Analisa Vitamin

Kelompok 4Ahmad Rio FatullahAsiva Ajeng ArmasyariDini BudiartiEster Maria M. P.Ineu Ayu OktapiaMuji SetyowatiResa Prisilia Hanafi

Vitamin A

PendahuluanMetode ini dapat diterapkan pada lemak dan hampir semua bahan pangan lainnya.

PrinsipMula-mula sampel disabunkan dan senyawa yang tidak dapat disabunkan diekstrak dengan dietil eter. Vitamin A kemudian dipisahkan dari karotenoid dengan kromatografi alumina, kemudian dianalisis secara spektrofotometri.

Pereaksi :

1. Larutan potasium hidroksida (60% w/w dalam aquadest)

2. Larutan sodium hidroksida3. Pereaksi Carr-price4. Sodium sulfat5. Etanol absolut6. Petroleum eter7. Dietil eter8. Larutan pengelusi9. Quinol10.Alumina

11. Pembuatan Alumina Netral- Fraksi alumina yang lolos saringan 150 mesh diaktivasi pada 800ᵒC selama 7 jam- Dinginkan- Tambahkan 2ml Aquadest setiap 98 gr alumina aktif kemudian campur dengan baik- Simpan didalam botol bertutup- Dengan menggunakan alumina ini, periksalah, apakah vitamin A mulai meninggalkan kolom

pada saat pelarut 24% melewati kolom.- Lihat tahap pemeriksaan kromatografi- Apabila vitamin A melewati kolom lebih lambat, tambahkan aquadest sampai kondisi yang

diinginkan tercapai

12. Pembuatan Alumina Basa- Timbang 20gr alumina netral dalam labu berdasarkan bulat dan tertutup- Tambahkan 20ml larutan NaOH 10%- Pasang adapter yang mempunyai lubang dibagian atas dan samping labu- Tutup lubang atas adapterdengan penutup karet berlubang- Pasang pipa gelas melalui lubang penutup karet sampai 5mm diatas dasar labu- Hubungkan pipa gelas dengan sumber gas nitrogen atau hidrogen- Hubungkan dengan lubang sisi adapter dengan pompa vakum, gunakan pipa yang sesuai- Jalankan pompa vakum dan lewatkan aliran gas ke dalam labu perlahan-lahan selama 1 jam- Rendam labu dalam penangas minyak (oil bath) dan naikkan suhu penangas secara bertahap

selama 1 jam sampai mencapai 130ᵒC

- Pertahankan labu dalam penangas pada suhu tersebut- Stop aliran gas- Pindahkan labu dari penangas dan biarkan dingin sambil tetap dalam

keadaan vakum (pompa vakum masih dijalankan)- Matikan pompa vakum- Tentukan kadar air produk dengan pengeringan pada 500ᵒC selama 2 jam- Tambahkan air ke dalam alumina sehingga kadar air akhir alumina 12,5-1%- Simpan produk ini dalam tabung-tabung reaksi kecil yang ditutup dengan

lilin (1 gr per tabung)

Peralatan1. Tabung berskala, kapasitas 1ml2. Pipet ukur 0,5ml3. Kolom kromatografi4. Spektrofotometer dengan kisaran sinar tampak dan UV5. Kuvet gelas dan silika, diameter 1 cm

Cara KerjaPenyabunan dan ekstraksi1. Timbang sejumlah sampel yang mengandung vitamin A, masukkan ke dalam labu 250ml2. Tambahkan 20ml kuinol, 60ml etanol (96%w/v), 10ml larutan potasium hidroksida 60%

dan 10ml petroleum eter3. Didihkan dengan pendingin balik selama 30 menit4. Dinginkan5. A) Apabila setelah penyabunan tidak ada lagi padatan yang tertinggal, pindahkan

seluruh isi labu ke dalam labu pemisah, kemudian cuci labu dengan 80ml air sebanyak 2x, masukkan cucian kedalam labu pemisah

B) Apabila setelah penyabunan masih ada padatan yang tertinggal, saring larutan melewati corong buchner menggunakan kertas saring dan masukkan kedalam labu pemisah. Tambahkan 160ml aquadest kedalam ekstrak.6. Masukkan 100ml dietil eter kedalam ekstrak dalam labu pemisah. Kocok labu pemisah

secara kontinu sambil sesekali membuka tutupnya untuk mengurangi tekanan didalam labu

7. Biarkan kedua fase untuk memisah secara sempurna8. Tuangkan fase aqueous yang berada dibawah kedalam labu pemisah lainnya, simpan

lapisan eter9. Ekstrak fase aqueous 3x, masing-masing menggunakan 50ml dietil eter dan campurkan

lapisan eter yang didapat kedalam fase eter hasil tahap 810. Tambahkan 50-100ml aquadest kedalam ekstrak eter, goyang memutar perlahan-lahan

11. Buang fase aqueous yang berada dibawah

12. Lanjutkan pencucian dengan mengunakan 50ml aquadest sampai air cucian bebas alkali (tes

dengan fenolflalein)

