BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Didalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam

skala laboratorium.Yang melatar belakangi praktikum pembuatan biakan murni ini

yaitu, populasi mikroba yang ada dialam sekitar kita ini sangatlah besar dan cukup

kompleks. Banyaknya spesies mikroba menguasai setiap tubuh kita, alam disekitar kita

baik itu tanah, air maupun udara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme. Penelitian

yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik

untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini atau biasa dikenal dengan biakan

campuran. Menjadi spesies yang berbeda-beda yang dikenal dengan istilah biakan

murni. Biakan murni ini berawal dari satu populasi sel saja yang semuanya berasal dari

satu sel induk. (Pelczar, 1988)

Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah dan udara substrat yang

berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganisme dapat berupa bakteri,

jamur dan lain-lain. Populasi dari mikroba yang ada dilingkungan ini sangatlah

beraneka ragam sehingga dalam mengisolasi diperlukan tahap penanaman sehingga

berhasil diperoleh koloni yang tunggal pemindahan bakteri dari medium yang lama ke

medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri memerlukan

beberapa ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan alat-alat yang akan

digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar-benar steril. Hal

ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi yaitu masuknya mikroba lain yang tidak

diinginkan sehingga biakan yang tumbuh didalam medium adalah benar-benar biakan

murni (Dwidjoseputro, 2005).

Pemindahan bakteri dari media yang lama ke media yang baru atau yang dikenal dengan

istilah inokulasi bakteri memerlukan beberapa ketelitian. Terlebih dahulu kita harus

mengusahakan alat-alat yang akan digunakan untuk pengerjaan media dan pengerjaan

inokulasi benar-benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi yaitu

masuknya mikroba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam

media adalah benar-benar biakan murni karena dalam keadaan yang sebenarnya, dapat

dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri dan terlepas dari spesies

yang lainnya. untuk memudahkan pemeriksaan pada bakteri ataupun juga jamur,

perlulah diadakan pemiaraan atau biakan murni, sehingga saat diperlukan pada waktu-

waktu tertentu, bakteri itu selalu tersedia (Dwidjoseputro, 2005).

Didalam keadaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup

secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri patogen

kedapatan bersama-sama dengan bakteri saprob.

Oleh karena itu, praktikum pembuatan biakan murni kali ini dilakukan agar praktikan

dapat mengetahui dan memahami teknik-teknik atau cara dalam pembuatan biakan

murni yang benar dan tepat khususnya teknik pembuatan biakan murni menggunakan

metode cawan gores (streak plate) agar terlihat pertumbuhan yang jelas dari bakteri dan

jamur biakan murni yang dikehendaki setelah diinkubasi selama 24 jam.

1.2 Tujuan Praktikum

a.  Untuk mengetahui yang dimaksud dengan biakan murni

b. Untuk mengetahui prinsip dari biakan murni

c. Untuk mengetahui macam-macam teknik dasar streak pada metode cawan gores

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Pembiakan adalah proses memperbanyak mikroorganisme dengan memberikan keadaan

lingkungan yang tepat. Menumbuhkan mikroorganisme adalah membuat replika dari

mikroorganisme tersebut, dan memerlukan unsur-unsur yang ada dalam komposisi

kimianya. Zat makanan harus meyediakan unsur-unsur tersebut dalam bentuk yang

dapat diakses secara metabolik. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri satu

populasi jenis mikroba yang berasal dari satu sel induk. Isolasi bakteri artinya

memisahkan satu jenis bakteri dari biakan campuran menjadi biakan murni. Persyaratan

utama bagi isolasi dan kultuvasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk

pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofag yang paling baik dan paling

utama adalah habitat inangnya. Sebagai contoh fage coli yang dijumpai di dalam

pencernaan dapat diisolosi dari limbah atu pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan

sentrifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh

sel-sel bakterinya. Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir

dengan metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta

micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah teknik

cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama

yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies dapat

dipisahkan (Dwijoseputro, 1990).

Mikroorganisme dibiakan di laboratorium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya

pemilihan medium yang dipakai bargantung pada banyak faktor seperti apa jenis

mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar

dapat tetap dipertahankan harus mengandung sema zat makanan yang diperlukan oleh

mikroorganisme tersebut. Faktor lain seperti pH, suhu, dan pendimginan harus

dikendalikan dengan baik (Dwijoseputro, 1990).

Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain seperti tempat untuk

mengisolasi, seleksi, evaluasi dan differensiasi biakan yang didapatkan. Agar tiap-tiap

medium memiliki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga seringkali

digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan

dan perkembangbiakan mikroba.

Beberapa Indikasi pembiakan bakteri pada laboratorium mikrobiologi meliputi

1. Pengasingan (Isolasi) mikroba pada biakan bakteri.

2. Menunjukkan sifat khas mikroba

3. Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu

4. Untuk mendapatkan bahan bakteri yang cukup untuk membuat antigen dan

percobaan serologi lainya

5. Menentukan kepekan kuman trhadap antibiotik

6. Menghitung jmlah kuman

7. Mempertahankan biakan mikroba

(Dwijoseputro, 1990).

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan

bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang

sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan

agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini

agar menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1990).

Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman

bakteri (inokulasi) yaitu :

1.    Menyiapkan ruangan

Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar

tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan. Dalam labotarium

pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah

kotak kaca (encast ) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan

melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet.

2.    Pemindahan dengan dengan pipet

Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk

diambil1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni.

3.   Pemindahan dengan kawat inokulasi

Kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel. Ujungnya boleh lurus jugaboleh

berupa kolongan yang diameternya 1 - 3 mm. Dalam melakukan penanaman

bakterikawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan

nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala

(Dwijoseputro, 1990).

Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan

murni tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Medium

untuk membiakan mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran

(kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak

mikroorganisme. Teknik Isolasi Dan Pemurnian Teknik isolasi mikroba untuk

memisahkan dan mengidentifikasi, jenis mikroba dari biakan dapat diklasifikasikan

berdasarkan sifat pertumbuhan yang nampak pada media.

a. Cara penanaman pada agar

Pada metode penanaman pada agar, jika sedikit saja sel diletakkan dalam medium

agar, maka tiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah. Jika suspensi sel

cukup diencerkan, koloni akan terpisah dengan baik, sehingga masing-masing

memiliki kemungkinan tinggi untuk diturunkan menjadi sel tunggal. Namun untuk

membuat yang demikian, penting untuk mengambil satu tipe koloni yang diinginkan,

memasukkan ke dalam air dan menanamnya kembali ke agar. Dengan mengulangi

prosedur ini beberapa kali menjamin untuk memperoleh biakan murni (Waluyo,

2008).

b. Cara penggoresan

Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi

memerlukan keterampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna

akan menghasilkan koloni yang terpisah tetapi kelemahan dari cara ini adalah bakteri

- bakteri anareob tidak dapat tumbuh (Waluyo, 2008).

a. Goresan T

1. Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan

petri

2. Inokulasi daerah satu sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung

3. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali

4. Gores ualang daerah satu sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan didaerah kedua

5. Dipijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali

6. Prosedur diatas diulangi untuk daerah ketiga

(Waluyo, 2008)

b.   Goresan kuadran

Teknik ini sama dengan goresan T hanya lempengan agar dibagi menjadi 4 (Waluyo,

2008)

c. Goresan radian

1. Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan

2. Pijarkan sengkelit dan dinginkan kembali

3. Putar lempengan agar dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir

lempengan

4. Putar lempengan agar dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya

5. Pijarkan ose

(Waluyo, 2008)

d. Goresan sinambung

1. Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah prmukaan lempengan agar

2. Jangan pijarkan ose, putar lempengan , gunakan sisi mata ose yang sama dan gores

pada sisa permukaan lempengan agar (Waluyo, 2008).

c. Cara penuangan

Metode ini pertama kali dilakukan oleh Robert Koch (1843-1955). Cara lain untuk

memperoleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah

dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan

didinginkan yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba didalam

eksprimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu

dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu diantara cawan-cawan

tersebut mengandung koloni-koloni terpisah baik diatas permukaan maupun didalam

agar. cara ini memboroskan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang

terlalu tinggi (Waluyo, 2008).

d.  Cara pengenceran

Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister (1865). Lister berhasil memelihara murni

streptococcus lactis yang diisolasi dari susu yang sudah masam. Caranya adalah

dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam

spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Pengenceran ini

kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi kalau perlu, dari enceran yang kedua

ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Langkah selanjutnya adalah

pengenceran yang ketiga diatas diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium

padat, kemungkinan besar kita dapat memperoleh beberapa koloni tumbuh dalam

medium tersebut tetapi mungkinjuga kita memperoleh satu koloni saja (Waluyo,

2008).

e. Cara penyebaran (agar sebar)

Pengenceran sampel sama seperti pada cara penuangan dengan memipet sebanyak

0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biakan cairan mengalir keatas permukaan

agar. Cairan sample disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelkan. Pada

tehnik ini steririlasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan kedalam alkohol dan

kemudian dipanaskan sehingga terbakar habis. Penyebar didinginkan dahulu sebelum

dugunakan untuk menyebar cairan sampai pada prmukaan agar lempengan tersebut

(Waluyo, 2008).

f. Cara tusuk

Cara tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose

yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media

(Waluyo, 2008).

- Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri

1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk seperti

benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan mudah sekali tumbuh di dalam

suatu media.

2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose yang

berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif banyak

(Dwijoseputro, 1990).

Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba yaitu, (Dwijoseputro, 1990)

1.   Isolasi pada cawan agar

Prinsip pada metode isolasi cawan agar adalah mengencerkan mikroorganisme

sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organis lainnya.

Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi

berasal dari sel tunggal terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan

yaitu, metode gores kuadran dan metode agar cawan tuang.

2.    Isolasi pada medium cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh

pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada medium cair.

Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa sosial pengenceran.

Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu se mikroba semakin

besar

3.  Isolasi sel tunggal

Metode isolasi tunggal dilakukan untuk mengisolasi mikroorganisme berukuran

besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau medium cair. Sel

mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100x kemudian sel

tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun

menggunakan mikromanipulator yang dilakukan secara aseptis. Usaha untuk

mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk menanam

suatu spesies terdapat beberapa cara:

1)   Penanaman dengan penggoresan

Cara ini untuk mengasingkan kuman agar didapatkan biakan murni

2)   Penanaman lapangan

Berguna untuk penentuan jenis kuman dengan bakterrofage dan uji kepekaan erhadap

antibiotik

3)   Biakan agar tabung

Biasanya dipergunakan untuk menunjukan adanya pertumbuhan murni mikro untuk

agultinasi gelas alas

4)   Biakan tusukan

Biasanya digunakan untuk menunjukan adanya pencairan gelatin dan

mempertahankan biakan baru

5)   Biakan agar tuang

Menunjukan jumlah koloni mikroba hidup yang terdapat pada suspensi

6)   Biakan cairan

Kegunaan untuk menunjukan biakan yang banyak dsn cepat. Kerugiannya adalah

tidak dapat membuat biakan murni dari bahan yang mengandung berbagai

mikroorganisme. (Waluyo, 2008)

Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba yaitu :

1. Suplai zat gizi

Mikroorganisme membutuhkan makanan sama seperti mahkluk lainnya. Jadi dengan

adanya zat gizi yang cukup maka pertumbuhan mikroba akan sangat cepat.

2. Waktu

Tentu saja seriap makhluk hidup termasuk mikroba membutuhkan waktu untuk

berkembang biak. Pertumbuhan bakteri membentuk suatu kurva atau fase logritmik.

3. Suhu

Suhu sangat penting bagi pertumbuhan mikroba, apabila suhu naik maka

metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat atau apabila suhu naik atau turun sel

berhenti melakukan kegiatan metabolisme.

4. Nilai pH

Nilai pH untuk pertumbuhan bakteri adalah sekitar atau berkisar antara pH 6,0 - 8,0.

5. Aktifitas air

Semua organisme membutuhkan air pada proses metabolisme. Aktifitas air adalah

jumlah air yang terdapat dalam bahan pangan. Jenis mikroba yang berbeda

membutuhkan air yang berbeda.

6. Ketersediaan Oksigen

Mikroba terbagi atas beberapa kelompok yaitu:

a) Aerobik membutuhkan udara unutk kegiatan metabolismenya.

b) Anaerobik tidak dapat tumbuh dengan adanya oksigen, bahkan oksigen merupakan

racun baginya.

c) Anaerobik fakultatif dimana oksigen digunakan akan dipergunakan apabila tersedia,

jika tidak tersedia maka akan terus anaerobik.

d) Mikroerofilik mikroba yang lebih dapat tumbuh dengan kadar oksigen daripada

yang di atmosfer.

7. Faktor-faktor kimia

Karbon, nitrogen, hidrgen dan oksigen

8. Radiasi

Sinar ultra violet, sinar x dan lain-lain

(Hadioetomo, 1985).

