BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Di alam populasi mikroorganisme tidak terpisah menjadi spesies

tersendiri tetapi terdapat bersama-sama. Di laboratorium populasi campuran

tersebut dapat dipisahkan menjadi kultur murni. Kultur murni mengandung

hanya satu jenis organisme dan dapat dipelajari selanjutnya mengenai

morfologi, sifat biokimia dan lain sebagainya.

Koloni merupakan massa pertumbuhan mikroorgsnisme secara

makroskopis dapat terlihat pada permukaan medium padat, masing-masing

menunjukkan multiplikasi dari satu organisme. Teknik umum yang

digunakan untuk mengisolasi koloni diskret harus dilakukan pengurangan

jumlah inokulum. Dengan pengurangan tersebut, inokulasi berikutnya, maka

sel akan terpisah cukup jauh dari sel lainnya pada permukaan medium agar

sehingga terbentuk spesies berbeda akan terpisah. Beberapa teknik untuk

isolasi adalah sebagai berikut :

1. Metode “streak plate” merupakan metode isolasi kualitatif yang dapat

dilakukan dengan cepat. Perlu dilakukan teknik pengenceran dengan

menggunakan ujung jarum inokulasi bulat untuk membantu

menyebarkan kultur pada permukaan medium.

2. Teknik “spread plate” membutuhkan campuran mikroorganisme yang

diencerkan sebelumnya. Selama inokulasi sel-sel akan terpisahkan ke

1

seluruh permukaan medium padat dengan menggunakan batang kaca

yang berujung L sedang cawan petri di putar menggunakan suatu alat

“lazy-susan”.

3. Teknik “pour plate” membutuhkan pengenceran seri dari kultur

campuran dengan menggunakan jarum inokulasi atau pipet. Inokulum

yang telah diencerkan kemudian ditambahkan ke dalam medium agar

yang telah dicairkan ke dalam cawan petri, ocok kemudian biarkan

membeku.

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan diadakannya praktikum kali ini adalah untuk mempelajari

prosedur inokulasi untuk memisahkan kultur campuran sehingga dapat

diisolasi koloni diskret.

1.3 Perumusan Masalah

Permasalahan yang diangkat adalah “ bagaimanakah prosedur inokulasi untuk

memisahkan kultur campuran sehingga dapat diisolasi diskret?”

2

BAB II

KAJIAN TEORI

Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau

lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga

diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke

tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas

dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain.

Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat

yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar

air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi

oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan.

Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton

dan Sainsbury, 2006).

Bakteri di alam umumnya tumbuh dalam populasi yang terdiri dari

berbagai spesies. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biakan murni, sumber

bakteri harus diperlakukan dengan pengenceran agar didapat hanya 100-200

bakteri yang ditransfer ke medium, sehingga dapat tumbuh menjadi koloni

yang berasal dari bakteri tunggal.

Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan

jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk

menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores

dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan

3

metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread

plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu

menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan

periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi

cocok untuk pertumbuhan bakteri.  (Harley dan Presscot, 2002).

Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan

menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan

harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari

ose dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk

koloni tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya

agar didapatkan biakan murni.

Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan

mencampur suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC

kemudian menuangkannya pada petridisk atau dengan menyemprotkan

suspensi pada dasar petridisk, kemudian menuang medium agar keatasnya

dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya

masing-masing dan diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga

terbentuk koloni tunggal.

Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan

suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata

dengan trigalski. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual,

kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal.

4

Metode pemaparan pada udara terbuka adalah metode untuk

mengisolasi bakteri udara. Metode ini sangat simpel, yaitu dengan

memaparkan medium pada udara terbuka, dengan harapan ada bakteri yang

menempel dan kemudian akan tumbuh menjadi koloni.

Bakteri dapat ditumbuhkan dalam suatu medium agar dan akan

membentuk penampakan berupa koloni. Koloni sel bakteri merupakan

sekelompok masa sel yang dapat dilihat dengan mata langsung. Semua sel

dalam koloni itu sama dan dianggap semua sel itu merupakan keturunan

(progeny) satu mikroorganisme dan karena itu mewakili sebagai biakan

murni.

5

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A.    Alat dan Bahan

1.      Alat

a.       Ose.

b.      Inkubator.

c.       Cawan petri steril.

d.      Bunsen.

e.       Korek.

2.      Bahan

a.       Nutrien agar (NA) dan nutrien broth (NB).biakan bakteri.