13. Setelah air cucian terakhir dibuang, diamkan ekstrak eter beberapa menit dan jika ada

lapisan air dibuang dengan hati-hati

14.Uapkan ekstrak eter di atas penangas uap sampai kering sanbil mengaalirkan gas inert

kedalam wadah ekstrak eter

15. Tambahkan 2ml alkohol absolut segera setelah dietil eter menguap

16. Uapkan lagi sampai kering dengam menggunakan aliran gas inert

17. Ulangi tahap no 15 dan 16 sekali lagi

18. Larutkan segera residu dengan 5ml petroleum eter

19. Uapkan dengan menggunakan aliran gas inert sampai mengering

20. Ulangi tahap no. 18 dan 19 dua kali lagi

21. Larutkan residu dengan 2ml petroleum eter

Penetapan Vitamin A : Kromatografi Kolom Alumina1. Letakkan sejumlah kecil kapas wool dibagian dasar dari kolom kromatografi2. Tuangkan petroleum eter sampai setinggi setengah kolom3. Tambahkan 5,5gr alumina netral4. Biarkan petroleum eter yang tersisa mengalir melalui permukaan alumina sampai

tinggal lebih kurang 2mm diatas permukaan (menggunakan tekanan gas inert)5. Tuangkan ekstrak ke dalam kolom, cuci wadah ekstrak berturut-turut dengan 1ml

petroleum eter, masukkan cucian kedalam kolom6. Dengan bantuan vakum, lakukan pengembangan kolom (elusi)7. Secara berturut turut tuangkan kedalam kolom, pada saat miniskus dari larutan

yang terdahulu mencapai permukaan alumina, 5ml petroleum eter dan kemudian masing-masing 5ml larutan pengelusi dietil eter 4-20% dalam petroleum eter

8. Apabila selama elusi menggunakan petroleum eter sampai dietil eter 12% dalam petroleum eter ada karoten yang ikut terelusi, pisahkan dan simpan

9. Pasang kolom kromatografi bawah yang berisi 1 gr alumina basa dalam petroleum eter segera setelah menuangkan larutan mengelusi dietil eter 20%

10. Tampung eluen didalam tabung-tabung reaksi berskala 1ml11. Lanjutkan pengembangan kolom dengan masing-masing 5ml larutan pengelusi dietil

eter 24 dan 36% sampai seluruh vitamin A terelusi12. Ambil 0,2ml larutan dari masing-masing tabung

13. Tambahkan 0,3 pereaksi Carr-Price, timbulnya warna biru menunjukan adanya vitamin A

14. Dari setiap tabung reaksi yang mengandung vitamin A ambil 0,5ml larutan dan masukkan kedalam labu

takar 10ml. Encerkan dengan petroleum eter sampai tanda tera.

15. Ukur absorbansinya dengan kuvet silika pada 323,324,325 dan 326 nm. Gunakan petroleum eter sebagai

blanko

16. Juga ukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum dikurangi 15 dan panjang gelombang

maksimum ditambah 10 (lihat catatan 3)

Perhitungan

Vitamin A

Jika : Berat sampel (gr) = W

Absorbansi = D

E 1% 1cm untuk vitamin A dalam petroleum eter = 1830 (λ 324nm)

Jadi : Vitamin A (Retinol) dalam sampel (mg/100)

= D x 10⁶ x 2 = D x 10.9

1830 x 100 x W W

Catatan

1. Seluruh proses dilakukan secepat mungkin untuk mengindari pengaruh cahaya

2. Untuk sampel-sampel seperti susu, lemak diekstrak terlebih dahulu dengan cara Roese-Gottlieb, hasilnya kemudian disabunkan

3. Rasio Absorbansi pada (λ maksimum - 15)Absorbansi pada λ maksimum

dan Absorbansi pada (λ maksimum + 10)Absorbansi pada λ maksimum

Untuk vitamin A murni tidak akan > 0,9. apabila rasio tersebut > 0,9 menunjukkan adanya senyawa pengganggu.

Total Karoten dalam Minuman

Pendahuluan

Metode ini dapat diterapkan untuk menetapkan total karoten dalam minuman

seperti saribuah, “vitamin juices”, “fruitmilk”, “fruitbuttermilk”, vitamin drink” dan

lain-lain

Prinsip

Sampel minuman diekstrak dengan kloroform, ekstrak yang diperoleh

dikromatografikan pada aluminium oksida sehingga karoten terpisah dari

komponen lainnya. Absorbans fraksi karoten yang diperoleh dapat diukur pada

panjang gelombang 450nm

Pereaksi- Pasir laut (sea sand) yang sudah dicuci dengan asam- Sodium sulfat anhydrous- n-Heksana- Etanol absolut- Kloroform, distabilkan dengan etanol- Aluminium oksida 90 aktif, netral (tingkat aktifitas I). Diaktifasi dengan cara :

masukkan 100 gr Al₂O₃, kedalam erlenmeyer, tambahkan 12ml air, aduk merata sampai tidak ada gumpalan dan biarkan selama 2 jam