- Macam-Macam Media

Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :

1. Mixed culture berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme

2. Plate culture adalah media padat dalam petridish

3. Slant culture adalah media padat dalam tabung reaksi

4. Stap culture adalah media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan

cara penusukan

5.  Liquid culture adalah media cair dalam tabung reaksi.

6. Shake culture adalah media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok.

(Hadioetomo, 1985).

Beberapa metode yang ada dalam melakukan isolasi mikroorganisme adalah :

1.    Dengan pengenceran

Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies

diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1 ml

untuk diencerkan lagi. Bila perlu, dari enceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk

diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk

disebarkan pada suatu media padat, kemungkinan besar akan didapatkan beberapa

koloni tumbuh dalam media tersebut, tetapi mungkin juga hanya diperoleh suatu

koloni saja. Dalam hal yang demikian ini diperoleh satu koloni murni, dan

selanjutnya spesies ini dapat dijadikan biakan murni. Bila belum yakin, bahwa

koloni tunggal yang diperoleh itu murni, dapat diulang kembali pengenceran dengan

menggunakan koloni ini sebagai sampel (Dwidjoseputro, 1994).

2.     Dengan penuangan

Metode ini dilakukan dengan cara mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang

sudah diencerkan dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam suatu media dari

kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian diperoleh suatu biakan adukan. Setelah

media itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni

yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti

diatas ini, maka akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin.

3.      Dengan cara penggesekan

Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu,

hanya saja dengan metode ini maka bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Jika ujung

kawat inokulasi dibengkokkan, kemudian ujung itu disentuhkan pada media padat,

maka beberapa waktu kemudian (kurang lebih setelah 12 jam) akan tampaklah

koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaan media. Jika diadakan

pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh

suatu biakan murni (Dwidjoseputro,1994).

4. Dengan mengisolasi satu sel (single cell isolation)

Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup.

Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan

menggunakan blue tip/yellow tip baru, tetesan tersebut dipindahkan ke suatu media

encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berbiak dulu. Kemudian dari sini

dapat diperoleh biakan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran dan

micromanipulator memiliki harga yang mahal (Dwidjoseputro,1994).

5.     Penanaman pada agar (plating)

Tidak seperti sel-sel dalam media cair, sel-sel dalam atau pada media gel dibuat

menetap. Oleh karenanya, cukup sedikit sel saja yang diletakkan dalam atau pada

media gel, maka sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah. Bahan gel ideal

untuk kebanyakan media mikrobiologi adalah agar atau polisakarida asam dari

ekstrak alga merah tertentu.

Untuk mempelajari sifat-sifat pada suatu mikroorganisme, adalah penting untuk

melakukan hal tersebut. Sel yang tunggal harus diisolasi dari keberadaan seluruh sel

lainnya dengan cara sedemikian rupa sehingga patogen yang terkumpul dapat terpisah.

Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk mendapatkan isolat murni.

Isolasi murni dilakukan dengan mengoleskan ose steril pada koloni dalam kultur

campuran yang benar-benar terpisah satu sama lain. Olesan tersebut digores pada media

padat agar miring dalam tabung reaksi atau cawan petri. Koloni yang tumbuh dalam

media ini merupakan isolat murni, yang hanya berasal dari satu jenis bakteri saja

(Hadioetomo, 1985).

Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri atas satu spesies bakteri yang

ditumbuhkan dalam media buatan. Media buatan tersebut berfungsi sebagai media

pertumbuhan. Pada media ini bakteri dapat tumbuh dan berkembang biak. Bahan dasar

yang digunakan untuk media pertumbuhan ini adalah agar-agar. Untuk bakteri

heterotrof, media dilengkapi dengan air, molekul makanan (misal gula), sumber

nitrogen, dan mineral. Untuk hasil yang lebih baik agar bakteri tumbuh, alat dan bahan

yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu. Ilmuan yang berjasa dalam rangka

pengembangan teknik biakan murni adalah Robert Koch yang merupakan penerima

hadiah nobel pada tahun 1905. Robert Koch menyadari perlunya suatu bahan pemadat

dalam teknik biakan murni. Bahan pemadat yang digunakan olehnya adalah gelatin.

Cara lain yang sering juga dilakukan dalam pembuatan biakan murni adalah dengan

menggunakan kultur khusus, artinya sebuah media khusus yang bersifat memberi

kemudahan bagi tumbuhnya galur mikroba. Tetapi cara kultur khusus masih

dimungkinkan tumbuhnya galur yang lain namun dengan sifat yang hampir bersamaan

- Teknik Aseptik

Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali kita harus

mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi. Mikroorganisme ada

dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka mudah lepas dalam udara

dan permukaan. Maka dari itu, kita harus mensterilisasikan medium kultur secepatnya

setelah preparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap dikontaminasikan, ini

biasanya terbunuh. Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk tindakan pencegahan

sampai penanganan berikutnya mediun kultur harus tetap steril. Demikian materi yang

lain yang akan kontak  juga harus tetap terjaga kesterilannya (Hadioetomo, 1985).

Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasi dan

media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu dibutuhkan keberhasilan

dalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar dengan pendamping

mikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah karena udara selalu

kontak dengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas mikroorganisme

didalamnya. Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak terkontaminasi

dengan udara sekitar. Transfer aseptik pada kultur dari salah satu medium ke medium

yang lain harus lihai dengan loop inokulasi atau jarum harus disterilkan oleh

pembakaran pada nyala api. Dalam pertumbuhan kultur dibutuhkan tempat yang mudah

dipindahkan ke permukaan agar datar,dimana pertumbuhan suatu koloni berasal dari

pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal.

- Teknik Pembiakan

Pembiakan adalah proses perbanyakan organisme melalui penyediaan kondisi

lingkungan yang sesuai. Mikroorganisme yang sedang tumbuh membuat replika dirinya,

membutuhkan adanya elemen-elemen dalam komposisi kimia mereka. Nutrisi harus

menyediakan elemen ini dalam bentuk yang mudah dimetabolisme. Faktor-faktor yang

harus dikontrol selama pertumbuhan meliputi nutrisi, pH, temperatur, aerasi,

konsentrasi garam dan kekuatan ionik medium. Teknik pembiakan dilakukan

berdasarkan tujuan melakukan pembiakan mikroorganisme. Umumnya tiga situasi dapat

ditemukan yaitu :

1.   Memperbanyak atau menumbuhkan spesies tertentu

2.   Menentukan jumlah dan tipe organism yang ada pada sample

3.   Mengisolasi organisme tertentu dari sumber alami.

Untuk memperbanyak spesies tertentu harus disiapkan media yang mengandung bahan

dan kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan spesies tersebut. Untuk hal ini cukup

dibutuhkan satu jenis media tetapi bersifat selektif dan kaya nutrient sehingga

pertumbuhan akan berjalan baik (Waluyo, 2004).

1. Teknik Penggoresan Agar

a. Agar miring

Pembuatan agar miring tidak boleh menyentuh tutup tabung saat dimiringkan. Agar

ini mempunyai permukaan luas sehingga sering digunakan untuk menumbuhkan

atau menyimpan biakan murni. Beberapa teknik goresan yang biasa digunakan

adalah goresan T, goresan kuadran, goresan radix dan goresan sinambung

b. Agar tegak

Tabung yang berisi agar dibiarkan tegak hingga beku. Agar tegak ini digunakan

untuk membiakkan bakteri dengan cara tusuk (Hadioetomo, 1985).

2. Identifikasi

Setelah diperoleh koloni yang terpisah, dapat dilakukan berbagai uji biokimia. Uji

biokimiadidasarkan pada berbagai hasil metabolisme yang disebabkan oleh daya

kerja enzim. Jarang sekali dapat ditentukan suatu genus berdasarkan sifat morfologi

atau biakan saja. Karena uji biokimia memerlukan berbagai media, maka dari koloni

yang terpisah perlu dibuat dahulu biakan harian dari koloni tersebut. Cara membuat

preparat basah

a. Kaca obyek dibersihkan dengan kapas yang diberi alkohol

b. Pindahkan dua mata ose suspensi biakan ke kaca objek. Untuk preparat biasa

digunakan kaca obyek biasa.

c. Tutuplah dengan kaca penutup

d. Periksa dengan pembesaran 10x atau 40x (Hadioetomo, 1985).

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum adalah sebagai berikut:

a. Cawan Petri

Cawan petri berfungsi untuk membiakan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat

dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagan atas sebagai penutup. Cawan petri

tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15

cm dapat menampung media sebanyak 15 - 20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9

cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.

b. Tabung Reaksi

Didalam mikrobiologi tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan

menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup

tabung reksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau alumunium foil.

