LAPORAN PRAKTIKUMKULTUR JARINGAN TANAMANACARA IIIPENANAMAN EKSPLAN

Oleh:Hilman ArifinNIM A1L011045

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS PERTANIANPURWOKERTO2012

I. PENDAHULUANA. Latar belakangBahan tanam (eksplan) dalam kultur jaringan merupakan bagian tanaman yang mungkin bila ditanam secara konvensional tidak akan tumbuh sempurna. Kultur jaringan mengupayakan agar eksplan tersebut dapat tumbuh menjadi tanaman yang sempurna dengan ketepatan media, kondisi lingkungan dan keaseptisan. Bahan tanam tersebut tumbuh dalam keadaan invitro, semua kebutuhan hidupnya disediakan dan diatur sedemikian rupa hingga tumbuhnya sesuai dengan yang diinginkan.Kultur jaringan sangat mengutamakan keaseptisan dalam segala bagian. Termasuk eksplan yang akan ditanam, karena eksplan ini termasuk salah satu sumber kontaminan. Sterilisasi eksplan ada beberapa cara, tergantung oleh pada jenis eksplan yang digunakan.eksplan yang bertekstur kuat seperti umbi biasanya dilakukan pembakaran (flamir). Adapun eksplan yang bertekstur lembut seperti daun muda dilakukan perendaman dengan alkohol, sublimat atau chlorox.Penanaman merupakan tahap yang vital dalam kultur jaringan, keaspetisan pada semua bagian harus dijaga. Sipenanam, ruangan ,ruang penabur, peralatan dan eksplan harus dijaga keaseptisannya. Dalam penanaman harus berhati-hati, karena berhubungan dengan alat-alat yang berbahaya seperti bahan yang mudah terbakar, lampu UV dan bahan kimia yang bersifat keras.Sterilisasi eksplan dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu sterilisasi secara mekanis dan sterilisasi secara kimiawi. Sterilisasi secara mekanis dilakukan pada eksplan yang keras dan berdaging dengan cara dibakar di atas nyala api bunsen sebanyak tiga kali ulangan. Sedangkan sterilisasi eksplan secara kimiawi dilakukan dengan menggunakan bahan kimiawi seperti alkohol 70 %, sublimat, dan clorox yang dapat mematikan bakteri dan mikroorganisme yang dapat menyebabkan kontaminasi eksplan. Oleh karena itu demi keberhasilan kultur jaringan maka ruang penanaman dan eksplan juga perlu disterilisasi untuk mendapatkan kondisi yang aseptis.B. Tujuan1. Mengetahui dan mempraktikan cara menanam eksplan dan subkultur2. Mengamati pertumbuhan eksplan3. Mencari faktor-faktor penyebab kegagalan di dalam kultur jaringan tanaman.

II. METODE PELAKSANAANA. Waktu Praktikum penanaman eksplan dilakukan pada tanggal 1 Desember 2012B. TempatPraktikum dilakukan di Laboratorium AgronomiC. Bahan dan alat Eksplan (kedelai, kentang atlantis dan nilam). Aquades. Media tanam. Larutan alkohol. Spiritus. Scalpel dan blade Masker LAF AC (Air Conditioner) Petridish Pinset Sprayer Pembakar Bunsen Botol kultur Tissue Label Plastik Korek api Rak kulturD. Prosedur kerja1. Sterilisasi Ruang Dan Tempat penanaman Ruangan kultur dan LAF di semprot dengan larutan alcohol 90% 30 menit sebelum penanaman. Lampu UV dinyalakan 30 menit sebelum penanaman dan dimatikan saat penanaman. Blower dinyalakan setelah lampu UV dimatikan.2. Penyiapan eksplan Umbi bawang putih diambil secukupnya, lalu dibersihkan dengan sabun dan dicuci sampai bersih. Umbi bawang putih tersebut dimasukkan kedalam botol steril dan disterilisasi (dalam LAF) dengan Clorox selama 3 menit sambil digojog-gojog . Umbi bawang putih kemudian direndam alkohol selama 0,5-1 menit sambil digojog, kemudian alkohol dibuang. Setelah itu dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali sambil digojog-gojog. Setelah bersih, umbi bawang putih diambil dengan pinset dan dikeringkan di atas kertas tissue di dalam cawan petri steril untuk menghilangkan sisa air yang menempel di umbi bawang putih. Umbi bawang putih diiris menggunakan skalpel steril. Bagian Umbi bawang putih dipotong-potong sebesar 1x1x1 cm sebagai eksplan dan siap tanam di atas media.3. Penanaman eksplan Botol kultur yang berisi media diambil dari rak kultur. Sebelum masuk LAF botol disemprot dengan alkohol 70%. Tutup botol (alumunium foil) dibuka, diletakkan di sebelah kanan. Mulut botol diflamir di atas api bunsen. Eksplan diambil dengan pinset, kemudian dimasukkan ke dalam botol kultur yang berisi media, sambil mulut botol diflamir di atas api bunsen. Setelah eksplan ditanam, mulut botol ditutup kembali dengan alumunium foil dan diseal. Diberi label tanggal penanaman, nama dan NIM praktikan. Botol kultur yang sudah ditanami dan diberi label disimpan di ruang inkubasi. Dilakukan pengamatan dua hari sekali selama dua minggu.