Peralatan- Peralatan laboratorium standar- Labu bulat berdasar rata 500ml- “orbit shaker”- Centrifuge- Rotary evaporator- Kolom kromatografi, diameter 2mm, dilengkapi dengan saringan dan serat- Spektrofotometer- Kuvet gelas, tebal 1cm

Cara KerjaPersiapan Sampel1. Minuman yang tidak jernih atau mengandung endapan harus dikocok dulu

sebelum dilakukan pengambilan contoh2. Jumlah sampel yang diambil untuk analisa tergantung dari jenis minuman yang

dianalisa, biasanya sekitar 50ml atau 50gr.Ekstraksi3. Masukkan 50ml atau 50gr minuman kedalam labu bulat berdasar rata,

tambahkan 200-400ml kloroform4. Kocok campuran dengan menggunakan orbit shaker selama 30menit5. Centrifuge untuk memisahkan emulsi kloroform dan air6. Buang fase aqueous (atas)dan ekstrak kloroform (bawah) disaring dengan kertas

wool yang dilapisi dengan sodium sulfat anhydrous. Filtrat yang diperoleh disebut dengan ekstrak sampel.

7. Uapkan ekstrak sampel sampai kering dengan menggunakan rotary evaporator dalam keadaan vakum dan suhu 10ᵒC

8. Jika masih ada air, tambahkan sedikit etanol kemudian diuapkan lagi9. Jika perlu residu kering ditambah n-Heksana lalu diuapkan lagi untuk

menghilangkan sisa etanol, lalu tambahkan lagi n-Heksana sampai volumenya 3-5ml, larutan ini disebut konsentrat karoten

Pemisahan Karoten dengan Kromatografi Kolom1. Siapkan kolom kromatografi, masukkan pasir laut kedalam kolom sampai setinggio

0,5cm. Kemudian masukkan aluminium oksida yang sudah diaktifasi yang disuspensikan dalam n-Heksana. Tuang perlahan-lahan suspensi kedalam kolom dan tepuk-tepuk kolom sehingga partikel terdistribusi merata keseluruh kolom. Lanjutkan sampai tinggi lapisan aluminium oksida 8-9cm. Kolom ini selalu dibasahi dengan heksana.

2. Pindahkan secara kuantitatif konsentrat karoten kedalam kolom dengan bantuan pipet tetes, cuci wadah konsentrat dengan heksana, masukkan cucian kedalam kolom

3. Lakukan elusi dengan menggunakan n-Heksana sampai seluruh karoten yang berwarna kuning-orange keluar dari kolom. Elusi diakhiri apabila eluen yang keluar dari kolom sudah tidak berwarna lagi. Tampung hasil elusi dalam labu takar yang sesuai misalnya labu takar 100ml.

4. Tepatkan volume eluat dalam labu takar sampai tanda tera dengan menggunakan heksana, larutan ini disebut larutan uji.

Pengukuran Spektrofotometrik5. Ukur absorbans larutan uji dengan spektrofotometer pada panjang gelombang

450nm, gunakan heksana sebagai blanko6. Buat kurva standar, absorbans vs konsentrasi β-karoten. Buat satu seri larutan β-

karoten dengan konsentrasi 0,1-5 μg/ml7. Hitung konsentrasi karoten dalam sampel berdasarkan kurva standar yang dibuat

Vitamin B1 : Metode Manual IPendahuluan

Metode ini dapat diterapkan pada semua bahan makanan

Prinsip

Tiamin, diekstrak dengan menggunakan asam encer panas, dan diurai (digest) dengan fosfatase pada Ph

4,5. Ekstrak yang didapat dikromatografikan pada silikat basa dan tiamin yang terelusi dioksidasi dengan

ferisianida basa menjadi tiokrom, yang diukur secara fluorometri.

Peralatan

- kolom kromatografi. Diameter internal 10mm, panjang 20cm. Sebuah labu penyimpanan (reservoir)

berkapasitas 30ml dapat dipasang dibagian atas kolom

- Labu oksidasi. Labu pemisah bertutup dan bercerat berkapasitas 100ml

- Spektrofluorometer. Panjang gelombang eksitasi 360nm, panjang gelombang emisi 435nm.

- Penangas air

Pereaksi

- Asam klorida 0,2N- Asam sulfat 0,1N- Asam asetat 3%- Larutan potasium klorida 25% dalam aquadest- Larutan potasium klorida asam- Sodium hidroksida 15% dalam aquadest- Potasium ferisianida basa- Sodium asetat 2,5M- Etanol- Isobutanol- Suspensi enzim (fosfatase)- Silikat penukar basa aktif. Zeolit butiran buatan berukuran 60-90 mesh diaktivasi dengan cara:a. Timbang 500gr silikat dan masukkan kedalam gelas piala 1 Literb. Tambahkan asam asetat encer secukupnya sampai seluruh silikat terendamc. Panaskan pada 100ᵒC selama 15 menit dengan pengocokkan berkalad. Dekantasikan cairan supernatane. Bilaslah residu dengan melakukan dekantasi menggunakan tiga porsi larutan potasium klorida asam

panasf. Bilaslah silikat dengan air mendidih sampai air cucian bebas klorida- Larutan stok tiamin standar- Larutan kerja tiamin standar- Bromkresol hijau 0,1% dalam alkohol 20%