B.     Cara Kerja

1.      Cara Goresan (Streak Plate Method)

a.       Cairkan nutrien agar dalam penangas air.

b.      Dinginkan sampai temperatur ± 50°.

c.       Tuangkan medium agar tersebut ke dalam cawan petri

steril secara aseptik dan biarkan sampai dingin dan padat.

d.      Ambil 1 ose suspensi bahan  yang mengandung bakteri

atau campuran bakteri secara aseptik, kemudian dibuat

goresan pada  permukaan agar.

e.       Cawan petri diberi label (etiket) kemudian dibungkus dan

dibalik untuk mencegah terjadinya tetesan air pada

permukaan agar dari hasil kondensasi uap air.

f.       Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik pada

suhu 300C, minimal selama 1x24 jam

g. Sesudah inkubasi akan terlihat koloni pada bekas goresan.

Pada permulaan goresan akan terjadi pertumbuhan yang

lebat setelah diinkubasikan, sehingga akan sukar diisolasi.

6

Tiap koloni yang terpisah mungkin berasal dari 1 macam

sel bakteri.

h.      Salah satu koloni dipilih dari masing-masing tipe koloni

yang tumbuh, kemudian diamati bentuk koloninya.

   

2.      Cara Tuang (Pour Plate Method)

a.       Medium untuk pertumbuhan bakteri (nutrien agar) yang

telah dicairkan dalam penangas air (100°C), dinginkan

sampai temperatur 50°C, kemudian diinokulasikan dengan

satu ose suspensi secara aseptis.

b.     Dituangkan ke dalam cawan petri steril berlabel secara

aseptis, kemudian digoyang perlahan supaya cepat

mengering.

c.      Diambil sampel sebanyak 1 ml dari masing-masing

pengenceran berseri pada teknik dilusi dan dimasukkan ke

dalam cawan petri steril, cawan segera ditutup agar

terhindar dari kontaminan.

d. Segera setelah media dimasukkan, cawan petri diputar

secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk

mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur

mikroba.

e. Setelah memadat, cawan-cawan tersebut diletakkan dalam

posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar,

minimal selama 1x24 jam.

f. Karakteristik koloni yang tumbuh diamati.

3. Cara Sebar (Spread Methode)

a. Pengenceran sampel sama seperti pada cara penuangan.

b. Dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dari botol pengencer

dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar.

7

c. Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari

gelas berbentuk huruf L. Pada teknik ini sterilisasi penyebar

dilakukan dengan mencelupkan ke dalam alkohol dan

kemudian dipanaskan sampai alkohol terbakar habis.

d. Penyebar didinginkandahulu sebelum digunakan untuk

menyebar cairan sampel pada permukaan agar. Penyebaran

cairan contoh ( sampel ) dilakukan dengan memutar agar

lempengan tersebut.

8

BAB IV

HASIL PENGAMATAN

Tabel. Macam-macam teknik isolasi

No

.Metode Isolasi Gambar Pengamatan

1 Streak Plate dan

Pour Plate

Semua bakteri (E. coli, bakteri lingkungan dan bakteri di badan)

2 Streak Plate

E. coli

9

3 Pour Plate

E. coli

No

.Metode Isolasi Gambar Pengamatan

4 Pour Plate

Bakteri di badan (kaki)

5 Pour Plate

Bakteri Lingkungan

6 Medium Cair

10

E. coli

BAB V

PEMBAHASAN

Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) tidak ada bakteri yang

hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen

kedapatan bersama-sama bakteri saproba. Yang terakhir ini boleh disebut

penyerbu yang membonceng (secondary invaders). Mungkin juga bakteri

patogen yang membonceng. Untuk menentukan siapa pembonceng dan

siapa yang diboncengi diberikan pedoman “siapa yang kedapatan di situ

lebih dulu, dan siapa yang datang terkemudian”. Untuk menyendirikan suatu

spesies ada dikenal beberapa cara, yaitu:

1. Dengan Pengenceran

Cara ini pertama-tama dilakukan oleh Lister dalam tahun 1865. Ia

berhasil memiara murni Streptococcus lactis yang diisolasikannya dari

susu yang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa

campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung

11

tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi.

Dan dari pengenceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih

lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk

disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan

mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi

mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang

demikian ini kita memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies

ini dapat kita jadikan biakan murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni

tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran

dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.

2. Dengan Penuangan

Robert Koch (1843 – 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu

dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan,

dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam suatu medium dari kaldu dan

gelatin encer. Dengan demikian yang diperoleh hanyalah suatu piaraan

adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam

kemudian nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap

murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti tersebut di atas ini, maka

akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin.