III. PEMBAHASANPenanaman merupakan proses yang sangat menentukan bagi pertumbuhan eksplan, dalam proses ini harus benar-benar steril baik penanam, alat, eksplan, ruangan dan media. Penanaman dilaksanakan didalam laminar air flow cabinet, suatu alat berbentuk box yang dilengkapi blower dan ada yang dilengkapi lampu UV. Selain sebagai ruang penanaman alat ini juga berfungsi sebagai tempat persiapan bahan tanaman dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke botol yang lain (sub kultur). Prinsip kerja alat ini adalah dengan bentuk box tertutup, maka keadaan didalam diharapkan lebih steril daripada lingkungan luar dan dengan adanya blower yang menghembuskan udara steril dan lampu U.V untuk mematikan mikroba sehingga tercipta lingkungan aseptis.Praktikum pada acara penanaman eksplan kali ini adalah penanaman eksplan bawang putih. Praktikum kultur jaringan ini dilakukan di dalam laboratorium kultur jaringan. Laboraturium kultur jaringan harus dalam kondisi steril. Ruangan dalam laboratorium tersebut dibagi menjadi dua, yaitu ruang penanaman media dan ruang inkubasi. Agar diperoleh ruangan yang aseptis maka dilakukan sterilisasi ruangan, tujuannya untuk menghindari kontaminasi oleh mikroorganisme atau bakteri. Mikroorganisme tersebut bisa terdapat pada dinding laboratorium, lantai maupun berterbangan di udara dalam laboratorium tersebut. Sterilisasi ruang dilakukan dengan menggunakan lampu UV dan alkohol 90%. Sterilisasi menggunakan alkohol dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol tersebut dengan menggunakan sprayer ke udara di dalam laboratorium. Lampu UV di nyalakan minimal 30 menit sebelum pelaksanaan praktikum dimulai dan dimatikan saat praktikum dimulai agar radiasi dari UV tersebut tidak mengenai praktikan.Laminar air flow cabinet yang tidak dilengkapi dengan lampu U.V, blower harus dijalankan terus menerus walaupun laminar air flow cabinet tersebut sedang tidak dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja didalam laminar air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan lampu U.V, dianjurkan agar menyalakan lampu U.V. minimum 30 menit sebelum laminar air flow digunakan. Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu U.V. harus dimatikan, sedangkan blower dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu U.V., hanya dijalankan pada saat laminar air flow sedang digunakan.Laminar Air Flow Cabinet meniupkan udara steril melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari, debu dan spora-spora yang mungkin jatuh kedalam media, waktu pelaksanaan penanaman. Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama, yang kemudian ditiupkan keluar melalui filter yang sangat halus dengan menggunakan blower. Adapun spesifikasi masing-masing filter pada LAF adalah :1. Filter pertama (Pre-filter), yang menggunakan saringan pertama terhadap debu-debu dan benda-benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5 m sehingga efisiensinya dapat mencapai 95 m untuk objek-objek yang 5 m.1. Filter halus, (HEPA) filter dengan pori-pori 0.3 m dan terdapat pada bidang keluar udara kearah permukaan tempat kerja.Pre-filter harus sering dibersihkan dengan vacum cleaner dan sebaiknya diganti 1 tahun sekali. Namun HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan dengan particulate count atau dengan alat yang disebut magnehelic gauge.Adapun cara penggunaan laminar air flow cabinet yang dilengkapi lampu U.V adalah sebagai berikut :1. Nyalakan lampu U.V., minimum selama 30 menit, sebelum laminar air flow digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.1. Siapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan. Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet, disemprot terlebih dahulu dengan alcohol 70% atau spiritus.1. Meja dan dinding dalam LAF disemprot dengan alkohol 70% atau spiritus untuk mensterilkan LAF.1. Blower pada LAF dihidupkan untuk menjalankan air flow.1. Nyalakan lampu dalam LAF.1. LAF sudah siap untuk digunakan.Hal-hal yang perlu diperhatikan ketika menggunakan laminar air flow cabinet adalah :1. Jangan mendekatkan tangan yang baru disemprot alkohol atau spiritus ke bunsen.1. Jangan menumpuk alat-alat, botol-botol media, dan lain-lain benda di depan tempat bekerja sehingga menghalangi aliran udara.1. Jangan meletakkan lampu bunsen terlalu dekat dengan filter dan alkohol untuk merendam peralatan kultur.1. Jangan mencelupkan alat tanam dengan nyala api ke dalam alkohol (nyala api alkohol yang terdapat pada alat tanam, tidak terlihat dengan jelas di tempat yang terang).1. Bersihkan Laminar Air Flow Cabinet, setelah selesai bekerja. Jangan meninggalkan botol bekas, kapas bekas, dan sebagainya di dalam LAF.