Cara KerjaEkstraksi1. Timbanglah sejumlah sampel dan masukkan ke dalam tabung reaksi 100ml yang

dilengkapi dengan gelas pengaduk2. Tambahkan 50ml asam klorida 0,2N3. Panaskan tabung selama 30menit dalam penangas air mendidih sambil diaduk

secara berkala4. Periksalah apakah akhir “digestion” sampel masih asam dengan menggunakan

indikator bromkresol hijau. Apabila tidak, buang ekstrak dan ulangi “digestion” dengan asam yang lebih pekat

5. Dinginkan ekstrak sampai suhunya dibawah 50ᵒC6. Atur pH ekstrak sampai diantara 4-4,5 dengan sodium asetat (biasanya

dibutuhkan 5ml)7. Tambahkan 5ml suspensi enzim dan aduk8. Inkubasi pada suhu 37ᵒC selama semalam9. Dinginkan ekstrak sampai suhu kamar10. Pindahkan ekstrak kedalam labu takar 100ml dan encerkan sampai tanda dengan

aquadest11. Saring ekstrak melalui kertas saring berporositas cepat. Apabila diperlukan,

encerkan ekstrak sampai mengandung tiamin tidak lebih dari 0,05 μg/ml

Pemurnian1. Isilah kolom kromatografi dengan 6 gr silikat penukar basa yang

disuspensikan dalam aquadest2. Biarkan air mengalir turun sampai tinggal 2mm diatas permukaan

silikat3. Tambahkan 5ml asam asetat 3% kedalam kolom dan biarkan mengalir

turun seperti sebelumnya4. Pipet dan masukkan 25ml ekstrak sampel kedalam kolom dan

biarkan mengalir turun5. Buang eluat yang didapat6. Cuci kolom 3x masing-masing dengan 10ml air mendidih dan buang

eluat yang didapat7. Elusi tiamin dari kolom 2x masing-masing dengan 10ml potasium

klorida panas (hampir mendidih)8. Kumpulkan eluat dan masukkan kedalam labu takar 25ml9. Dinginkan pada suhu kamar, dan encerkan sampai tanda tera dengan

larutan potasium klorida asam, kocok sampai merata.

Oksidasi Tiamin1. Pipet larutan sampel masing-masing sebanyak 10ml dan masukkan

masing-masing kedalam labu pemisah yang berbeda2. Kedalam labu pemisah pertama, tambahkan 5ml larutan potasium

ferisianida basa (larutan uji) dan kedalam labu pemisah kedua tambahkan 5ml sodium hidroksida 15% (blanko)

3. Kedalam keduanya masukkan 5ml etanol dan kocok merata4. Tambahkan masing-masing 25ml isobutanol jenuh air5. Campur merata dengan melewatkan nitrogen kedalam larutan selama

2menit6. Ambil dan buang lapisan aqueous yang berada dibawah sampai

tinggal 1ml dengan tabung “blow-out”7. Tambahkan etanol kedalam lapisan isobutanol, kocok dengan hati-hati

dan jaga agar lapisan “aqueous” tidak terganggu8. Pipet masing-masing 10ml alikuot larutan kerja tiamin standar dan

masukkan masing-masing kedalam labu pemisah 100ml yang berbeda. Ulangi tahap 2-7

Pengukuran Fluoresensi1. Atur panjang gelombang eksitasi pada 360nm dan panjang gelombang emisi 435nm2. Isilah sebuah sel fluorometer dengan asam sulfat 0,1N dan sebuah sel lainnya dengan

larutan alikuot, lapisan isobutanol yang diperoleh dari tahap 8 oksidasi tiamin3. Atur fluorometer sampai memberikan angka nol untuk asam sulfat 0,1N dan angka

100 untuk larutan standar4. Ukur semua larutan sampel dan blanko

PerhitunganMisalkan : berat sampel (gr) = W

volume ekstrak (ml) = 100 alikuot hasil oksidasi (ml) = 10 pembacaan sampel = Ts pembacaan blanko sampel = Tb pembacaan standar = Ss pembacaan blanko standar = Sb Fluorosensi tiokrom dalam sampel = Ts - Tb Fluorosensi tiokrom dalam standar = Ss – Sb

Maka :Kadar tiamin dalam sampel (mg/100gr) = Ts – Tb x 0,5

Ss – Sb W

Catatan

1. Salah satu contoh enzim fosfatase yang sesuai yaitu Taka-diastase yang dikeluarkan oleh Serva ( Heidleberg, Jerman)

2. Salah satu contoh silikat penukar ion yang sesuai yaitu Zerolit S/F (Decalso F)

3. Pengukuran flourosensi dari isobutanol sebaiknya dilakukan selambat lambatnya 10menit

4. Hindarkan larutan isobutanol dari cahaya matahari, karena dapat menyebabkan kerusakan thiokrom

VITAMIN B1 METODE MANUAL II

Metode ini dapat di terapkan untuk vitamin B1 serealia.

PRINSIP

Sama seperti pada penetapan vitamin B1 metode manual I, hanya pada tahap “digest” dilakukan dengan pemanasan pada otoklaf pada tekanan 15 lb/in2 selama 30 menit.

Pereaksi

1. Larutan sodium asetat larutan 272 g NaOAC.3H2 O dalam air dan encerkan sampai volume 1 liter.

2. Bahan pengisi kolom: silikat penukar ion basa.3. Larutan potasium klorida netral larutkan 250 g KCl dalam air dan encerkan sampai volume 1 liter.4. Larutan potassium klorida asam tambahkan 8,5 ml HCl pekat kedalam 1 liter larutan KCl netral.5. Larutan sodium hodroksida 15%6. Larutan potassium ferisianida 1% dalam air7. Larutan pengoksidasi Encerkan 4 ml larutan potassium ferisianida 1 % menjadi 100 ml dengan menggunakan larutan NaOH 15%8. Isobutanol Didistilasi kembali dan dijenuhkan dengan air.9. Larutan kerja tiamin standar 1 µg/ml.

PERALATAN

1. Flourometer2. Ph meter3. Kolom kromatografi

CARA KERJA

A. Persiapan sampel1. Hancurkan sampel serealia dengan blender kering

atau willey mill sampai terbentuk tepung.2. Timbang 1,00 g sampel, masukkan kedalam labu ukur

100 ml. 3. Tambahkan 20 ml HCl 0,1 N4. “digest” dalam otoklaf selama 30 menit pada tekanan

15 lb/in2 . Angkat dan biarkan dingin5. Atur Ph larutan menjadi 4,5 dengan menggunakan

larutan natrium asetat.

B. Pemurnian

1. Tempatkan sedikit glass wool pada dasar kolom kromatografi (gunakan buret, jika tidak

ada) yang berisi air dengan bantuan gelas pengaduk.

2. Suspensikan 1,0 – 2,0 g “Thiochrome decalso” (silikat penukar ion basa) dalam 10 ml

air, kemudian masukkan kedalam kolom. Hindari terperangkapnya udara di dalam

kolom dengan cara mempertahankan cairan tetap berada diatas permukaan silikat.

3. Masukkan ekstrak sampel yang sudah disaring yang diperkirakan mengandung sekitar

15 µg tiamin (dipipet tepat) kedalam kolom. Cuci berturut turut dengan 5 ml air yang

hamper mendidih sebanyak 3 kali. Buang eluat yang keluar.

4. Elusi tiamin dari kolom dengan melewatkan berturut-turut 4 ml larutan KCl asam yang

hamper mendidih sebanyak 5 kali.. Tampung eluat yang keluar dalam labu takar 25 ml.

Encerkan eluat sampai tanda tera dengan larutan KCl asam.

C. Oksidasi Dan Pengukuran Fluoresensi

1. Masukkan masing-masing 1,5 g KCl kedalam 4 tabung reaksi besar.

2. Tambahkan masing-masing 5 ml larutan elut kedalam masing masing tabung reaksi

tersebut.

3. Sambil digoyang memutar secara kontinyu, tambahkan 3 ml larutan pengoksiadasi

kedalam dua tabung reaksi. Dua tabung sisanya tidak ditambahkan larutan

pengoksiadsi (blanko).

4. Tambahkan segera 10 ml isobutanol kedalam masing-masing tabung, tutup dengan

parafilm kocok merata.

5. Siapkan blanko, dengan menambahkan masing-masing 3 ml larutan NaOH 15%

kedalam dua tabung reaksi yang tidak ditambah larutan pengoksidasi, lalu lakukan

tahap 4.

6. Ulangi tahap 1 sampai 4 dengan menggunakan 5 ml larutan tiamin standar.

7. Dekantasi lapisan isobutanol. Masukkan kedalam kuvet, ukur fluoresesnsinya pada

panjang gelombang eksitasi 365 nm dan emisi 435 nm.

VITAMIN B1 METODE HPLC

Metode ini dapat diterapkan pada semua bahan makanan.

PRINSIP

Vitamin B1 diekstrak dari makanan dengan hidrolisa asam. Perlakukan dengan papain dilakukan untuk menghilangkan senyawa pengganggu analisis berupa protein, sedang perlakukan dengan diastase dilakukan untuk membevaskan vitamin dari bentuk fosfatnya. Filtrat jernih yang didapat kemudian dielusi pada kolom HPLC dan eluen yang mengandung vitamin B1 kemudian dioksiadasi dengan potassium ferisianat menjadi tiokrom dan diukur fluoresensinya dengan fluorometer.