Dalam melakukan metode ini ada dua orang pembantu Koch yang sangat

berjasa, yaitu Petri yang menciptakan cawan dengan tutup yang sekarang

terkenal sebagai cawan Petri (Petri dish). Pembantu yang kedua ialah Hese

12

yang menemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin. Memang agar-agar

ternyata lebih baik daripada gelatin untuk bahan pengental suatu medium.

Agar-agar tidak lekas mencair, titik cairnya 95o C.

3. Dengan Penggesekan

Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu

memakan waktu, tapi dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat

tumbuh. Jika ujung kawat inokulasi dibengkokkan, kemudian ujung itu

setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium

padat, maka beberapa waktu kemudian daripada itu (kurang lebih setelah 12

jam) akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebat di permukaan

medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya

terpencil, maka akan diperoleh suatu biakan murni.

Ada beberapa teknik penggesekan yakni :

a. Goresan T

Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada

bagian luar dasar cawan petri.

Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan

sinambung.

Panaskan ose dan biarkan dingin kembali

Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan

goresan di daerah II.

13

Pijarkan kembali ose dan biarkan dinginkembali

Prosedur di atasdiulangi untuk daerah III.

b. Goresan Kuadran, teknik ini sama dengan goresan T , hanya

lempengan agar dibagi menjadi 4.

c. Goresan Radian

Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan

Ppijarkan ose dan dinginkan kembali

Putar lempengan agar 90o dan bbuat goresan terputus

dimulai dari bagian pinggir lempengan

Putar lempengan agar 90o dan buat goresan terputus di atas

goresan sebelummya.

Pijarkan ose.

d. Goresan Sinambung

Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah

permukaan lempengan agar.

Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180o, gunakan sisi

mata ose yng sama dan gores pada sisa permukaan

lempengan agar.

4. Dengan Mengucilkan Satu Sel (Sincle Cell Isolation)

Kita mempunyai alat yang dapat mengambil satu bakteri dari sekian

banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Alat semacam itu disebut

mikropipet. Alat itu ditempatkan pada tangan-tangan suatu

mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung

14

pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakukan di bawah obyektif

mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka

dengan lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke suatu medium encer

dengan maksud supaya bakteri tersebut berbiak dulu. Kemudian dari sini

dapat diperoleh biakan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran,

lagi pula, mikromanipulator itu sangat mahal.

5. Dengan Inokulasi Hewan

Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua

bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak

dari seseorang yang sedang menderita tbc. Jika dahak itu disuntikkan ke

dalam tubuh tikus putih, maka bakteri-bakteri saproba yang ikut serta itu

tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita peroleh semata-mata basil tbc

saja. Biakan Pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian

juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati itu

akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai.

Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit (intracutaneous), dapat di

bawah kulit (subcutaneous), dapat di dalam otot (intramuscular), dapat di

dalam rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi (Redi).

15

BAB VI

KESIMPULAN

Dari uraian di atas dapat disimpulkan bahwa teknik isolasi kultur

murni dapat dilakukan dengan menggunakan metode antara lain ;

1. Teknik pengenceran

2. Teknik penuangan

3. Teknik penggoresan

4. Teknik penyebaran

5. Cara pengucilan satu sel

Dan teknik yang dilakukan adalah dengan teknik penggoresan (streak -

plate), ini cara yang paling umum dan ekonomis. Namun memerlukan

keterampilan.

Ada beberapa metode untuk mengisolasi bakteri diantaranya

metode streak plate, spread plate dan pour plate. Metode streak plate

tekniknya sulit dilakukan namun kontaminan mudah dibedakan. Metode

16

pour plate, mudah dilakukan dan dapat ditumbuhi mikrobia aerob maupun

anaerob tetapi kontaminan sulit dibedakan. Metode spread tehniknya sama

dengan pour plate tetapi menggunakan alat untuk menyebar medianya.

     DAFTAR PUSTAKA

Barazandeh, N. 2008. Microbiology Titles. Jerman. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Media , pp 9-11

Pelczar, M.J.Jr, and E. Chan.1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit UI Press. Jakarta. p:23-24.

Prescott, L. M, J. P. Harley, dan D. A. Klein. 2008. Microbiology. 7th Ed. McGraw-Hill Book Company Inc. USA, p: 113-116

Seiler, J. P. 2000. Good Laboratory Practice. Swiss. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Media , p 61.

Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang, p: 61-67.

17