Media yang padat dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk

menurut fungsi yaitu media agar tetap tegak dan agar miring. Untuk membuat agar

miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang

kontak dengan udara tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat

dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alasan

efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10 - 12 ml tiap tabung.

c. Laminar Air Flow Cabinet

Laminar Air Flow Cabinet adalah alat sterilisasi yang menggunakan prinsip filtrasi

udara dan penggunaan radiasi ultraviolet. Laminar air flow digunakan sebagai tempat

untuk melakukan kegiatan laboratorium yang membutuhkan kondisi steril, seperti

membuka alat yang telah disterilisasi dan menyiapkan samel mikrobia. Lingkungan

dalam laminar air flow disterilisasi dengan 2 cara. Sebelum digunakan, laminar air

flow ditutup dan lampu UVR dinyalakan sehingga mikrobia di udara dan permukaan

ruang mati, lalu saat bekerja, kondisi udara dijaga stabil dengan filtrasi udara.

Komponen laminar air flow antara lain ruang kaca steril yang dilengkapi dengan

tutup, filter udara di bagian belakang, lampu UVR di langit-langit ruang, lampu biasa

untuk membantu proses kerja, serta panel tombol untuk menyalakan lampu UVR,

filter dan lampu biasa.

d. Jarum Inokulum

Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan

ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat platinum sehingga dapat

berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran dan ada

yang berbentuk lurus. Yang berbentuk lingkaran cocok untuk melakukan streak di

permukaan agar, sedangkan yang berbentuk lurus cocok digunakan untuk inokulasi

secara tusukan pada agar tegak (Hadioetomo, 1985).

Jadi akan lebih baik bila dilanjutkan dengan melakukan pengenceran sehingga hasil

yang didapatkan akan lebih meyakinkan terutama dalam hal kemurniannya. Cara ini

disebut pula sebagai cara “kultur pemerkaya” dari istilah inggrisnya enrichment culture.

Membiakkan bakteri dapat dilakukan dengan berbagi cara, yaitu pengembangbiakan

dalam media cawan petri dan dalam tabung reaksi. Pengembangbiakan dalam cawan

petri ada beberapa metode, yaitu metode cawan gores (streak plate),  metode cawan

tuang (pour plate), dan metode cawan sebar (spread plate).   

Kesulitan dari metode cawan gores adalah proses penggoresan yang cukup lama dan

sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan kegagalan. Prinsip metode ini

yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga

mempermudah proses isolasi. Metode cawan gores terdapat 3 tahap, yaitu : first streak,

second streak, dan third streak. Pada tahap-tahap tersebut mepunyai goresan yang

berbeda, yaitu first streak dengan goresan lebih rapat, pada second streak dengan

goresan yang agak renggang, dan pada third streak dengan goresan yang lebih renggang

lagi (Hadioetomo, 1985).

Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan

khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan

mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam garam fisiologis

(NaCl) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH agar sel

bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan

beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan

(biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Penuangan dilakukan secara

aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjadi kontaminasi atau tumbuh atau

masuknya organisme yang tidak diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya

terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang

hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media

panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan uap yang

akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada

metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik,

dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator

(Hadioetomo, 1985).

Pada metode cawan sebar, suspensi bakteri yang telah diencerkan disebar pada media

penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan

dengan drygalski stick agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut,

kemudian diletakkan dalam inkubator pada suhu 37oC selama 1 - 2 hari. Metode ini

cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan drygalski stick. Alih-alih koloni

tumbuh merata, tapi biakan justru terkontaminasi. Oleh karena itu, drygalski stick harus

benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol

kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat, drygalski stick yang masih

panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar, sehingga harus

didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar api bunsen (± 15 cm).

Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni

bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe

pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi,

bentuk koloni, warna koloni, dan permukaan koloni (Hadioetomo, 1985).

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum tentang Pembuatan Biakan Murni yang dilakukan pada hari Kamis, tanggal 8

November 2012 pukul 15.30 - 17.00 WITA dan pengamatan dilakukan pada hari jum’at

9 November 2012, pukul 16.00 – 16.30 di Laboratorium Rekayasa Lingkungan,

Fakultas Teknik, Universitas Mulawarman, Samarinda.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