PEREAKSI1. Asam sulfat 0,25 N. Encerkan 7 ml asam sulfat (BJ 1,84) menjadi 1 liter dengan

aquades2. Larutan buffer. Larutkan 160 g sodium hidroksida dalam aquades dan encerkan

sampai 500 ml. larutkan 272 g asam asetat glasial (BJ 1,04) dalam aquades dan encerkan sampai 500 ml. Campur kedua larutan tersebut dalam jumlah yang sama.

3. Takadiastase. Siapkan suatu suspense yang mengandung 100 mg diastase per ml4. Papain. 12000 E/g. siapkan suatu suspense yang mengandung 100 mg papain per ml.5. Asam trikloro asetat. Larutkan 45 g asam trikloro asetat dalam aquades dan encerkan

sampai 100 ml.6. Merckosob SI 60. silica gel untuk HPLC, ukuran partikel 10 micron. Disuplai oleh

merck jerman7. Larutan pengelusi Ph 6,5. Larutkan 11,88 g disodium hydrogen fosfat dihidrat (Na2

HPO4 . 2H2O) dalam aquades dan encerkan sampai 1 liter. Larutkan 9,08 g potassium dihidrogen fosfat (KH2PO4) dalam air dan encerkan menjadi 1 liter. Campur 150 ml Na2 HPO4 dengan 350 ml larutan KH2PO4, encerkan sampai 1 liter dengan aquades. Kemudian tambahkan 120 ml etanol.

8. Ferisianida basa. Siapkan segar setiap hari. Larutkan 0,5 g potassium ferisianat dalam

50 ml aquades. Larutkan 15 g sodium hidroksida dalam aquades, dinginkan sampai

suhu kamar, dan encerkan sampai 100 ml. campur 24 ml larutan sodium hidroksida, 1

ml potassium ferisianat dan 25 ml aquades.

9. Larutan stok tiamin standar. 500 µg/ml. larutkan 125 mg tiamin hidroklorida dalam

aquades, tambhakan 20 ml asam sulfat 0,25 N dan 2 ml asam trikloro asetat 45%.

Kemudian encerkan sampai 250 ml dalam labu takar dengan air. Simpan dalam

tempat gelap pada 0 – 4 °C

10. Larutan kerja tiamin standar. 4 µg/ml. pipet 2 ml larutkan stok tiamin standar dan

masukkan ke dalam labu takar 250 ml. encerkan sampai tanda tera dengan aquades

PERALATAN• Otoklaf. Dapat menghasilkan uap air bertekanan 15 lb/in 2 atau 2 atm (pada

121 °C)• Penangas air. Dengan suhu 40-50°C dan 50-60 °C• Centrifuge berkecepatan tinggi. Maksimum 300000 x g• Tabung centrifuge. Kapasitas 50 ml• Peralatan untuk HPLC. Bagian bagian yang harus ada antara lain adalah:

1. Pompa bertekanan tinggi2. “sampler” dengan tabung sampel berkapasitas 1,7 ml3. Kolom logam. 12,5 cm x 0,46 cm diameter dalam. Isi kolom (packing) merckosorb

SI 60 dengan ukuran partikel 10 micron.4. Sampel loop 60 µl.5. Detektor fluorimeter dengan sel yang dapat di aliri sampel. Panjang gelombang

eksitasi 366 nm, emisi 464 nm. • Pompa pengatur

CARA KERJA

1. Timbang tepat sejumlah sampel yang mengandung 0,5 g padatan (misalnya apabila kadar

air sampel 80%, timbang 2.50 g) dan masukkan ke dalam tabung centrifuge 50 ml.

2. Tambahkan aquades menggunakan pipet mohr sampai kandungan air total menjadi 2 g

(misalkan sampel mengandung air kurang dari 10% maka aquades yang dibutuhkan adalah 2

ml)

3. Pipet dan masukkan 2 ml larutan kerja tiamin standar kedalam sebuah tabung centrifuge

lainnya (catatan: untuk setiap 5 tabung sampel di perlukan satu tabung standar)

4. Tambahkan kedalam masing masing tabung 10 ml asam sulfat 0,25 N

5. Tutup tabung tabung tersebut dengan menggunakan aluminium foil

6. Panaskan dalam otoklaf pada 121 °C (15 lb/in2 ) selama 30 menit

7. Dinginkan, dan tambahkan 1,5 ml larutan buffer. Kocok sampai Ph nya mencapai 4,6

8. Tambahkan 1 ml suspense takadiastase dan kocok merata.

9. Letakkan tabung dalam penangas air bergoyang pada 40 °C selama 25 menit.

10. Tambahkan 1 ml larutan papain, kocok merata dan lanjutkan pemanasan selama 2 jam

pada 40 -45 °C

11. Tambhakan 2 ml asam trikloro asetat, kocok merata

12. Panaskan tabung selama 5 menit dalam penangas air 50-60°C

13. Centrifuge tabung selama 5 menit pada kecepatan 300.000 x g

14. Injeksikan secara manual 60 µg supernatant kedalam kolom HPLC atau setara otomatis.

jika secara otomatis, isi tempat sampel pada “sampler” sampai penuh.

