Penambahan

ONPG (orthonitrofenil-β-galaktopiranosida) digunakan sebagai substrat. Lalu diinkubasi untuk

mengoptimumkan kerja enzim dan kemudian ditambahkan Na2CO3, Na2CO3 bersifat basa dan

akan mengubah pH larutan, sehingga kerja enzim terganggu dan aktivitasnya akan menurun.

Penyimpanan dalam es pun akan membuat enzim tidak bekerja. Setelah itu disentrifugasi, dan

akan didapatkan fasa ONP hasil hidrolisis dan fasa organik (kloroform dan SDS). Kemudian

diukur absorban dari cairan tersebut dan jangan sampai fasa organik terambil dalam pengukuran.

Pada pengukuran untuk waktu nol menit, didapatkan absorbansi yang tidak nol untuk

semua tabung dengan berbagai media. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh lamanya

penambahan Na2CO3 dan penyimpanan dalam es, dan enzim sudah menunjukkan aktivitasnya

tanpa adanya inkubasi terlebuh dahulu. Pada tabung pertama yang hanya berisi NB. Akibatnya

bakteri akan memiliki sedikit ATP namun molekul cAMP akan banyak. cAMP akan mengikat

protein CRP dan akan menginduksi pengikatan RNA polimerase. Proses transkripsi akan

berjalan dengan lancar, sehingga absorbannya semakin lama semakin meningkat, namun ternyata

dari data yang diperoleh ada penurunan nilai absorban. Pada tabung kedua, di mana medium

ditambahkan dengan laktosa seharusnya menunjukkan absorban yang paling tinggi di antara

yang lain karena laktosa berperan sebagai induser sehingga ONP lebih banyak terbentuk. ATP

yang dihasilkan sedikit dan jumlah cAMP cukup banyak dan dapat mengikat CRP dan

menginduksi RNA polimerase. Pada tabung ketiga, medium ditambahkan dengan glukosa dan

laktosa. Terdapat laktosa yang berperan sebagai induser namun karena adanya glukosa maka

jumlah ATP akan lebih banyak dibandingkan dengan hanya laktosa saja. Kompleks CRP-cAMP

hanya sedikit sehingga pengikatan RNA polymerase tidak diindukksi. Tanskripsi yang terjadi

akan mengalami penurunan dan ONP yang terbentuk akan menjadi sedikit. Pada tabung

keempat, gula yang ditambahkan adalah glukosa, glukosa sangat mudah untuk menghasilkan

ATP. Jumlah ATP akan banyak dan jumlah cAMP akan sedikit, sehingga pengikatan RNA

polymerase menurun dan transkripsi juga menurun. Repressor pun akan mengikat operator dan

mengganggu proses transkripsi β-galaktosidase. Pada tabung kelima digunakan sukrosa yang

merupakan disakarida sehingga ATP yang akan dihasilkan sedikit, kompleks cAMP-CRP akan

menjadi banyak sehingga pengikatan RNA polimerase terinduksi. Pada tabung keenam, gula

yang ditambahkan adalah maltose, maltose adalah disakarida dan sulit untuk menghasilkan ATP

dibandingkan dengan glukosa, sehingga jumpah cAMP cukup banyak, transkripsi akan

meningkat.

Dari hasil percobaan kali ini maka didapatkan beberapa aktivitas β-galaktosidase, tabung

dengan menggunakan laktosa memberikan aktivitas yang besar dan aktivitas paling kecil

didapatkan untuk tabung dengan penambahan glukosa terlihat pada grafik tren yang dihasilkan

terdapat penurunan aktivitas yang cukup signifikan. Pada percobaan kali ini tren data yang

didapatkan sangatlah buruk, terjadi naik turun absorban pada setiap tabung. Pada tabung pertama

tanpa inkubasi pun seharusnya absorban nya nol. Diantara semua tabung seharusnya tabung

dengan laktosa yang memiliki absorban paling besar yaitu tepatnya pada waktu inkubasi 40

menit. Namun, ternyata absorban terbesar diperoleh untuk glukosa dan laktosa pada menit ke 40.

Hal tersebut sangat jauh berbeda, beberapa kesalahan yang dimungkinkan terjadi adalah selang

waktu penambahan ONPG dan waktu penyetopan reaksi tidak tepat sehingga reaksi melebihi

atau kurang dari yang seharusnya serta kuvet yang digunakan sebaiknya adalah kuvet kuarsa

karena memilki kualitas yang lebih baik dibandingkan kuvet yang digunakan.

Selain operon lac terdapat juga operon triptofan, triptofan lac terdiri dari lima gen

strukturan yang diperlukan untuk konversi asam chorismic enjadi triptofan, lima gen structural

tersebut adalah antrhanilate syntetase (komponen I yang dikode oleh trpE dan komponen II yang

dikode oleh trpD), N-(5′-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase/Indole-3-glycerol phosphate

synthase yang disandikan oleh trpC, Tryptophan synthase (β-subunit yang disandikan

oleh trpBI dan α-subunit yang disandikan oleh trpA).

Gambar 3. Trp operon

VI. Kesimpulan

SampelAktivitas Enzim (menit-1 L-1)

0 10 20 30 40

NB 0 15.37 20.05 12.80 8.11

NB + Laktosa 0 21.52 18.62 4.46 4.52

NB + Glukosa + Laktosa 0 16.99 14.38 7.40 7.97

NB + Glukosa 0 12.58 8.90 3.95 6.11

NB + Sukrosa 0 9.94 11.73 6.85 7.49

NB + Maltosa 0 11.98 13.21 8.84 3.81

VII. Daftar Pustaka

J.H. Miller in, Experiment in Molecular Genetics, 1972 Cold Spring Harbor

Laboratories p.352-355

Joung J, Ramm E, Pabo C (2000). A bacterial two-hybrid selection system for studying

protein-DNA and protein-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA 97

(13): 7382–7.

Warianto, Chaidar, 2011, Transkripsi pada Prokariotik, Universitas Airlangga.