1. Jarum Ose

2. Cawan Petri

3. Tabung reaksi

4.  Rak tabung reaksi

5. Incubator

6. Lampu Bunsen

7. Laminar air flow cabinet

8. Alat tulis

9. Korek api

10. Mikro pipet

11. Pipet volum

12. Beaker Glass

13. Batang pengaduk

14. Pipet tetes

15. Hot Plate

16. Stirrer

3.2.2 Bahan

1. Media PDA (Potato Dextrose Agar)

2. Media NA (Nutrient Agar)

3. Bakteri

4. Kertas label

5. Alkohol 70%

6. Aquades

7. Sabun cuci tangan

8. Serbet

9. Tisu

10. Alumunium Foil

11. Spiritus

12. Sarung tangan

3.2 Cara Kerja

3.3.1 Metode cawan gores pada cawan petri (media NA)

1. Disterilkan tangan dengan menggunakan sabun dan alkohol 70%

2. Dibakar jarum ose menggunakan lampu bunsen hingga pijar

3. Didinginkan terlebih dahulu jarum ose sebelum mengambil bakteri

4. Diambil cawan petri yang telah berisi media NA kemudian dipanaskan pinggiran

cawan petri dekat lampu bunsen

5. Dibuka perlahan cawan petri sambil menggesekkan jarum ose yang telah

disterilkan untuk mengambil bakteri

6. Dibuka cawan petri yang kosong lalu digesekkan jarum ose pada cawan dengan

metode cawan gores

7. Ditutup cawan petri lalu dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37oC

selama 24 jam

3.3.2 Metode cawan gores pada tabung reaksi (Media PDA miring)

1. Disterilkan tangan dengan menggunakan sabun dan alkohol 70%

2. Dibakar jarum ose / disterilkan menggunakan lampu bunsen hingga pijar

3. Diambil cawan petri yang telah berisi bakteri lalu dipanaskan menggunakan lampu

bunsen mengenai pinggiran cawan petri tersebut

4. Diambil bakteri dengan menggunakan jarum ose yang telah disterilkan

5. Diambil tabung reaksi yang berisi media PDA miring dibuka alumunium foil dan

di dekatkan pada lampu bunsen

6. Digoreskan jarum ose yang sudah ada bakterinya pada tabung reaksi dengan

metode cawan gores

7. Ditutup kembali tabung reaksi dengan alumunium foil, lalu dimasukkan ke dalam

inkubator dengan suhu 37oC selama 48 jam

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Tabel pengamatan pembuatan biakan murni

No. Media Keterangan

1.

Media NA

1. Terdapat streak pada media NA

2. Terdapat kontaminan

3. Terdapat pertumbuhan bakteri

2.

Media PDA

1. Tidak terdapat streak pada

media PDA miring

2. Tidak terdapat pertumbuhan

bakteri

3. Terdapat kontaminan

4.2 Pembahasan

Laminar digunakan pada saat kita akan menanam tanaman ke dalam botol. Pada saat itu

kondisi botol terbuka, berarti kita harus menyediakan kondisi lingkungan yang steril,

karena kita harus bekerja serba steril semua baik tanamannya, alat, bahan. Di dalam

ruang Laminar Air Flow kondisi steril karena Laminar Air Flow menggunakan filter

steril HEPA 99,99% ditambah dengan prefilter lannya. Jadi kita dapat menanam kultur

tanpa takut terkontaminasi Laminar Air Flow adalah alat sterilisasi yang menggunakan

prinsip filtrasi udara dan penggunaan radiasi ultraviolet. Laminar air flow digunakan

sebagai tempat untuk melakukan kegiatan laboratorium yang membutuhkan kondisi

steril, seperti membuka alat yang telah disterilisasi dan menyiapkan samel mikrobia.

Lingkungan dalam laminar air flow disterilisasi dengan 2 cara. Sebelum digunakan,

laminar air flow ditutup dan lampu UVR dinyalakan sehingga mikrobia di udara dan

permukaan ruang mati, lalu saat bekerja, kondisi udara dijaga stabil dengan filtrasi

udara. Komponen laminar air flow antara lain ruang kaca steril yang dilengkapi dengan

tutup, filter udara di bagian belakang, lampu UVR di langit-langit ruang, lampu biasa

untuk membantu proses kerja, serta panel tombol untuk menyalakan lampu UVR, filter

dan lampu biasa.

Faktor-faktor kesalahan yang sering terjadi saat praktikum pembuatan biakan murni ini

adalah praktikan kurang berhati-hati dalam menggoreskan dan menyebarkan bakteri di

atas permukaan media. Sehingga media tercongkel dan retak. Dan praktikan tidak yakin

dan sedikit gugup saat menggoreskan dan menyebarkan bakteri di atas media, sehingga

penyebaran dan penggoresan yang tidak merata.

Yang digunakan dalam praktikum ini adalah metode gores. Teknik ini lebih

menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan

ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna

akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media

agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-

garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi

koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng.

Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya

terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk

membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan. Ada beberapa

teknik dalam metode goresan, yakni :

a. Goresan T

1. Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar

cawan petri

2. Inokulasi daerah satu sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung

3. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali

4. Gores ualang daerah satu sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan didaerah kedua

5. Dipijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali

6. Prosedur diatas diulangi untuk daerah ketiga

b.   Goresan kuadran

Teknik ini sama dengan goresan T hanya lempengan agar dibagi menjadi 4

c. Goresan radian

1. Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan

2. Pijarkan sengkelit dan dinginkan kembali

3. Putar lempengan agar dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir

lempengan

4. Putar lempengan agar dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya

5. Pijatkan ose

d. Goresan sinambung

1. Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah prmukaan lempengan

agar

2. Jangan pijarkan ose, putar lempengan , gunakan sisi mata ose yang sama dan

gores pada sisa permukaan lempengan agar

Untuk pecobaan pertama, yaitu media NA pertama-tama cuci tangan terlebih dahulu

menggunakan sabun dan bilas dengan aquadest dan semprotkan alkohol 70%. Kemudan

diambil media NA dan PDA serta bakteri dari inkubator lalu kemudian Dibakar jarum

ose dilampu bunsen dengan posisi tegak lurus hingga pijar, kemudian didinginkan.

kemudian diambil bakteri dari cawan petri dengan menggunakan jarum ose Sebelum

cawan petri dibuka, cawan petri harus dibakar terlebih dahulu kemudian setelah itu

digoreskan perlahan dicawan petri sesuai dengan urutan penggoresan secara zig zag

pada media NA secara 3 streak. First Streak, menggunakan jarum ose digoreskan pada

media NA dicawan petri dengan goresan pertama digores secara rapat Second streak,

menggunakan jarum ose digoreskan pada media NA dicawan petri dengan goresan

kedua digores agak jarak. menggunakan jarum ose Third streak digoreskan pada media

NA dicawan petri dengan goresan ketiga digores jarang ketiga goresan dilakukan secara

tidak terputus dan selalu menyambung dari goresan pertama hingga goresan ketiga

Setelah itu cawan petri dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik. Agar uap

air tidak terjatuh ke media saat penguapan dan agar tidak terjadi kontaminasi yang

menyebabkan bakteri tidak dapat tumbuh.

Untuk percobaan kedua yaitu media PDA. Pertama cuci tangan terlebih dahulu

menggunakan sabun dan bilas dengan aquadest dan semprotkan alkohol 70%. Dibakar

terlebih dahulu jarum ose didekat lampu bunsen hingga pijar kemudian diambil bakteri

dari cawan petri lalu digoreskan secara zig zag pada tabung reaksi yang berisi PDA.

Setelah itu, tabung reaksi dibakar agar steril. Dan terakhir, tabung reaksi ditaruh di

dalam inkubator dengan posisi terbalik.

Pembiakan adalah proses memperbanyak mikroorganisme dengan memberikan keadaan

lingkungan yang tepat. Menumbuhkan mikroorganisme adalah membuat replika dari

mikroorganisme tersebut, dan memerlukan unsur-unsur yang ada dalam komposisi

kimianya. Zat makanan harus meyediakan unsu-unsur tersebut dalam bentuk yang dapat

diakses secara metabolik. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri satu populasi

jenis mikroba yang berasal dari satu sel induk. Isolasi bakteri artinya memisahkan satu

jenis bakteri dari biakan campuran menjadi biakan murni.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

a. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri satu populasi jenis mikroba yang

hanya berasal dari satu sel induk saja.

b. Prinsip dari biakan murni ialah memisahkan satu jenis (spesies) mikroba (bakteri

dan jamur) dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam

mikroba.

c. Cara menggores yang benar adalah streak pertama (first streak) dengan kisaran

goresan lebih rapat dibandingkan streak kedua dan ketiga, streak kedua (second

streak) harus lebih besar sedikit ukuran goresannya terhadap goresan pertama dan

streak ketiga (third streak) goresan yang dilakukan harus lebih renggang

dibandingkan goresan pertama dan kedua.

5.2 Saran

Diharapkan sebelum melaksanakan praktikum tangan dicuci bersih dan dibilas dengan

alkohol, sehingga alat tidak terkontaminasi.

DAFTAR PUSTAKA

1. Dwidjoseputro.1990. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan

2. Hadioetomo, R. S. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia: Jakarta..

3. Waluyo, Lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang:Universitas Muhammadiyah