15. Kromatografikan dengan kecepatan aliran 1 ml per menit dan tambahkan pereaksi

ferisianida bad=sa dengan kecepatan aliran 0,3 ml per menit.

PERHITUNGANTinggi puncak sampel = hTinggi puncak standar = HBerat sampel (g) = WMaka:Kadar tiamin dalam sampel (mg/100mg) sebagai tiamin klorida HCl= (8 x h x 100)/ W x H x 1000 = 0,8 H/W x H

Catatan:1. Periksa setiap batch enzim yang digunakan dengan metode yang

menggunakan kokarboksilase sebagai substrat. Apabila perekasi ini memberikan nilai blanko, koreksi tinggi puncak sampel maupun standar

2. Hindarkan seluruh prosedur kerja dari cahaya UV langsung

Vitamin B2

Metode : manual 1Prinsip : Riboflavin diekstrak dengan menggunakan asam encer panas. Setelah diatur pHnya hingga mencapai 4,5 ekstrak disaring dan dihilangka warnanya menggunakan potasium permanganat dan hidrogen peroksida. Fluorosensi ekstrak yang sudah dihilangkan warnanya diukur menggunakan larutan ditionit sebelum dan sesudah reduksi, perbedaannya merupakan kadar riboflavin didalam sampel.

pereaksi1. Asam klorida 0,2 N. encerkan 18 ml asam klorida (BJ. 1,18) menjadi 1 liter dengan

aquades.2. Asam sulfat 0,1 N. encerkan 28 ml asam sulfat (BJ. 1,84) menjadi 1 liter dengan

aquades3. Asam klorida 1 N. encerkan 80 ml asam klorida (BJ. 1,18) menajdi 1 liter aquades.4. Sodium hidroksida 40%. Larutan 40 gram sodium hidroksida dalam aquades dan

encerkan smapai 100 ml.5. Asam asetat glasial. BJ 1,056. Potasium permanganat 3%. Larutkan 3 gram potasium permanganat dalam akuades

dan diencerkan sampai 100 ml7. Sodium ditionoit. Na2S206. 2H2O padat.8. Larutan stok riboflavin standar, 25 mikrogram/ml. Larutkan 25 miligram riboflavin

dalam 3 ml asam asetat glasial, panaskan apabilaperlu dan encerkan sampai 100 ml dengan aquades. Hindarkan dari sinar matahari langsung.

9. Larutan kerja riboflavin standar, 0,1 mikrogram/ml. encerkan 4 ml larutan stok riboflavin standar menjadi 1 liter dan ahindarkan dari sinar matahari langsung.

Cara kerja

a. Ekstraksi1. Timbangalah sejumlah sampel (jangan lebih dari 5. g, dan perkirakan agar

mengandung riboflavin minimum 10 mikrogram) dan masukan ke dalam labu erlenmeyer.

2. Tambhakan 50 ml asam klorida 0,2 N, kemudian tutup dengan gelas piala terbalik3. Otoklaf sampel pada (121 c) selama 15 menit4. Dinginkan dan tuang kedalam gelas piala 100 ml5. Tambahkan sedikit demi sedikit sodium hidroksida 40% ke dalam ekstrak sambil

diaduk sampai pH-nya mencapai 6,86. Lakukan langkah 5 dengan menggunakan asam klorida 1 N sampai pH ekstrak 4,5.7. Pindahkan ekstrak ke dalam labu takar 100 ml dan encerkan dengan aquades

sampai tanda tera.8. Saring ekstrak melalui kertassaring berporositas cepat. Apanila perlu, encerkan

ekstrak ini sampai mengandung roboflavin kurang lebih 0,1 mikrogram/ml

b. Dekolorisasi Ekstrak1. Pipet ekstrak empat kali masing-masing 10 ml dan

masukkan masing-masing ke dalam empat tabung reaksi 25 ml.

2. Tambahkan masing-masing 2 ml larutan kerja riboflavin standar ke dalam tabung.

3. Tambahkan maisng-masing 2 ml aquades ke dalam kedua tabung yang lain.

4. Tambahkan 1 ml asam asetat glasial ke dalam masing-masing tabung dan kocok.

5. Tambahkan 0,5 ml potasium permanganat 3% dan kocok.6. Dua menit kemudain tambahkan 0,5 ml hidrogen

peroksida 3% dan campur.7. Lakukan pengukuran fluoresensi secepat mungkin.

Pengukuran Fluoresensi

1. Atur Fluorometer hingga memberi angka 0 terhadap asam sulfat 0,1 N dan atur 100 terhadap sampel + standar pada panjang gelombang 525 nm.

2. Ukur masing-masing fluoresensi dari keempat tabung diatas.

3. Kemudian tambahkan 20 miligram sodium ditionit kedalm masing-masing tabung dan kocok. Ukur blanko tidak lebih dari 10 detik sesudah pencampuran ( blanko dala hal ini ialah tabung reaksi yang terdiri sampel saja dan yang terdiri sampel + standar).

perhitunganMisalkan . Berat sampel (g) = W

volume ekstrak = 100Alikuot yang didekolorisasi (ml) = 10Pembacaan sampel+standar = Tpembacaan sampel = Spembacaan blanko sampel = Sbpembacaan sampel+blanko standar= Tb

Maka, : Flouresensi sampel+standar = T –Tb Flouresensi sampel = S – Sb Flouresensi standar (0,2 mikrogram) = (T – Tb) – ( S – Sb)

Dan, : kadar riboflavin dalam sampel (mg/100g) =(S – Sb ) x 0,2

(T – Tb) – (S – Sb) W

Metode : HPLC

Prinsip : vitamin B2 diekstrak dari makanan dengan hidrolisa asam. Perlakuan dengan papain dilakukan untuk menghilangkan senyawa pengganggu analisis berupa protein. Sedangkan perlakuan dengan diastase dilakukan untuk membebaskan vitamin dari bentuk fosfatnya. Filtrat jernih yang didapat kemudian dielusi pada kolom HPLC dan vitamin B2 kemudian diukur langsung dengan fluorometer.

Pereaksi1. Asam sulfat 0,25 N. Encerkan 7 ml asam sulfat (BJ, 1,84) menjadi 1 liter dengan aquades.2. Larutan buffer. Larutkan 160 gram sodium hidroksida dalam aquades dan encerkan sampai

500 ml. larutkan 272 gram asam asetat glasial(BJ. 1,04) dalam aquades dan encerkan 500 ml. campur merata larutan tersebut dalam jumlah yang sama.

3. Takadiastase. Siapkan suatu suspensi yang mengandung 100 miligram diastase per ml.4. Papain 12.000 E gram. Siapkan suatu suspensi yang engandung 100 mg papain per ml.5. Asam trikloro asetat. Larutkan 45 gram asam trikloro asetat dalam aquades dan encerkan

sampai 100 ml.6. Merckosorb SI 60. silika gel untuk HPLC , ukuran partikel 10 mikron. 7. Larutan pengelusi pH 4.6. larutan 27,2 gram sodium asetat trihidrat (CH3COONa.3H2O)

dalam akuades dan encerkan menjadi 1 liter. Larutkan 12 gram asam asetat dalam air dan encerakan menjadi 1 liter. Campurkan kedua larutan tersebut dalam jumlah yang sama dan encerkan lima kali.

8. Larutkan stok riboflavin standar, 1,5 mikrogram/ml. Timbang 15.0 mg riboflavin dan masukkan ke dalam labu takar 500 ml yang berisi 300 ml akuades hangat. Tambahkan 40 ml asam sulfat 0,25 N dan 4 ml asam trikloroasetat 45%. Kocok sampai semua riboflavin larut dan encerkan sampai 500 ml dengan akuades. Simpan dalam tempat gelap pada suhu 0-4 derajar celcius

9. Larutan kerjan riboflavin standar. 1,5 mikrogram/ml . Pipet dan masukan ke dalam labu takar 200 ml sebanyak 10 ml larutan stok riboflavin standar. Encerkan sampai tanda tera dengan aquades.

Cara kerja

1. Timbang tepat sejumlah sampel yang mengandung 0.5 gram padatan (misalnya apabila kadar air sampai 80%, timbang 2.50 gram) dan masukan ke dalam tabung sentrifus.

2. Tambahkan akuades menggunakan pipet Mohr sampai jumlah air total mejadi 2 gram.( misalkan sampel mengandung air kurang dari 10% maka akuades yang dibutuhkan adlah 2 ml).

3. Pipet dan masukan 2 ml larutan kerja riboflavin standar ke dalam tabung sentrifus lainnya ( catatn: untuk setiap 5 tabung sampel diperlukan satu tabung standar:

4. Tambahkan ke dalam tabung masing-masing 10 ml asam sulfat.5. Tutup tabung-tabung tersebut dengan aluminium foil.6. Panaskan dalam otoklaf pada 121 derajat selama 30 menit.7. Dinginkan, dan tambahkan 1,5 ml larutan buffer. Kocok sampai pH-nya mencapai 4.6

Lanjutaan …

1. Tambahkan 1 ml takadiastase dan kocok merata.2. Letakkan tabung penangas air bergoyang pada 40-45 derajat

selama 25 menit3. Tambahkan 1 ml papain. Kocok merata, dan lanjutkan pemanasan

selama 2 jam pada 40-45 derajat4. Tambahkan 2 ml asam trikloro asetat kocok merata5. Panaskan tabung selama 5 menit dalam penangas air 50-60

derajat6. Sentrifus tabung selama 5 menit pada kecepatan 30.000 x gram7. Injeksikan secara manual 60 mikrogram supernatan atau secara

otomatis ke dalam kolom HPLC8. Ukur tinggi puncak untuk sampel dan standar pada kromatogram

perhitungan

Misalkan , tinggi puncak sampel = htinggi puncak standar = Hberat sampel (g) = W

Maka, kadar riboflavin dalam sampel (mg/100g)= (3/W) X (h/H) X ( 100/1000)= 0,3H/W x H

Terima kasih