Persiapan eksplan umbi bawang putih yaitu meliputi beberapa tahapan Umbi bawang putih dicuci dan dibilas sampai bersih menggunakan air lalu dikupas kulitnya. Disterilisasi secara kimiawi menggunakan larutan sebagai berikut :a. FungisidaDilakukan beberapa saat setelah bawang putih dikupas untuk membunuh mikroorganisme yang ada atau menempel pada umbi bawang putih tersebut. Kemudian dimasukkan ke dalam aquades, dikocok untuk membersihkan sisa bahan fungisida.b. Clorox atau Sodium hipokhlorit. Konsentrasi untuk sterilisasi tergantung dari kelunakan eksplan antara 5%-10% dengan waktu 3 menit. Kemudian dimasukkan ke dalam aquades, dikocok untuk membersihkan sisa bahan Clorox.c. AlkoholAlkohol 95 % dituangkan sebanyak 25 ml ke dalam gelas ukur, kemudian ditambahkan aquades sebanyak 70 ml, sehingga volume menjadi 95 ml. Kemudian dibersihkan dengan aquades sebanyak 3 kali.Dari ketiga bahan kimia tersebut, perlakuan sterilisasinya biasanya dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Untuk perlakuan sterilisasi di luar laminar air flow cabinet biasanya menggunakan fungisida dan bakterisida (Hendaryono dan Wijayani, 1994)Fungsi dari larutan diatas adalah untuk mensterilisasi media dan mematikan bakteri, jamur atau mikroorganisme lainnya yang bisa menyebabkan kontaminasi pasa eksplan maupun media kultur jaringan.Penanaman eksplan dilakukan di dalam LAF yang sebelumnya sudah disetrilisasi terlebih dahulu, pada saat melakukan penanaman harus dihindari jangan sampai tangan lalu lalang di atas eksplan steril yang akan ditanam atau yang telah berada di atas media yang terbuka. Kemudian alat-alat dan lampu diletakkan agak di sebelah kiri dan lampu spirtus jangan diletakkan dekat dengan alkohol. Kemudian pinset dan skalpel sebelum digunakan harus diflamir terlebih dahulu dengan cara dicelupkan ke dalam alkohol 96% lalu dibakar sampai api mati sendiri, didinginkan dan kemudian dapat digunakan. Kemudian media tumbuh disiapkan, aluminium foil dibuka dengan hati-hati dan diletakkan di sebelah kanan. Botol dipegang dengan tangan kiri dan dalam keadaan miring, mulut botol diflamir di atas lampu spirtus. Ketika membakar mulut botol sebaiknya botol diputar dengan titik tengah lingkarannya sebagai poros agar seluruh mulut terkena secara merata dan pemutaran dilakukan dengan hati-hati dan perlahan. Kemudian eksplan diambil dengan menggunakan pinset steril yang sudah dingin, dan dimasukkan ke dalam media. Setelah itu sebelum botol ditutup, mulut botol dan bagian dalam tutupnya diflamir kembali dan botol ditutup rapat dan diikat dengan karet gelang dan diberi label. Botol-botol kultur dikeluarkan dari LAF. Botol bekas dan bahan yang tidak terpakai dikeluarkan dan dibuang. LAF dibersihkan dengan cara menyemprot alkohol 96% dan dilapmenggunakan kain lap steril. Setelah dilakukan penanaman pengamatan dilakukan setiap 2 hari sekali selama 14 hari dan jika ada tanaman yang terkontaminasi pengamatan dihentikan.Berdasarkan pengamatan yang dilakukan pada hari kedua yaitu senin, 3 Desember eksplan menunjukkan beberapa ciri, yaitu pada eksplan I tumbuh eksplan masih normal, warna eksplan kuning, warna media bening dan tidak menunjukkan adanya tanda-tanda terkontaminasi pada media maupun eksplan.Namun, pada minggu kedua, yaitu Selasa, 11 Desember 2012, eksplan menunjukkan beberapa perubahan, yaitu tumbuhnya kalus pada eksplan I, warna eksplan kuning, warna media bening, dan masih tumbuh normal, akan tetapi pada eksplan III tanaman eksplan mengalami kontaminasi oleh bakteri, yaitu munculnya lender berwarna putih pada media jika botol kultur dimiringkan dan eksplan juga memilika tekstur yang berlendir. Pengamatan dilakukan hingga Senin, 17 Desember 2012 dan hanya eksplan I dan II yang tumbuh akan tetapi masih belum tumbuh tunas pada eksplan II. Berikut adalah gambar yang diambil berdasarkan hasil pengamatan selama 2 minggu:

Eksplan IEksplan II Eksplan III(terkontaminasi)

Penyebab terjadinya kontaminasi pada kultur jaringan diantaranya :1. Sterilisasi tidak sempurnaKesalahan dalam sterilisasi bisa menyebabkan kontaminasi baik pada tahap sterilisasi alat, media maupun eksplan. Karena kultur jaringan seharusnya dilakukan pada kondisi yang steril dan keaadaan aseptis.2. Praktikan tidak sterilSaat sterilisasi praktikan tidak benar, penyemprotan alcohol tidak merata bisa menyebabkan kontaminasi saat melakukan penanaman.3. Banyak bicaraKarbondioksida yang keluar dari mulut merupakan sumber kontaminasi, kemungkinan saat penanaman eksplan praktikan bicara terlalu banyak sehingga menyebabkan kontaminasi pada media kultur jaringan.4. Penutupan botol kurang rapatKeahlian masing-masing praktikan dalam pelaksanaan kultur jaringan sangat mempengaruhi, karena jika botol kurang rapat penutupan dengan plastic wrap bisa menyebabakan mikroba masuk sehingga media terkontaminasi.Hal-hal untuk mencegah tejadinya kontaminasi dalam penanaman dapat diperhatikan beberapa hal diantaranya adalah:1. Penanam bersih dan steril, tidak sedang mengalami flu2. Sterilisasi eksplan harus tepat dan alat juga steril3. Eksplan yang digunakan sehat dan normal4. Penanaman eksplan tepat posisinya5. Pada saat menanam tidak banyak berbicara6. Penggunaan alat dan bahan sesuai prosedur

IV. PENUTUPA. KesimpulanBerdasarkan pembahasan diatas dapat diketahui, bahwa Laminar Air Flow adalah alat sterilisasi yang menggunakan prinsip filtrasi udara dan penggunaan radiasi ultraviolet. Sterilisasi dapat dilakukan secara mekanis atau kimiawi. Berdasarkan penyebabnya, kontaminasi ekplan dibagi menjadi dua, yaitu kontaminasi oleh jamur dan bakteri Botol ke-1 dan ke-2 tidak terjadi kontaminasi, ekplan baik, media baik, namun belum tumbuh. Botol ke-3 terjadi kontaminasi oleh bakteri pada hari pengamatan kelima.

DAFTAR PUSTAKAMariska Ika, 2002. Perkembangan Penelitian KulturIn Vitro pada Tanaman Industri, Pangan, dan Hortikultura. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. VOL 5, NO. 2Rahardja, P. C. 1995. Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Penerbit Swadaya, Jakarta.Soeryowinoto, M. 1985. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.Suryowinoto, M. J., 1996. Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro. Penerbit Kanisius, Jakarta.Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta.Widarto, L. 2000. Perbanyakan Tanaman dengan Biji, Stek, Cangkok, Sambung, Okulasi dan Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta.